番茄粗提物對(duì)香蕉枯萎病菌FocTR4的抑制效果

劉 范, 田 娜, 孫雪麗, 郝向陽(yáng), 項(xiàng)蕾蕾, 賴鐘雄, 程春振

(福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院/福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所，福建 福州 350002)

番茄是一種藥食兼用的果蔬類食物[1]，不但營(yíng)養(yǎng)豐富，還具有一定的抑菌作用[2-3]。番茄莖葉揮發(fā)性成分[4]和水粗提物活性成分[5]對(duì)細(xì)菌和霉菌都具有抑制作用，且葉揮發(fā)性成分和水粗提物的抑菌效果均優(yōu)于莖；青果粗提液對(duì)青霉、黑曲霉和灰霉葡萄孢等也具有較好的抑制效果[6]。此外番茄提取物對(duì)植物病原菌也有較好的抑制效果。楊從軍等[7]發(fā)現(xiàn)，200 g·L-1番茄莖葉水提取物對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌和棉花枯萎病菌的抑制率大于78%，對(duì)瓜類枯萎病菌的抑制率大于67%。楊柳等[8]發(fā)現(xiàn)，200 mg·mL-1番茄莖葉乙醇提取物對(duì)葡萄白腐病菌和棉花枯萎病菌的抑制率大于90%，且對(duì)番茄早疫病菌和蘋(píng)果斑點(diǎn)病菌也有一定的抑制作用。

由尖孢鐮刀菌古巴專化型(Fusariumoxysporumf.sp.Cubense,Foc)引起的香蕉枯萎病是嚴(yán)重威脅香蕉產(chǎn)業(yè)發(fā)展的毀滅性土傳真菌病害，尚無(wú)有效的根治方法[9-11]。目前防治香蕉枯萎病主要通過(guò)生物、化學(xué)技術(shù)及輪作等途徑[12]。黃永紅等[13]研究發(fā)現(xiàn)，韭菜提取物和韭菜殘?bào)w處理能夠減少香蕉枯萎病的發(fā)生，因此韭菜—香蕉輪作常被用作防治香蕉枯萎病的重要手段。鑒于番茄提取物具有較好的抑菌效果，本研究擬對(duì)番茄不同器官粗提物對(duì)香蕉枯萎病菌熱帶4號(hào)小種(Foctropical race 4,FocTR4)生長(zhǎng)的影響展開(kāi)研究，以探索番茄提取物應(yīng)用于香蕉枯萎病防治的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

香蕉枯萎病菌FocTR4和2月齡的抗番茄枯萎病、黃萎病以及灰霉病的‘倍盈’番茄植株均由福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所提供。

1.2 番茄粗提物的提取

取‘倍盈’番茄植株根、莖、葉，自來(lái)水沖洗干凈后再用無(wú)菌水沖洗2～3次。用濾紙吸干表面水分，分別稱取20 g置于榨汁機(jī)中。加入50 mL無(wú)菌水打磨成勻漿，用兩層紗布過(guò)濾收集濾液。向?yàn)V液中加無(wú)菌水至總體積100 mL，5 000 r·min-1離心5 min后吸取上清液。在超凈工作臺(tái)中使用0.22 μm過(guò)濾頭(MILLEX公司生產(chǎn))將上清液過(guò)濾除菌，加無(wú)菌水定容至100 mL，即獲得200 g·L-1番茄根、莖、葉粗提物溶液。

1.3 番茄粗提物培養(yǎng)基制備

將10、6.67、5 mL番茄葉提取物分別加到50 mL離心管中并加入50～60 ℃的PDA培養(yǎng)基定容至20 mL，搖勻后倒入直徑為8.5 cm的培養(yǎng)皿中，獲得含有高濃度(100.0 g·L-1)、中濃度(66.7 g·L-1)、低濃度(50.0 g·L-1)番茄葉粗提物的PDA培養(yǎng)基。含有相同濃度的莖、根粗提物的PDA培養(yǎng)基配制方法同上。以加入等體積無(wú)菌水的PDA培養(yǎng)基作為對(duì)照。

1.4 FocTR4菌落培養(yǎng)與觀察

使用滅菌的黃色槍頭(內(nèi)徑為5 mm)在培養(yǎng)7 d的FocTR4菌落邊緣打孔，獲得FocTR4菌塊。將菌塊倒置于含有不同濃度番茄根、莖、葉粗提物的PDA培養(yǎng)基中央。于28 ℃生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，每種處理重復(fù)3次。以接種在等濃度無(wú)菌水PDA培養(yǎng)基中的菌落為對(duì)照。接種后每天測(cè)量菌落直徑并拍照，直至所有FocTR4長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿。參照李吉慶等[14]的方法計(jì)算番茄粗提物對(duì)FocTR4的抑制率。

1.5 統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel和SPSS進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄粗提物對(duì)FocTR4生長(zhǎng)的影響

