三七破壁飲片質(zhì)量分析

梁 笑，徐國兵,2，錢珊珊，桂雙英,4,5，王舉濤，葛 鼎，劇夢真，鮑炳娟

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽 合肥 230051；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部，安徽 合肥 230061；4.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院藥物制劑研究所，安徽 合肥 230012；5.安徽道地中藥材品質(zhì)提升協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽 合肥 230012)

三七為五加科植物三七[Panaxnotoginseng(Burk.)F. H. Chen]的干燥根和根莖，具有散瘀止血、消腫定痛等功效，主治咳血、吐血、衄血、便血、崩漏、外傷出血、胸腹刺痛、跌撲腫痛[1]。其始載于《本草綱目》，其卷三(上)中記載將三七與米泔同服可治吐衄[2]，明醫(yī)書《證治準繩》中記載將三七曬干取粉同槐枝、血竭等入藥可治療跌傷[3]。在現(xiàn)代中醫(yī)臨床中，三七可煎湯、研末或入丸(散)內(nèi)服，亦可研末、磨汁外用。與傳統(tǒng)研磨而成的三七粉相比，三七破壁飲片是運用超微粉碎技術(shù)將傳統(tǒng)三七飲片進行細胞級粉碎并制粒而成的一種新型中藥飲片，在使用上可不必煎煮直接沖泡服用，配伍靈活，應(yīng)用便捷。其在保留傳統(tǒng)飲片中所有成分的同時，又提高了有效成分的溶出速度和溶出度。本研究開展三七破壁飲片的質(zhì)量研究，為三七破壁飲片質(zhì)量標準的建立提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀，配備四元泵、自動進樣器及可變波長檢測器；電子天平(PA1004B)：上海精科天美；Varian cary50紫外可見分光光度計：美國VARIAN公司；BT-9300H激光粒度儀：江蘇省丹東市百特儀器有限公司；暗箱式薄層色譜攝影儀GoodSee-Ⅱ：上?？普苌萍加邢薰荆还鈱W(xué)顯微鏡(NIKON E100)：北京泰克儀器有限公司；原子吸收分光光度計(A3AFG-12)：北京普析通用儀器有限責任公司；微波消解儀(MD6H)：奧普勒儀器有限公司。

1.2 材料 三七破壁飲片(三七破壁粉碎后，經(jīng)乙醇粘合制粒，批號 170801-170810)：安徽亳州宏信藥業(yè)提供；三七對照藥材(批號 120941201108)、人參皂苷Rb1(純度 95.0%，批號 110704201625)、三七皂苷R1(純度 95.0%，批號 110745201619)、人參皂苷Rg1(純度 91.7%，批號 110703201530)、人參皂苷Re(純度 97.4%，批號 110754201626)：中國食品藥品檢定研究院；甲醇(色譜純，≥99.9%，批號 Me-12760216)、乙腈(色譜純，≥99.9%，批號 AC-12960217)：OCEANPAK；三氯甲烷(分析純)：天津精強化工有限公司；乙酸乙酯(分析純)：江蘇省無錫市利宏化工產(chǎn)品有限公司；鉛[100 μg/mL，批號GBW(E)080129]、鎘[100 μg/mL，批號GBW(E)080119]、砷[100 μg/mL，批號GBW(E)080117]、汞[100 μg/mL，批號GBW(E)080124]、銅[100 μg/mL，批號GBW(E)080122)]：中國計量科學(xué)研究院；超純水：由Millipore公司Milli-Q超純水系統(tǒng)制備；Merck硅膠預(yù)制薄層板(Si-60，批號 HC43300156)：默克化工技術(shù)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀考察 灰褐色至灰黃色的顆粒，氣微，味苦回甜。

2.2 顯微鑒別 參考文獻[4-5]方法進行顯微鑒別：取本品粉末適量，加水合氯醛裝片，必要時加熱透化。顯微鏡下可見淀粉粒甚多，單粒圓形、半圓形或圓多角形，直徑4～30 μm；樹脂道碎片含黃色分泌物；導(dǎo)管碎片較少見。見圖1。

圖1三七破壁飲片顯微結(jié)構(gòu)(10×40倍；A.樹脂道；B.導(dǎo)管；C.淀粉粒)

