東北酸菜中乳酸菌的分離鑒定與耐酸性菌株的篩選

王 惋，盧佳音，焦月華，王毅超，姜瞻梅，田 波，王玉堂，侯俊財(cái),*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評(píng)價(jià)中心，黑龍江 哈爾濱 150040）

自然發(fā)酵酸菜的制作是利用微生物附著在蔬菜表面，從而進(jìn)行自然發(fā)酵。蔬菜發(fā)酵的過程、酸菜制品的風(fēng)味及品質(zhì)直接受微生物活性的影響[1]。方心芳[2]指出雖然蔬菜的發(fā)酵由多種微生物參與，但是主要產(chǎn)酸的是乳酸菌。Fan Sicun等[3]研究了泡菜腌制中菌系的生長(zhǎng)規(guī)律。乳酸菌的數(shù)量在新鮮蔬菜上比較少，但當(dāng)條件適宜時(shí)，乳酸菌則會(huì)處于優(yōu)勢(shì)[4-5]。因?yàn)樯傻娜樗岵粌H能使發(fā)酵環(huán)境的酸性變強(qiáng)從而抑制雜菌，而且對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)、風(fēng)味具有重要的影響[6]。乳酸菌具有促進(jìn)營養(yǎng)成分的分解、調(diào)節(jié)腸道菌群、抗菌、降低血清膽固醇、增強(qiáng)免疫力的益生作用[7-9]，在食品、醫(yī)藥和飼料等領(lǐng)域，乳酸菌也得到廣泛應(yīng)用。在食品工業(yè)中，乳酸菌具有抑制有害菌的生長(zhǎng)、增強(qiáng)抗氧化劑的效果[10]；在醫(yī)藥行業(yè)中，乳酸菌可以調(diào)節(jié)腸道內(nèi)的免疫反應(yīng)，通過行使免疫功能抑制腸道發(fā)生炎癥[11]；在飼料方面，含有乳酸菌的益生性飼料可以提高動(dòng)物產(chǎn)量[12]。但是，外源乳酸菌要想在腸道中定植發(fā)揮作用，必須要能夠耐受胃中的酸性環(huán)境[13]，因此，篩選具耐酸的乳酸菌具很大的研究和應(yīng)用價(jià)值。與傳統(tǒng)的生理生化鑒定方法相比，16S rDNA序列同源性分析技術(shù)作為一種分子水平鑒定技術(shù)，由于其簡(jiǎn)單易行、準(zhǔn)確高效，近幾年被廣泛應(yīng)用于乳酸菌種屬鑒定[14]。

結(jié)合上述內(nèi)容可以看出，在全面發(fā)展的背景下，鄉(xiāng)村規(guī)劃建設(shè)要充分滿足當(dāng)前農(nóng)民發(fā)展的基本需求，同時(shí)還要保護(hù)好鄉(xiāng)村地區(qū)固有的生態(tài)環(huán)境，提高鄉(xiāng)村規(guī)劃的科學(xué)性與合理性，并且還需在發(fā)展中充分結(jié)合鄉(xiāng)村實(shí)際，有針對(duì)性地開展鄉(xiāng)村規(guī)劃工作，進(jìn)而不斷完善鄉(xiāng)村規(guī)劃的整體水平。

本研究擬從質(zhì)量?jī)?yōu)良的酸菜汁樣品中分離出乳酸菌菌株，利用形態(tài)學(xué)分析和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（random amplifiled polymorphism DNA，RAPD）分析技術(shù)，初步鑒定所分離的菌株類型，隨后利用16S rDNA序列同源性分析，以確定分離菌株的分類學(xué)地位，并篩選耐酸性菌株，最后對(duì)未確定分類學(xué)地位的高耐酸性菌株的管家基因rpoA的同源性進(jìn)行分析，為其進(jìn)一步深入開發(fā)應(yīng)用研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

自然發(fā)酵酸菜汁樣品采集自黑龍江省齊齊哈爾市周邊地區(qū)的10 家農(nóng)戶。向MRS固體培養(yǎng)基[15]中加入2% CaCO3制成選擇培養(yǎng)基，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-16B型高速離心機(jī) 上海市離心機(jī)械研究所有限公司；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠；L2型紫外-可見分光光度計(jì)上海菁華科技儀器有限公司；MiniCyclerTM型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增儀 美國MJ Reserarch公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

