臍橙全果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化及其與臍橙果汁酒風(fēng)味物質(zhì)的對比分析

鄭淑丹，陳 鋼*，闕發(fā)秀，萬 聆，鄧山鴻，簡素平

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

臍橙譽為“柑橘之王”，其果肉顆粒飽滿，鮮嫩多汁，濃甜芳香，營養(yǎng)成分豐富，適用于深加工。我國臍橙產(chǎn)量豐盛，但成熟期較集中、不易貯存，再加上我國臍橙加工業(yè)不發(fā)達，目前仍以鮮食和橙汁加工為主[1]，導(dǎo)致大量臍橙腐爛變質(zhì)，造成嚴(yán)重浪費，限制了我國臍橙產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2]。

以臍橙果汁為原料釀造的果酒，乙醇體積分?jǐn)?shù)較低，口感清爽，醇厚柔和，酒香綿長[3]。臍橙果酒充分地汲取了其原有的功能成分，如維生素、類黃酮、類胡蘿卜素等，更利于人體吸收，具有降低膽固醇、延年益壽、保健養(yǎng)顏等功效[4-5]。另外，在果酒的發(fā)酵過程中，微生物將臍橙中的還原糖轉(zhuǎn)化合成多種醇、酯、萜烯類等物質(zhì)，增加了臍橙的營養(yǎng)價值并改善了風(fēng)味，臍橙果酒的研究也越來越受到重視。有研究表明，臍橙果皮中存在的香氣物質(zhì)種類和含量頗為豐富[6]。因此，本研究以臍橙全果為原料，進行臍橙全果酒發(fā)酵工藝的優(yōu)化，并與臍橙果汁酒進行風(fēng)味物質(zhì)的比較，從而為臍橙全果酒的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

臍橙 江西省贛州地區(qū)信豐市；臍橙果汁酒 實驗室自釀；白砂糖（食品級） 深圳安泰生物科技有限公司；葡萄酒、果酒專用酵母（SY） 安琪酵母股份有限公司；果膠酶（酶活力＞50 000 U/g） 上海源聚生物科技有限公司；偏重亞硫酸鉀（食品級） 長沙科迪亞實業(yè)有限公司；3-辛醇（色譜純） 美國Sigma公司；β-環(huán)糊精（分析純） 廣州一碼生物有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HR1882型榨汁機 飛利浦（中國）投資有限公司；MP2002電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；WYT-J型手持糖度計 成都光學(xué)廠；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司；pH S22型數(shù)顯酸度計 德國Sartorius公司；酒精計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；VS-1300型超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；微量移液器 上海熱電儀器有限公司；5975-6890N氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀 美國Agilent公司；二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷萃取頭 美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程[7-8]

1.3.2 操作要點[7-8]

預(yù)處理：選取新鮮成熟的臍橙，清洗干凈，切成小瓣，并去除種子。

榨汁：將處理好的臍橙全果進行榨汁作為發(fā)酵液。

酶解、脫苦：加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%的果膠酶和0.3%的β-環(huán)糊精，45 ℃恒溫水浴攪拌1 h。

調(diào)配：添加60 mg/L的偏重亞硫酸鉀，用白砂糖調(diào)節(jié)發(fā)酵液含糖量至22%，用檸檬酸和碳酸氫鈉調(diào)整發(fā)酵液的pH值至3.5～4.5。

酵母活化：取發(fā)酵液體積3%～8%的干酵母，加入料液比1∶20（g/mL）的糖水，于38 ℃活化1 h。

主發(fā)酵：加入活化好的酵母，放置在生化培養(yǎng)箱中恒溫（25～29 ℃） 密封發(fā)酵8～18 d，直至殘?zhí)橇康陀? g/L為止。

后發(fā)酵：主發(fā)酵完成后，采用虹吸法將果酒轉(zhuǎn)移到另一發(fā)酵容器中，盡量避免酒與氧的接觸，補加50 mg/L的偏重亞硫酸鉀，在20 ℃密封靜置15～20 d。