2.3 薄層色譜鑒別 取三七破壁飲片0.5 g，按2015年版《中華人民共和國藥典》一部三七藥材鑒別項下方法，制備供試品溶液和對照品溶液，加水5滴，攪勻，再加水飽和的正丁醇5 mL，密塞，振搖10 min，放置2 h，離心，取上清液，加3倍量正丁醇飽和的水，搖勻，放置使分層(必要時離心)，取正丁醇層，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取人參皂苷Rb1對照品、人參皂苷Re對照品、人參皂苷Rg1對照品及三七皂苷R1對照品，加甲醇制成0.5 mg/mL的混合溶液，作為對照品溶液。按照薄層色譜法(2015年版《中華人民共和國藥典》四部通則0502方法)試驗，吸取上述兩種溶液各1 μL，分別點于同一塊Merck硅膠預(yù)制薄層板(Si-60)上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)10 ℃以下放置的下層溶液為展開劑，上行展開17 cm，取出，晾干，噴以硫酸乙醇溶液(1→10)，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點；置紫外光燈(365 nm)下檢視，顯相同的熒光斑點。10批樣品按本法檢驗，均符合規(guī)定，且色譜分離效果好，斑點清晰，比移值適中，重復(fù)性好。薄層鑒別圖見圖2。

2.4 指紋圖譜鑒別

2.4.1 色譜條件 按照文獻[6-8]方法設(shè)定色譜條件。采用太瑋科技JADE-PAK RS-C18Ⅱ色譜柱(250×4.6mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(0～10 min，10% A，90% B；10～20 min，10%～25% A，90%～75% B；20～35 min，25%～37% A，75%～63% B；35～45 min，37%～45% A，63%～55% B；45～50 min，45%～75% A，55%～25% B)，流速為1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長203 nm，進樣量10 μL。

2.4.2 供試品溶液制備 取供試品0.5 g加入色譜甲醇25 mL，超聲(40 kHz，200 W)提取0.5 h，過濾，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加色譜級甲醇定容，即得。

注：a、b、c、d、e分別代表批號170801、170802、170803、170804、170805的三七破壁飲片，f代表三七混合對照品(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分別為人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、三七皂苷R1、人參皂苷Rb1)，g代表三七對照藥材，h、i、j、k、l分別代表批號170806、170807、170808、170809、170810的三七破壁飲片；左圖為日光下薄層色譜圖，右圖為紫外光(365 nm)下薄層色譜圖

圖210批樣品的薄層色譜圖

2.4.3 對照藥材溶液與對照品溶液制備 取三七對照藥材粉末(過四號篩)0.5 g，依供試品溶液制備方法制備對照藥材溶液，另取人參皂苷Rb1對照品、三七皂苷R1對照品、人參皂苷Rg1對照品，分別制成人參皂苷Rg1 0.4 mg/mL、三七皂苷R1 0.1 mg/mL、人參皂苷Rb1 0.4 mg/mL的對照品溶液。

2.4.4 空白實驗 精密吸取空白甲醇溶液10 μL，在“2.4.1”項下色譜條件進樣，溶劑峰很小且于5 min前出峰，表明空白溶劑對本實驗無干擾。

2.4.5 精密度試驗 按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液，連續(xù)進樣7次，記錄色譜圖。以三七皂苷R1為參照峰(S)，各主要色譜峰的相對峰面積及相對保留時間的RSD均小于4%，表明儀器精密度良好。

2.4.6 樣品溶液穩(wěn)定性 按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10 h進樣，記錄色譜圖，以三七皂苷R1為參照峰(S)，考察各共有色譜峰的相對保留時間及相對峰面積RSD的一致性。結(jié)果表明，各共有色譜峰相對保留時間及相對峰面積的RSD均小于0.2 %，表明各主要色譜峰相對保留時間和相對峰面積無明顯變化，供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.7 重復(fù)性考察 取同一批供試品6份，按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液，進樣10 μL，記錄色譜圖，以三七皂苷R1為參照峰(S)，結(jié)果表明，6次重復(fù)試驗的主要色譜峰面積及保留時間的RSD均小于5%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.8 10批樣品指紋圖譜 取三七對照藥材與三七破壁飲片(批號為170801-170810)，分別制備樣品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件進樣10 μL，記錄色譜圖，將色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)，以三七對照藥材為參照圖譜(R)，采用中位數(shù)法生成對照圖譜后進行自動匹配，分析色譜圖相似度。結(jié)果表明各批三七破壁飲片與三七對照藥材相似度分別為0.990、0.986、0.994、0.928、0.931、0.960、0.947、0.996、0.879、0.994。見圖3。