將農(nóng)戶自然發(fā)酵的酸菜在其發(fā)酵容器中充分?jǐn)嚇踊靹蚝螅脺缇埔浩魑∷岵酥D(zhuǎn)移至滅菌采樣瓶中，隨后將采樣瓶置于冰盒內(nèi)，快速轉(zhuǎn)放到實(shí)驗(yàn)室冰箱內(nèi)低溫凍藏。10 份樣品均用傳統(tǒng)方法自然發(fā)酵、風(fēng)味良好、處于發(fā)酵后期的酸菜汁。

1.3.2 乳酸菌的分離純化

根據(jù)張魯冀等[16]的方法取適量樣品，將樣品用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的生理鹽水，按照10 倍逐漸遞增的方法進(jìn)行稀釋。依次選擇稀釋度為10－4～10－7的3 個(gè)樣品各200 μL，涂布于選擇培養(yǎng)基，每個(gè)稀釋度做3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，37 ℃的環(huán)境下，經(jīng)36～48 h培養(yǎng)后觀察。將產(chǎn)生溶鈣圈的菌落單獨(dú)選取出來進(jìn)行鏡檢，細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)以及排列方式基本相同的菌落確定為純菌株。若菌落不純，則將菌落重新劃線、接種、培養(yǎng)，到菌落分純?yōu)橹?。然后將進(jìn)行過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)的純菌株的形態(tài)記錄并編號(hào)，隨后進(jìn)行革蘭氏染色和鏡檢，采用體積分?jǐn)?shù)20%的甘油進(jìn)行保護(hù)，于－20 ℃進(jìn)行保藏[17]。

基于RAPD的結(jié)果，采用PCR擴(kuò)增同一樣本中基因型不同菌株的16S rRNA基因序列，擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件參照李欣等[20]的方法。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳后在紫外燈下觀察擴(kuò)增條帶。隨后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至華大公司進(jìn)行測(cè)序。在NCBI網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中，通過BLAST，將分離菌株的16S rDNA序列與GenBank進(jìn)行同源性比較，將與目的基因序列同源性最高的序列篩選出來，采用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，完成菌種鑒定。

RAPD技術(shù)是利用隨機(jī)引物通過PCR，非定點(diǎn)擴(kuò)增DNA片段，然后通過觀察擴(kuò)增片段的多態(tài)性來對(duì)分離菌株進(jìn)行基因分型[18]。提取分離菌株的基因組DNA，按照Antara等[19]的方法對(duì)72 株分離菌株進(jìn)行基因分型，RAPD的引物和擴(kuò)增條件如下，擴(kuò)增體系見表1。

引物4：5’-GAGGGTGGCGGTTCT-3’。PCR擴(kuò)增條件：第1步：94 ℃預(yù)變性5 min；第2步：94 ℃變性1 min，45 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)；第3步：72 ℃、5 min的PCR擴(kuò)增條件。

2.1.1 樣品中乳酸菌的分離

引物1：5’-GAGCGGCCAAAGGGAGCAGAC-3’；引物2：5’-NNNAACAGCTATGACCATG-3’。PCR擴(kuò)增條件：第1步：94 ℃變性5 min，42 ℃退火5 min，72 ℃延伸5 min，進(jìn)行4 個(gè)循環(huán)；第2步：94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)；第3步：72 ℃、5 min。

大理市是大理白族自治州州府所在地，位于滇西中部，地處東經(jīng)99°58′～100°27′，北緯25°25′～25°58′，東連賓川和祥云2縣，南鄰彌渡和巍山兩縣，西接漾濞縣，北臨洱源縣，距省會(huì)昆明市約338 km。大理市境東西橫距46.3 km，南北縱距59.3 km，國土面積1 815.00 km2，總體位于洱海流域范圍以內(nèi)?，F(xiàn)轄下關(guān)鎮(zhèn)、大理鎮(zhèn)、鳳儀鎮(zhèn)、喜洲鎮(zhèn)、挖色鎮(zhèn)、海東鎮(zhèn)、銀橋鎮(zhèn)、灣橋鎮(zhèn)、雙廊鎮(zhèn)、上關(guān)鎮(zhèn)和太邑鄉(xiāng)10鎮(zhèn)1鄉(xiāng)，以及大理省級(jí)旅游度假區(qū)和大理國家級(jí)經(jīng)濟(jì)開發(fā)區(qū)(圖1)。