陳釀：將發(fā)酵后的臍橙果酒轉(zhuǎn)入貯酒罐進行陳釀，于16 ℃滿罐放置60～80 d，每隔25 d倒罐1 次，以分離沉渣及酒腳。

澄清、過濾：陳釀后的臍橙酒中加入1%殼聚糖-0.1%明膠對臍橙酒進行澄清處理，用量為0.6 g/L，隨后進行過濾。

1.3.3 臍橙果汁酒的釀制

將臍橙果肉經(jīng)過榨汁、過濾處理得到的臍橙果汁作為發(fā)酵液，其后續(xù)工藝流程和上述一致。

1.3.4 臍橙全果酒發(fā)酵條件的單因素試驗設(shè)計

1.3.4.1 接種量的影響

在臍橙發(fā)酵液中分別接種3%、4%、5%、6%、7%、8%的釀酒酵母，28 ℃發(fā)酵12 d，以乙醇體積分?jǐn)?shù)和殘?zhí)橇繛樵u價指標(biāo)，探討釀酒酵母接種量對臍橙全果酒發(fā)酵效果的影響。

1.3.4.2 發(fā)酵時間的影響

臍橙發(fā)酵液中釀酒酵母接種量6%，發(fā)酵溫度28 ℃，分別發(fā)酵8、10、12、14、16、18 d，以乙醇體積分?jǐn)?shù)和殘?zhí)橇繛樵u價指標(biāo)，探討發(fā)酵時間對臍橙全果酒發(fā)酵效果的影響。

1.3.4.3 發(fā)酵溫度的影響

臍橙發(fā)酵液中果酒干酵母接種量6%，分別在25、26、27、28、29、30 ℃不同溫度條件下進行發(fā)酵，發(fā)酵12 d，以乙醇體積分?jǐn)?shù)和殘?zhí)橇繛樵u價指標(biāo)，探討發(fā)酵溫度對臍橙全果酒發(fā)酵效果的影響。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

通過對單因素試驗結(jié)果分析，采用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計分析方法[9-11]，選擇酵母接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度3 個因素進行響應(yīng)面試驗，以乙醇體積分?jǐn)?shù)為響應(yīng)值進行優(yōu)化，所有試驗均重復(fù)3 次，因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素與水平設(shè)計Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken design

1.3.6 理化指標(biāo)測定[12]

乙醇體積分?jǐn)?shù)的測定：酒精計法；糖度的測定：手持折光儀法；殘?zhí)橇康臏y定：斐林試劑滴定法；SO2的測定：直接碘量法；pH值的測定：采用PHS22型酸度計。理化指標(biāo)重復(fù)測定3 次。

1.3.7 GC-MS條件[13-14]

將固相微萃取萃取頭在GC-MS儀的進樣口老化，老化溫度250 ℃，老化時間30 min，載氣流速1.0 mL/min。取10 mL臍橙酒樣于25 mL螺口進樣瓶中，加入內(nèi)標(biāo)物3-辛醇（400 μg/L）5 μL和0.1 g/mL NaCl溶液，密封置于45 ℃水浴中平衡30 min。平衡后插入經(jīng)過老化處理的固相微萃取頭，頂空萃取40 min后，再將萃取頭插入GC進樣口，解吸5 min。

色譜條件[15-16]：色譜柱DB-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 mm）；升溫程序：40 ℃保持3 min，以3 ℃/min的速率升到160 ℃，保持2 min，然后以8 ℃/min的速率升至230 ℃，保持3 min；He流量1.0 mL/min；無分流進樣；進樣口溫度：250 ℃；

質(zhì)譜條件：電子電離源；離子源溫度230 ℃；接口溫度250 ℃；電子能量70 eV；燈絲發(fā)熱電流0.25 mA；掃描質(zhì)量范圍m/z33～450。

1.3.8 香氣成分分析[17]

定性分析：運用計算機譜庫（NIST/WILEY）對所得結(jié)果進行初步檢索及資料分析，并結(jié)合相關(guān)文獻進行定性分析。

定量分析：采用內(nèi)標(biāo)法，內(nèi)標(biāo)物為3-辛醇（400 μg/L），按下式計算：

式中：Wi為揮發(fā)性風(fēng)味化合物質(zhì)量濃度/（μg/L）；Ws為加入內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量/μg；Ai為待測組分的峰面積；As為內(nèi)標(biāo)物的峰面積；fi’為待測組分對內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量相對校正因子。