2.1.1 葉粗提物 從表1～3可看出，F(xiàn)ocTR4菌落在含有番茄葉粗提物的PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最慢。含有高濃度(100 g·L-1)葉粗提物培養(yǎng)基上，F(xiàn)ocTR4菌絲覆蓋1/2、2/3和全皿的時(shí)間分別比同濃度對(duì)照(分別為第4、5、8天)推遲2、3、5 d(表1)；中濃度(66.7 g·L-1)分別比同濃度對(duì)照推遲1、1、2 d(表2)；低濃度(50 g·L-1)分別推遲1、1、0 d(表3)。含高濃度葉粗提物的培養(yǎng)基上，F(xiàn)ocTR4菌落直徑在1～11 d時(shí)極顯著小于對(duì)照(P<0.01)；含中濃度葉粗提物的培養(yǎng)基上，F(xiàn)ocTR4菌落直徑在1～9 d時(shí)極顯著小于對(duì)照(P<0.01)；而含低濃度葉粗提物的培養(yǎng)基上，F(xiàn)ocTR4菌落直徑在1～7 d時(shí)極顯著小于對(duì)照(P<0.01)，第8天顯著小于對(duì)照(P<0.05)。

2.1.2 莖粗提物 番茄莖和根粗提物對(duì)FocTR4生長(zhǎng)也表現(xiàn)出一定影響，莖的抑制作用略優(yōu)于根(表1～3)。在含高濃度莖粗提物的培養(yǎng)基上，F(xiàn)ocTR4菌落直徑在第1天時(shí)顯著小于對(duì)照(P<0.05)，2～8 d時(shí)極顯著小于對(duì)照(P<0.01)；在含中濃度莖粗提物的培養(yǎng)基上，F(xiàn)ocTR4菌落直徑在第1天時(shí)顯著小于對(duì)照(P<0.05)，2～7 d時(shí)極顯著小于對(duì)照(P<0.01)；而在含低濃度莖粗提物的培養(yǎng)基上，F(xiàn)ocTR4菌落直徑在第1天時(shí)顯著大于對(duì)照(P<0.05)，第2、5天極顯著小于對(duì)照(P<0.01)，第3、6天顯著小于對(duì)照(P<0.05)。

表1 高濃度(100.0 g·L-1)番茄粗提物對(duì)FocTR4生長(zhǎng)的影響1)Table 1 Effect of high concentration (100.0 g·L-1) tomato crude extracts on the growth of FocTR4

1)加粗為菌絲直徑超過(guò)全板的1/2；下劃線為菌絲直徑超過(guò)全板的2/3；相同培養(yǎng)天數(shù)附不同大小寫(xiě)字母者分別表示差異達(dá)0.01、0.05顯著水平。

表2 中濃度(66.7 g·L-1)番茄粗提物對(duì)FocTR4生長(zhǎng)的影響1)Table 2 Effect of medium concentration (66.7 g·L-1) tomato crude extracts on the growth of FocTR4

1)加粗為菌絲直徑超過(guò)全板的1/2；下劃線為菌絲直徑超過(guò)全板的2/3；相同培養(yǎng)天數(shù)附不同大小寫(xiě)字母者分別表示差異達(dá)0.01、0.05顯著水平。

2.1.3 根粗提物 番茄根粗提物對(duì)FocTR4生長(zhǎng)的影響較小(表1～3)。在含高濃度根粗提物的培養(yǎng)基上，F(xiàn)ocTR4菌落直徑在4～8 d極顯著小于對(duì)照(P<0.01)；在中濃度根粗提物的培養(yǎng)基上，F(xiàn)ocTR4菌落直徑在第2天和第4～8天極顯著小于對(duì)照(P<0.01)，第9天顯著小于對(duì)照(P<0.05)；而低濃度根粗提物的培養(yǎng)基上，F(xiàn)ocTR4菌落直徑在第1、第4天極顯著大于對(duì)照(P<0.01)，第5天極顯著小于對(duì)照(P<0.01)。

表3 低濃度(50 g·L-1)番茄粗提物對(duì)FocTR4生長(zhǎng)的影響1)Table 3 Effect of low concentration (50 g·L-1) tomato crude extracts on the growth of FocTR4

1)加粗為菌絲直徑超過(guò)全板的1/2；下劃線為菌絲直徑超過(guò)全板的2/3；相同培養(yǎng)天數(shù)附不同大小寫(xiě)字母者分別表示差異達(dá)0.01、0.05顯著水平。

2.2 番茄粗提物對(duì)FocTR4的抑制效果比較

通過(guò)計(jì)算不同部位番茄粗提物對(duì)FocTR4的抑制率，發(fā)現(xiàn)葉粗提物抑制率最高，且各濃度葉粗提物對(duì)FocTR4的抑制率均在培養(yǎng)第2天達(dá)到最大值(圖1A)。番茄莖、根粗提物對(duì)FocTR4的抑制作用較弱，均低于20%，莖的抑制作用略優(yōu)于根(圖1B、1C)。