表1 PCR擴(kuò)增體系Table 1 PCR amplification system

在配制的1%的瓊脂糖凝膠中，分別加入4 種引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，電壓100 V，電泳1 h，在紫外燈下進(jìn)行觀察分析，并記錄結(jié)果。然后將DNA指紋圖譜的變化情況進(jìn)行比對(duì)分析。

社區(qū)獲得性肺炎是呼吸系統(tǒng)常見的一種疾病，主要是由病原菌感染引起，常見的病原菌主要有結(jié)核桿菌、肺炎鏈球菌、肺炎支原體、金黃色葡萄球菌等［6］。研究發(fā)現(xiàn)，社區(qū)獲得性肺炎發(fā)病機(jī)制主要是因?yàn)?病原體大量聚集，造成了局部的感染，病原體也可以為呼吸道的正常菌毒性加強(qiáng)轉(zhuǎn)變而來，其聚集的途徑主要是通過空氣、血液以及呼吸道相關(guān)菌的誤吸等，患者呼吸道和自身免疫系統(tǒng)功能降低，對(duì)病原菌和病毒的抵抗能力減退而發(fā)?。?－8］。劉婧［9］指出社區(qū)獲得性肺炎患者發(fā)病后，抗凝血酶-Ⅲ和纖維蛋白原出現(xiàn)了紊亂，說明社區(qū)獲得性肺炎患者病情發(fā)展可能和凝血功能指標(biāo)有關(guān)。。

1.3.4 菌株的16S rRNA基因同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

1.3.3 RAPD分析

1.3.5 酸耐受性菌株的篩選

將PCR產(chǎn)物送交生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。序列與GenBank中已知菌株的rpoA基因序列進(jìn)行同源性分析，隨后用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

(1) 由于電機(jī)有較大幅度增容要求，冷卻器結(jié)構(gòu)體積需有較大增加，已不適應(yīng)原有的坑道面積，所以適合改為背包式安裝型式；

參照劉宏宇等[21]的方法，將供試菌株傳代2 次，將其接種至MRS培養(yǎng)基中，接種量為2%，37 ℃條件下培養(yǎng)14～16 h，離心去上清液，加入pH值為3.0的生理鹽水制成適宜濃度的菌懸液。迅速挑取少量的菌懸液，進(jìn)行稀釋，選取兩個(gè)最合適的稀釋度，分別在MRS瓊脂平板上涂布，在37 ℃條件下培養(yǎng)48 h，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，此時(shí)得到的活菌數(shù)就是0 h的起始數(shù)據(jù)。將剩余菌懸液放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育2 h，用相同的方法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率。

綜上所述，MCN-IC總體發(fā)病率較低，年齡≥60歲、腹痛、CA19-9≥37 U/ml、病灶邊界不清、壁結(jié)節(jié)和無分隔預(yù)示MCN-IC的可能，宜盡快手術(shù)治療。如無以上危險(xiǎn)因素，則MCN-nIC的可能性更大，進(jìn)行隨訪或非手術(shù)治療是可行的。

模板為各菌株的基因組DNA，將其管家基因RNA聚合酶α-亞基基因進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列和退火溫度見表2。

表2 管家基因的引物序列及PCR的退火溫度Table 2 Primer sequences for house-keeping genes and PCR annealing temperatures

1 μL模板DNA，1 μL引物，25 μL 2×TaqMaster Mix，22 μL無菌蒸餾水的50 μL PCR體系。第1步：95 ℃預(yù)熱5 min；第2步：95 ℃變性1 min，55 ℃退火75 s，72 ℃延伸65 s，進(jìn)行3 個(gè)循環(huán)；第3步：95 ℃變性35 s。退火75 s，72 ℃延伸65 s，進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)；第4步：72 ℃延伸7 min[22-23]。

待汪隊(duì)長(zhǎng)的怒氣發(fā)泄完了，他才使出三寸不爛之舌，從以人為本的高度講到人的本能，講到戰(zhàn)場(chǎng)紀(jì)律的嚴(yán)肅性和靈活性，從戰(zhàn)前的渴求講到犧牲后的不留遺憾，一直講得汪隊(duì)長(zhǎng)無話可說。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離與菌株形態(tài)

引物3：5’-CCGCAGCCAA-3’。PCR擴(kuò)增條件：第1步：94 ℃變性5 min，36 ℃退火5 min，72 ℃延伸5 min，進(jìn)行4 個(gè)循環(huán)；第2步：94 ℃變性1 min，36 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)；第3步：72 ℃、5 min。