1.3.9 感官評定

參照GB/T 10220—2012《感官分析方法學(xué)總論》要求組建感官評定小組（20 人）[18]，參考GB/T 15038—2006《葡萄酒果酒通用試驗方法》制定評分標(biāo)準(zhǔn)，并依據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)對臍橙果酒進行感官評分，取其平均值作為評分結(jié)果。感官評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 臍橙酒感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Criteria for sensory evaluation of navel orange wine

2 結(jié)果與分析

2.1 臍橙全果酒發(fā)酵條件的單因素試驗結(jié)果

2.1.1 酵母接種量的影響

圖1 酵母接種量對果酒乙醇體積分?jǐn)?shù)和殘?zhí)堑挠绊慒ig. 1 Effects of inoculum amount on ethanol production and residual sugar concentration

如圖1所示，酵母接種量低于5%時，其自身繁殖代謝緩慢，果酒殘?zhí)橇科咔乙掖俭w積分?jǐn)?shù)偏低，發(fā)酵不徹底。當(dāng)酵母接種量為6%時，乙醇體積分?jǐn)?shù)和殘?zhí)橇糠謩e達到最大值和最小值。由此可見，酵母接種量越大，果酒乙醇體積分?jǐn)?shù)越高，糖分解轉(zhuǎn)化率越高，乙醇體積分?jǐn)?shù)也越高。但是，過大的接種量會使酵母自身的呼吸和繁殖加快，消耗過多的糖分，發(fā)酵液中用于生成乙醇的糖分便會相應(yīng)減少。并且由于營養(yǎng)成分的消耗以及代謝物的生成，降低了酵母發(fā)酵環(huán)境的質(zhì)量，從而導(dǎo)致酵母的早衰和自溶，使果酒的乙醇體積分?jǐn)?shù)下降[19-20]。

2.1.2 發(fā)酵時間的影響

發(fā)酵時間短，酵母活力沒有充分發(fā)揮作用而導(dǎo)致發(fā)酵不完全，發(fā)酵液殘?zhí)橇科?，乙醇體積分?jǐn)?shù)較低。如圖2所示，隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵液殘?zhí)橇恐饾u降低，乙醇體積分?jǐn)?shù)逐漸上升。發(fā)酵前8 d，殘?zhí)橇肯陆狄约耙掖俭w積分?jǐn)?shù)增長速度均較快。發(fā)酵到第14天時，乙醇體積分?jǐn)?shù)達到11.2%，殘?zhí)橇拷禐?.7 g/L 左右，基本達到發(fā)酵終點，隨后便趨于穩(wěn)定狀態(tài)。

圖2 發(fā)酵時間對果酒乙醇體積分?jǐn)?shù)和殘?zhí)堑挠绊慒ig. 2 Effects of fermentation time on ethanol production and residual sugar concentration

2.1.3 發(fā)酵溫度的影響

圖3 發(fā)酵溫度對果酒乙醇體積分?jǐn)?shù)和殘?zhí)堑挠绊慒ig. 3 Effects of fermentation temperature on ethanol production and residual sugar concentration

酵母的生長繁殖和溫度密切相關(guān)，其直接影響果酒的品質(zhì)。溫度太低會使酵母的生長受到抑制，糖降解速率偏低，發(fā)酵時間偏長，且發(fā)酵不充分[21]。在一定的范圍之內(nèi)，溫度越高，酵母的生長速率越快，酶活力越高，所需發(fā)酵時間相對縮短。但是，溫度太高會使果酒風(fēng)味物質(zhì)流失，并產(chǎn)生不良的發(fā)酵味，從而使果酒的品質(zhì)和口感下降[22]，其可能是因為高溫會使發(fā)酵前期太過劇烈，以致后期發(fā)酵力不足。如圖3所示，當(dāng)主發(fā)酵溫度為28 ℃時，發(fā)酵平穩(wěn)且徹底，易于控制，果酒口感和品質(zhì)較佳，所需發(fā)酵時間也適中。