A.葉粗提物;B.根粗提物;C.莖粗提物。圖1 番茄葉、莖、根粗提物對(duì)FocTR4的抑制率Figure 1 Inhibitory rates of crude extracts from tomato leaves, stems and roots on FocTR4

不同部位番茄粗提物對(duì)FocTR4抑制率的變化趨勢(shì)也有所不同。番茄葉粗提取物對(duì)FocTR4的抑制率大致表現(xiàn)為“先升后降”的趨勢(shì)(圖1A)。與葉粗提物抑制率變化趨勢(shì)不同，莖和中低濃度根粗提物對(duì)FocTR4的抑制率大致呈現(xiàn)“升—降—升—降”的趨勢(shì)(圖1B、1C)。而高濃度根粗提物的抑制率則表現(xiàn)為“先升后降”的趨勢(shì)(圖1C)。

不同濃度的番茄葉、莖粗提物對(duì)FocTR4的抑制效果由高到低依次為：高濃度>中濃度>低濃度(圖1A、1B)。而不同濃度番茄根粗提物對(duì)FocTR4的抑制效果則以中濃度最佳，略優(yōu)于高濃度，低濃度抑制效果最差(圖1C)。

3 討論

番茄含有大量α-番茄堿和脫氫番茄堿等抑菌活性成分[15-16]。Arneson et al[17]發(fā)現(xiàn)番茄堿對(duì)30種病原菌具有抑制作用。Itkin et al[18]發(fā)現(xiàn)番茄次堿可以顯著抑制炭疽菌的生長(zhǎng)。陶永霞等[16]發(fā)現(xiàn)番茄生物堿提取液對(duì)細(xì)菌和酵母菌有較強(qiáng)的抑制作用。Irving et al[19]發(fā)現(xiàn)番茄堿對(duì)尖孢鐮刀菌具有一定的抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)，番茄粗提物對(duì)FocTR4的生長(zhǎng)具有一定的抑制作用，抑制效果依次為：葉>莖>根。已有研究表明，番茄根莖葉中番茄堿含量也依次為：葉>莖>根[20-23]，說(shuō)明不同番茄粗提物對(duì)FocTR4抑制效果的差異可能與番茄堿含量有關(guān)。

本研究表明，番茄不同部位粗提物對(duì)FocTR4抑制率的變化趨勢(shì)差異較大。不同濃度葉粗提物對(duì)FocTR4的抑制率均在2 d達(dá)到最大值，之后開(kāi)始緩慢下降。這可能由于FocTR4在培養(yǎng)初期(1 d)需要一個(gè)適應(yīng)階段因而長(zhǎng)勢(shì)均較慢、抑制率略低，在培養(yǎng)2 d時(shí)表現(xiàn)出較高的抑制率，之后隨著抑制物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分的消耗或降解，抑制效果逐步降低。高濃度的番茄根粗提物對(duì)FocTR4的抑制率呈“先升后降”的趨勢(shì)，并且7 d才達(dá)到最高值。根系是FocTR4等土生病原菌侵染和定殖的主要部位[24]，在植物—病原菌互作過(guò)程中，病原菌可以從根系中獲得養(yǎng)分以維持自身生長(zhǎng)[25]。高濃度番茄根粗提物對(duì)FocTR4的抑制率緩慢上升可能與根系中含有大量營(yíng)養(yǎng)成分供給其生長(zhǎng)有關(guān)。隨著利于FocTR4生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗，抑制率逐步提高。莖和中低濃度根粗提物抑制率大致呈“升—降—升—降”的趨勢(shì)，這可能與番茄提取物及培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分和抑菌物質(zhì)含量消耗及FocTR4生長(zhǎng)勢(shì)有關(guān)。

綜上可知，番茄葉和莖粗提物對(duì)香蕉枯萎病菌表現(xiàn)出較好的抑制效果，具有應(yīng)用于香蕉枯萎病防治的潛質(zhì)，但粗提物的有效抑菌成分及最佳抑菌濃度需進(jìn)一步分離、鑒定。此外，本研究所用‘倍盈’番茄是抗枯萎病、黃萎病以及灰霉病的番茄品種。李偉明等[26]指出，含有番茄枯萎病抗性基因的番茄品種在接種FocTR4后不會(huì)出現(xiàn)枯萎病的癥狀，說(shuō)明番茄枯萎病抗性品種中含有某些抑制FocTR4生長(zhǎng)或侵染的物質(zhì)。Friedman[27]指出，衰老葉中番茄堿含量最高，推測(cè)將廢棄莖葉還田可能會(huì)起到更好的抑菌效果。番茄秸稈還田具有改良土壤的功效[28]，因此在香蕉枯萎病防治過(guò)程中可以嘗試將番茄枯萎病抗性品種與香蕉輪作，之后將番茄莖葉還田，不僅能夠改良土壤，還有可能起到降低土壤中病原菌含量的作用。