將采集的10 份樣品分別稀釋涂布，再經(jīng)反復(fù)劃線純化，分離出在含2% CaCO3的MRS培養(yǎng)基上有溶鈣圈的菌株，其中有72 株革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性菌，初步確定其為乳酸菌。

澆水時(shí)掌握五澆五不澆，即晴天澆水，陰天不澆水；上午澆水，下午不澆水；澆溫水，不澆冷水；膜下澆暗水，不澆明水；要澆輕水，不澆大水，并注意澆水后放風(fēng)排濕。

2.1.2 乳酸菌菌株的形態(tài)學(xué)特性

1.3.6 篩選菌株管家基因rpoA的序列同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

從10 份農(nóng)家酸菜汁樣品中分離得到72 株乳酸菌。瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)、革蘭氏染色后顯微鏡下的菌體形態(tài)描述詳見表3。

表3 乳酸菌分離株菌落形態(tài)及顯微鏡下的菌體形態(tài)Table 3 Colonial morphology and microscopic morphology of LAB isolates

由表3可知，在10 份農(nóng)家酸菜汁樣品中分離得到乳酸菌菌株中，62 株分離菌株為乳酸菌桿菌，占所分離菌株的86%以上，為優(yōu)勢(shì)菌，叢敏等[24]也發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵第40天的東北傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜中含有豐富的乳酸菌，主要優(yōu)勢(shì)菌群為乳桿菌屬的菌株。這是由于所采集樣品為發(fā)酵后期的酸菜汁，pH值幾乎已經(jīng)達(dá)到發(fā)酵最低點(diǎn)，一般來說，乳桿菌的酸耐受性要好于乳酸球菌，所以，在發(fā)酵后期的酸菜汁中乳桿菌為優(yōu)勢(shì)菌群。其余10 株分離到的乳酸菌菌株可能為腸球菌，因?yàn)榭偟膩碚f，在乳酸菌中腸球菌屬菌株的酸耐受性也很強(qiáng)，仍需要進(jìn)一步的鑒定，武俊瑞[25]也在采用傳統(tǒng)方法自然發(fā)酵成熟的酸菜發(fā)酵液中分離到少量腸球菌，約占所分離菌株的12%。

在偵查決策過程中，為了實(shí)現(xiàn)偵查目的，人們往往追求最優(yōu)決策，進(jìn)而根據(jù)最優(yōu)決策來實(shí)施偵查行為。所謂最優(yōu)決策，是指從全部可行方案中選出的能實(shí)現(xiàn)目標(biāo)的最優(yōu)方案。但是偵查所面對(duì)的是復(fù)雜多變的刑事案件，且在偵查過程中存在著偵查人員與犯罪分子之間的活力對(duì)抗，因而偵查最優(yōu)決策往往很難實(shí)現(xiàn)，因而偵查決策大多數(shù)屬于一種滿意原則下的決策。

2.2 乳酸菌的初步鑒定

2.2.1 RAPD分析

根據(jù)菌株的菌落表型及細(xì)胞形態(tài)，選取34 株菌落表型及細(xì)胞形態(tài)差異較大的菌株進(jìn)行RAPD分析。4 種引物的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后，在紫外燈下觀察，供試菌株的DNA指紋圖譜如圖1所示。

圖1 不同乳酸菌的RAPD-PCR指紋圖譜Fig. 1 RAPD-PCR fingerprinting patterns for LAB strains

由圖1A引物1擴(kuò)增得到的指紋圖譜可見，菌株26#和36#為同型，菌株49#和59#為同型，菌株66#和54#為同型。由圖1B引物2擴(kuò)增得到的指紋圖譜可見，菌株11#和17#為同型，菌株34#、26#、55#、68#和36#為同型，菌株52#、59#、66#、49#和54#為同型，菌株35#、22#和30#為同型。由圖1C引物3擴(kuò)增得到的指紋圖譜可見，菌株11#和17#為同型，菌株49#、52#和59#為同型，菌株66#和54#為同型，菌株22#和47#為同型。由圖1D引物4擴(kuò)增得到的指紋圖譜可見，菌株11#和17#為同型，菌株43#和67#為同型，菌株26#和36#為同型。