注：自下而上依次為對照藥材(R)，批號依次為170801、170802、170803、170804、170805、170806、170807、170808、170809、170810的三七破壁飲片，S為參照峰三七皂苷R1

圖310批三七破壁飲片樣品指紋圖譜

2.5 重金屬測定 取三七破壁飲片0.5 g，按照2015年版《中華人民共和國藥典》四部通則2321之鉛、鎘、砷、汞、銅測定法制備供試品溶液和標準品溶液，參考2015年版《中華人民共和國藥典》四部通則0406原子吸收分光光度法以標準曲線法定量分析。因2015年版《中華人民共和國藥典》(一部)三七藥材項下無重金屬檢查項，參考西洋參項下重金屬檢查限度，三七破壁飲片重金屬檢查結(jié)果均符合規(guī)定，故不列入標準。見表1。

表1 三七破壁飲片樣品重金屬測定結(jié)果

2.6 未破壁細胞限度 稱取供試品0.010 g，加入水合氯醛試液-水(1∶1)0.5 mL，超聲處理至完全溶散，吸取所有溶液裝片，每片以不溢出、無氣泡、顆粒分布均勻為度，在100倍顯微鏡下檢視，對直徑大于100 μm且完整的細胞進行計數(shù)(如多個完整的細胞連成一片，且整片也超過100 μm者，以整片為一個進行計算)，10批樣品的未破壁細胞數(shù)分別為53、62、55、74、59、61、52、66、81、46，顯示每0.010 g三七破壁飲片未破壁細胞數(shù)均未超過100個。

2.7 粒徑分布檢查

2.7.1 遮光率對粒徑測定的影響 以50%乙醇為分散介質(zhì)，加入三七破壁飲片(批號 170801)，打開超聲分散裝置，待儀器讀數(shù)穩(wěn)定后記錄遮光率與粒徑分布D90值。結(jié)果表明，遮光率隨加樣量增加而增加，遮光率在10%～20%時粒徑測量結(jié)果最優(yōu)，因此以遮光率10%～20%作為三七破壁飲片粒徑分布測定范圍。見表2。

表2 遮光率對三七破壁飲片粒徑分布D90值的影響

2.7.2 分散介質(zhì)選擇 取適量三七破壁飲片(批號 170802)樣品，分別以純化水、50%乙醇、100%乙醇為分散介質(zhì)，加入樣品池中，使遮光率為10%～20%，打開超聲分散裝置，待儀器讀數(shù)穩(wěn)定后記錄結(jié)果，以D90值作為反映粒徑分布均勻性的指標，三七破壁飲片在純化水中粒徑為38.26 μm，在50%乙醇中粒徑為28.81 μm，純乙醇中粒徑為55.77 μm。結(jié)果表明，不同分散介質(zhì)對粒徑測定有一定影響，考慮到產(chǎn)品使用特性選擇水作為分散介質(zhì)。

2.7.3 三七破壁飲片樣品粒徑分布檢查 取10批樣品，以純化水為分散介質(zhì)，加入樣品池中，使遮光率為10%～20%，打開超聲分散裝置，待儀器讀數(shù)穩(wěn)定后記錄粒徑分布D90值，結(jié)果分別為38.03、34.09、35.33、36.23、36.21、38.93、36.23、33.89、34.19、34.94 μm，平均值為35.81 μm。

2.8 含量測定

2.8.1 對照品溶液的制備 取人參皂苷Rg1對照品、三七皂苷R1對照品、人參皂苷Rb1對照品適量，精密稱定，加甲醇制成含人參皂苷Rg1 3 924.8 μg/mL、三七皂苷R1 1 206.5 μg/mL、人參皂苷Rb1 4 009.0 μg/mL的混合對照品溶液。

2.8.2 供試品溶液的制備 取樣品約0.6 g，精密稱定，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，放置過夜，置80 ℃水浴上保持微沸2 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.8.3 色譜條件 按照文獻[9-12]方法設(shè)定色譜條件。色譜柱：太瑋科技JADE-PAK RS-C18Ⅱ色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-超純水(B)；梯度洗脫(0～12 min，19%乙腈；12～60 min，19%～36%乙腈)；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：203 nm；進樣量：10 μL。