2.2 臍橙全果酒發(fā)酵條件的響應(yīng)面優(yōu)化試驗

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

參照單因素試驗結(jié)果，選擇發(fā)酵溫度（A）、酵母接種量（B）、發(fā)酵時間（C）各因素的最優(yōu)試驗范圍進行Box-Behnken試驗設(shè)計，以乙醇體積分?jǐn)?shù)為響應(yīng)值，響應(yīng)面試驗結(jié)果如表3所示。

表3 Box-Behnken試驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 3 Box-Behnken design with experimental values of ethanol production

利用Design-Expert對表3的響應(yīng)值進行整理分析，確立回歸方程預(yù)測模型如下：

2.2.2 方差分析

表4 回歸方程方差分析Table 4 Analysis of variance of the fitted regression model

對上述二次回歸方程進行方差分析，所得結(jié)果見表4?？梢钥闯?，此模型極顯著（P＜0.000 1），并能較好地反映出臍橙全果酒乙醇體積分?jǐn)?shù)和各因素之間的線性關(guān)系（R2=0.983 1）；調(diào)整系數(shù)R2Adj為0.961 4，表明此模型擬合程度較好；失擬項不顯著（P＞0.05），可以用此模型對臍橙全果酒進行分析預(yù)測。一次項A、B、C和二次項A2、B2、C2影響極顯著（P＜0.01），表明這幾個因素對臍橙全果酒乙醇體積分?jǐn)?shù)影響較大。根據(jù)F值的大小，各因素對臍橙全果酒乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響程度為：酵母接種量＞發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時間。

2.2.3 因素間交互作用分析

圖4 各因素交互作用對果酒乙醇體積分?jǐn)?shù)影響的響應(yīng)面Fig. 4 Response surface plots showing the interactive effects of various factors on ethanol production

從圖4可知，隨著各因素水平的增加，乙醇體積分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，且B對乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響要大于A和C。另外，等高線的形狀可以反映出各因素的交互作用對響應(yīng)值的影響，當(dāng)?shù)雀呔€為橢圓形時，說明其交互作用顯著，而當(dāng)?shù)雀呔€為圓形時，其交互作用則不顯著[23]。由圖分析可知，酵母接種量和發(fā)酵溫度之間的交互因素較為顯著，這和方差分析結(jié)果保持一致。

2.2.4 最佳工藝條件確定

通過Design-Expert V 8.0.6分析可以得出臍橙全果酒的最佳工藝條件為發(fā)酵溫度28.28 ℃、酵母接種量6.38%、發(fā)酵時間14.40 d，此條件下發(fā)酵的臍橙全果酒乙醇體積分?jǐn)?shù)為11.25%。為驗證該方案的可靠性，并結(jié)合實際情況，將發(fā)酵工藝參數(shù)調(diào)整為：發(fā)酵溫度28 ℃、酵母接種量6.4%、發(fā)酵時間14 d。在此條件下進行3 組平行實驗，所得乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為11.2%、11.3%、11.2%，平均值為11.23%，與理論預(yù)測值僅相差0.08%，表明實驗結(jié)果與該模型相符度高。因此，通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化得到的臍橙全果酒發(fā)酵工藝條件準(zhǔn)確可靠，參考性較高。

2.3 臍橙全果酒與臍橙果汁酒風(fēng)味物質(zhì)的分析比較

香氣成分是果酒感官評定的直接影響因素，也是評價果酒品質(zhì)特性的重要指標(biāo)。果酒中的大部分香氣成分是在發(fā)酵過程中由酵母代謝產(chǎn)生的，種類豐富，主要包括酯類、醇類、酸類、萜烯類等[24]。果酒中的揮發(fā)性成分種類頗豐富，且呈現(xiàn)出不同的香氣，這些香氣物質(zhì)富集在一起，并相互協(xié)調(diào)，賦予了果酒濃郁而獨特的風(fēng)味[25-26]。此外，果酒的發(fā)酵工藝條件也會對香氣的成分和含量造成一定的影響。氣味活度值（odor activity value，OAV）反映了香氣成分揮發(fā)性的大小及難易程度，能較客觀地體現(xiàn)香氣成分對酒風(fēng)味的影響[27]。采用頂空固相微萃取并結(jié)合GC-MS技術(shù)，對兩種臍橙酒中的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)進行了鑒定，在臍橙全果酒和臍橙果汁酒中分別檢出25 種和11 種揮發(fā)性香氣物質(zhì)。通過表5分析可知，臍橙全果酒的香氣活性成分主要為萜烯類，其次為醇類和酯類，而臍橙果汁酒的主要香氣成分為醇類。4-松油烯醇和里哪醇是臍橙全果酒主要香氣成分，而3-甲基-1-丁醇在臍橙果汁酒中含量最豐富。