行政事業(yè)單位的內(nèi)部控制體制應(yīng)該以《行政事業(yè)單位內(nèi)部控制規(guī)范 (試行)》為核心依據(jù)，結(jié)合各單位的實(shí)際發(fā)展和員工構(gòu)成情況，從每個(gè)細(xì)節(jié)入手，全面落實(shí)內(nèi)部控制的各項(xiàng)內(nèi)容。首先，單位應(yīng)該建立內(nèi)部控制標(biāo)準(zhǔn)，通過這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的約束力實(shí)施檢測(cè)員工的工作情況和部門的運(yùn)行情況，在整個(gè)行政事業(yè)單位實(shí)行體制化的管理模式?？茖W(xué)的內(nèi)部控制管理體系應(yīng)該遵循我國當(dāng)前經(jīng)濟(jì)發(fā)展的狀況，把握國家政策方針，以培養(yǎng)員工積極性和內(nèi)控意識(shí)為出發(fā)點(diǎn)，按照當(dāng)今環(huán)境的需求進(jìn)行改革工作。

綜上所述，通過4 種引物的擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖分析比較并結(jié)合菌株分離時(shí)的生長(zhǎng)活力，挑選出21 株指紋圖譜不相同的菌株進(jìn)行16s rRNA鑒定，21 株乳酸菌分別為：菌株8#、11#、16#、19#、20#、22#、32#、34#、41#、43#、44#、46#、48#、53#、56#、59#、60#、62#、63#、71#、72#。

截至17日上午，青海省水利廳派出的2批13支供水工程應(yīng)急搶險(xiǎn)救災(zāi)小分隊(duì)共220余人，全部到達(dá)抗震救災(zāi)第一線，并有針對(duì)性地開展工作，累計(jì)提供的救災(zāi)物資折合人民幣達(dá)到500萬元。4月17日，青海省水利廳訂購的生命吸管有400套運(yùn)往災(zāi)區(qū)。

2.2.2 分離菌株的16S rRNA基因同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

21 株疑似乳酸菌基因組PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2。可以看出，21 條目的片段都在1 500 bp左右，且條帶清晰。

將擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)定所得序列通過BLAST與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知菌株序列進(jìn)行比對(duì)，用MEGA 6.0軟件進(jìn)行序列分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。

懷孕后準(zhǔn)媽媽要做很多種檢查，這些檢查分為常規(guī)檢查和特殊檢查，各種預(yù)防出生缺陷的高危篩查就屬于特殊檢查。出生缺陷是指嬰兒出生前在母體子宮里發(fā)生的發(fā)育異常以及身體某些部位存在的畸形，例如無腦兒、腦脊膜膨出、呆小癥、兔唇、先天性心臟病、先天愚型等，其中最主要的是預(yù)防先天性疾病和遺傳性疾病，唐氏綜合征就是其中最重要的一種。

已有研究表明，植物乳桿菌、干酪乳桿菌、彎曲乳桿菌、短乳桿菌等是泡菜中發(fā)揮優(yōu)良作用的乳酸菌種類[26]。本研究中，根據(jù)同源性檢索分析并結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹中21 株乳酸菌的分類學(xué)位置，確定在分離得到的21 株乳酸菌中，15 株菌為乳桿菌，6 株為腸球菌。其中菌株8#為乳腸球菌（Enterococcus lactis），菌株11#、16#、19#和60#為彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus），菌株20#為米曲霉乳桿菌（L. oryzae），菌株22#、34#和62#為短乳桿菌（L. brevis），菌株32#、53#和63#為副干酪乳桿菌（L. paracasei），菌株41#和72#為棒狀乳桿菌（L. coryniformis）。由于植物乳桿菌（L. plantarum）JCM 1149和戊糖乳桿菌（L. pentosus）ATCC8041的16S rDNA序列同源性大于99%，通過16S rDNA序列分析無法確定菌株43#、56#和59#的分類學(xué)地位，僅能確定菌株43#、56#和59#都屬于乳桿菌。而E. gilvus ATCC BAA-350、E. avium ATCC 14025、E. raffinosus NCIMB 12901和E. malodoratus LMG 10747之間的16S rDNA序列同源性也大于99%，因此菌株44#、46#、48#和71#僅能確定都屬于腸球菌，需進(jìn)一步的鑒定實(shí)驗(yàn)才能確定其具體的分類學(xué)地位。但是，劉曉輝等[27]研究發(fā)現(xiàn)，泡菜中不僅能分離出乳桿菌，還分離出了腸膜明串珠菌。這是因?yàn)樵谂莶税l(fā)酵過程中，每個(gè)時(shí)間段的微生物比例有所不同，由于酸菜樣品采集的時(shí)間不同，該時(shí)間段的優(yōu)勢(shì)菌種也不同[28]。