2.8.4 系統(tǒng)適用性試驗 精密吸取供試品溶液、對照品溶液、空白甲醇各10 μL，注入液相色譜儀中，按“2.8.3”項下色譜條件進行分析，記錄色譜圖，見圖4。結(jié)果表明各物質(zhì)的分離度、理論塔板數(shù)、靈敏度與拖尾因子均達到要求。另精密吸取對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣5次，記錄色譜峰峰面積，各色譜峰峰面積RSD值均小于1.5%，結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。

注： 1. 三七皂苷R1；2.人參皂苷Rg1；3.人參皂苷Rb1

圖4空白溶劑(A)、對照品溶液(B)、供試品溶液(C)的高效液相色譜圖

2.8.5 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.8.1”項下混合對照品溶液0.1、0.2、0.5、1、2、10 mL，置10 mL量瓶中，甲醇定容，搖勻。進樣量10 μL，按“2.8.3”項下色譜條件進行分析，測定峰面積，計算回歸曲線與方程。人參皂苷Rg1：A=3.634 9c-107.9，r=0.999 6；三七皂苷R1：A=3.269 4c-31.931，r=0.999 5；人參皂苷Rb1：A=2.537 4c-88.414，r=0.999 5。結(jié)果表明人參皂苷Rg1在0.392 5～392.5 μg，三七皂苷R1在0.120 7～120.7 μg，人參皂苷Rb1在0.400 9～400.9 μg范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好。

2.8.6 10批樣品含量測定 取10批樣品，按“2.8.2”項下方法制備樣品溶液，并測定3種皂苷的含量(計算時已將對照品純度納入其中)，見表3。

3 討論

3.1 質(zhì)量控制指標 10批樣品水分含量平均值為7.96%，總灰分含量平均值為3.08%，酸不溶灰分含量平均值為1.01%，未破壁細胞數(shù)平均值為60.9，粒徑平均值為35.81 μm，按不高于平均量的20%制定標準。甲醇浸出物平均值為23.68%，10批三七破壁飲片指紋圖譜相似度平均值為0.961，3種皂苷含量總和平均值為7.59%，按不低于平均量的80%制定標準。根據(jù)上述數(shù)據(jù)以及參考2015年版《中華人民共和國藥典》三七項下含量測定標準，將本品水分擬定為不得過9.5%，總灰分擬定為不得過4%，酸不溶性灰分擬定為不得過1.5%，浸出物含量擬定為不少于19.0%。擬定在100倍顯微鏡下檢視時，直徑大于100 μm且完整的細胞數(shù)不得超過100個。三七指紋圖譜鑒別樣品與對照藥材相似度不得小于0.8。粒徑不得大于45.0 μm。擬定人參皂苷Rg1、三七皂苷R1、人參皂苷Rb1含量之和不得低于6.0%。

表3 三七破壁飲片樣品含量測定結(jié)果

3.2 薄層色譜的耐用性考察 實驗中針對自制板和預(yù)制板的展開效果進行考察，結(jié)果顯示自制硅膠G板中人參皂苷Rg1和三七皂苷R1分離度不能達到鑒別要求，預(yù)制板中各斑點分離度良好，色譜辨識度高；對不同的展開距離和展開溫度條件進行考察，結(jié)果顯示展距為10 cm時各斑點不能實現(xiàn)很好分離，展距為17 cm時，各斑點分離度相對較好，易于辨識；展開溫度考察中，將薄層板分別置于6 ℃和室溫環(huán)境展開，結(jié)果表明在不同溫度下各斑點均可實現(xiàn)較好分離。

3.3 指紋圖譜方法學(xué)考察 在指紋圖譜方法學(xué)考察中，對供試品制備所用的提取方式、提取溶劑進行考察，比較超聲提取和回流提取法，并考察甲醇、無水乙醇、乙酸乙酯、水飽和正丁醇這4種溶劑的提取效率，最終確定以甲醇為溶劑，超聲(40 kHz，200 W)提取0.5 h。

中藥飲片經(jīng)超微破壁粉碎后，有效成分充分暴露，成分釋放、溶出均顯著加快[13-14]，但目前破壁飲片的質(zhì)量控制和評價體系并不完善，僅廣東省建立了《廣東省中藥破壁飲片質(zhì)量標準研究規(guī)范(試行)》，這對于破壁飲片的發(fā)展和應(yīng)用是遠遠不足的。本研究從性狀、顯微鑒別、薄層色譜、指紋圖譜、粒徑分布、浸出物以及指標成分的含量測定等多方面開展三七破壁飲片的質(zhì)量分析，為有效制定三七破壁飲片質(zhì)量標準提供實驗依據(jù)。