表5 臍橙果酒風(fēng)味物質(zhì)分析Table 5 Flavor components of different navel orange wines

表6 臍橙果酒風(fēng)味物質(zhì)的OAV分析Table 6 OAVs of flfl avor components in different navel orange wines

比較這兩種臍橙酒的各類風(fēng)味物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其在定性和定量上均有所不同。臍橙全果酒中共檢測出9 種醇類物質(zhì)，占總香氣成分的28.50%。雖然臍橙果汁酒中只檢測出4 種醇類物質(zhì)，但其含量卻高達91.95%，其中3-甲基-1-丁醇更是臍橙果汁酒香氣成分的主要貢獻者，賦予臍橙酒誘人的水果香和花香，并能夠持久保存[28]。在臍橙全果酒中共含有9 種萜烯類化合物，且所占比例較大（66.00%），除橙花叔醇外，OAV均大于1，香氣特征明顯（表6）。其中，D-檸檬烯和里哪醇被視為臍橙酒的特征香氣成分，嗅覺閾值低，OAV高，賦予臍橙果酒愉悅的甜香、花果香，以及獨特的臍橙風(fēng)味[29]。然而在臍橙果汁酒中只檢測出一種萜烯類物質(zhì)（香茅醇），且含量較低（0.27%），風(fēng)味不突出。酯類物質(zhì)含量在兩種酒中均不高，且種類上也有很大的差別。癸酸乙酯和辛酸乙酯是兩種酒中共同含有的酯類物質(zhì)，其含量和OAV在臍橙全果酒中相對高一點，從而使臍橙全果酒的香氣更濃郁。另外，醛酮類物質(zhì)只在臍橙全果酒中檢測到，雖然其含量較少，但對臍橙酒香氣的呈現(xiàn)起到不可忽視的作用[30]。感官評價方面，臍橙全果酒得分（90.2 分）高于臍橙果汁酒（84.7 分），且在香氣得分上有較明顯的優(yōu)勢（臍橙全果酒為25.4 分，臍橙果汁酒為21.8 分）。綜合分析看來，臍橙皮和果肉的加入使有更多的原料成分經(jīng)過發(fā)酵融入酒體中，從而增加了臍橙全果酒香氣的種類和含量，對感官評定也有一定的改善。

3 結(jié) 論

采用單因素試驗和Box-Behnken試驗設(shè)計，通過響應(yīng)面分析法得到臍橙全果酒最佳發(fā)酵工藝條件：酵母接種量6.4%、發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵時間14 d，在此優(yōu)化條件下，臍橙全果酒的乙醇體積分?jǐn)?shù)為11.23%。此工藝下釀制的臍橙全果酒酒體色澤金黃明亮，口感豐滿圓潤，柔和爽口，香氣濃郁協(xié)調(diào)，回味綿長，風(fēng)格突出。

通過頂空固相微萃取GC-MS對臍橙全果酒和臍橙果汁酒風(fēng)味物質(zhì)進行鑒定，在臍橙全果酒和臍橙果汁酒中分別檢出25 種和11 種揮發(fā)性香氣物質(zhì)。臍橙全果酒的香氣活性成分主要為萜烯類，占香氣成分的66.00%，其次為醇類和酯類，而臍橙果汁酒的主要香氣成分為醇類，所占比例為91.95%。4-松油烯醇和里哪醇是臍橙全果酒主要香氣成分，而3-甲基-1-丁醇在臍橙果汁酒中含量最豐富。通過分析比較，臍橙全果酒中香氣成分種類更復(fù)雜，含量更豐富。綜合感官評價分析，臍橙全果酒優(yōu)于臍橙果汁酒，其口感更加飽滿醇厚，香氣更加持久濃郁，更具有臍橙典型性風(fēng)味。