圖2 乳酸菌16S rRNA基因擴(kuò)增電泳圖Fig. 2 Electrophoresis pattern of PCR amplified 16S rRNA gene from lactic acid bacteria

圖3 乳酸菌16S rRNA基因序列的遺傳進(jìn)化樹分析Fig. 3 Phylogenetic tree of Lactobacillus based on 16S rRNA gene sequences

2.3 乳酸菌酸耐受性結(jié)果

從表4可以看出，21 株受試乳酸菌在pH 3.0的環(huán)境中孵育2 h后，其存活率差異較大，從25.3%～99.1%不等。其中存活率在75%以上的乳酸菌有8 株，分別是菌株8#、11#、16#、53#、56#、59#、60#、62#。菌株53#、59#、62#三株菌的存活率在90%以上，其中59#的存活率達(dá)到了99%以上，耐酸性最好。這與Huang[29]和Millette[30]等的研究結(jié)果一致，不但不同乳酸菌菌種的酸耐受性之間有差異，而且相同菌種的不同菌株之間的酸耐受性差異也非常大。

表4 pH 3.0對(duì)乳酸菌存活率的影響Table 4 Survival rate of LAB strain at pH 3.0%

2.4 篩選菌株的rpoA基因同源性分析

由于僅憑16S rDNA序列分析無法確定篩選的耐酸性菌株中56#和59#的分類學(xué)地位，因此為了將來菌株56#和59#在食品工業(yè)中的應(yīng)用，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來確定它們的分類學(xué)地位，本研究進(jìn)行了管家基因rpoA的同源性分析。篩選菌株56#和59#的管家基因rpoA系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4。

圖4 乳酸菌rpoA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4 Phylogenetic tree of L. curvatus based on rpoA sequences

菌株56#與L. paraplantarumLMG 16673T的rpoA基因序列同源性為99.6%，結(jié)合圖4系統(tǒng)發(fā)育樹中它們相應(yīng)的系統(tǒng)發(fā)育位置，確定菌株56#為L(zhǎng). paraplantarum，菌株59#和菌株L. plantarumsubsp.plantarumLMG 6907和L. arizonensisLMG 19807的rpoA基因序列同源性分別為100%和99.3%，因此，結(jié)合圖4系統(tǒng)發(fā)育樹中其相應(yīng)的系統(tǒng)發(fā)育位置，確定菌株59#是植物乳桿菌植物亞種（L. plantarumsubsp.plantarum）。與李欣等[20]的研究結(jié)果相比，本研究的結(jié)果更加準(zhǔn)確完善。因?yàn)橐话憷脗鹘y(tǒng)的16S rDNA分子生物學(xué)鑒定方法和生理生化特征可以將乳酸菌菌株鑒定到種的水平，但無法準(zhǔn)確鑒定L. plantarum和L. pentosus。隨著微生物分類學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，新的乳酸菌菌種不斷被發(fā)現(xiàn)，近年來管家基因被用來在種的水平上鑒別乳酸菌菌株，是用于鑒定爭(zhēng)議菌株的有力工具，具有快速簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、高區(qū)分力的特點(diǎn)，是檢測(cè)物種最有效的方法[23]。本研究進(jìn)一步利用管家基因rpoA的同源性分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的方法來準(zhǔn)確的確定篩選菌株56#和59#的分類學(xué)地位。

3 結(jié) 論

從傳統(tǒng)酸菜汁中分離得到的72 株乳酸菌中包括62 株乳桿菌和10 株乳球菌，其中21 株乳酸菌的指紋圖譜不相同。16S rDNA序列同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹可以鑒定出有1 株乳腸球菌，4 株彎曲乳桿菌，1 株米曲霉乳桿菌，3 株短乳桿菌，3 株副干酪乳桿菌，2 株棒狀乳桿菌，剩余3 株為乳桿菌，4 株為腸球菌。21 株乳酸菌菌株中有8 株菌的耐酸性較好，在pH 3.0條件下存活率在75%以上，其中3 株的耐酸性最好，存活率達(dá)到90%以上；進(jìn)一步的管家基因rpoA序列同源性分析，確定篩選出的兩株強(qiáng)耐酸性菌株分別為L(zhǎng). paraplantarum和L. plantarumsubsp.plantarum。本研究篩選出的耐酸性乳酸菌菌株均來自傳統(tǒng)自然發(fā)酵的酸菜，通過16S rDNA序列和管家基因同源性分析及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹精確地確定了它們的分類學(xué)地位，為其進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。