響應(yīng)面法分析優(yōu)化藤梨枝提取工藝研究

師延瓊 孫萬群（通訊作者）

（上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院藥劑科 上海 200031）

藤梨枝為獼猴桃科中華獼猴桃的干燥枝[1]。現(xiàn)代藥理研究表明，藤梨根對(duì)鼠胃癌細(xì)胞具有抑制作用[2]，總黃酮可能是藤梨根抗癌的主要物質(zhì)基礎(chǔ)之一[3]。但對(duì)藤梨枝的研究報(bào)道較少。應(yīng)面分析法（RSM）是一種篩選工藝比較好的方法，能篩選各個(gè)因素和因素之間相互作用在工藝優(yōu)選中對(duì)評(píng)價(jià)指標(biāo)即響應(yīng)值的影響，可表達(dá)因素和評(píng)價(jià)指標(biāo)之間的關(guān)系[4]。其通過軟件擬合二項(xiàng)式模型，得出優(yōu)化參數(shù)，以更好反映實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果[5]。本實(shí)驗(yàn)引入中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)合效應(yīng)面法優(yōu)選藤梨枝的提取工藝，旨在優(yōu)化醇提取工藝的同時(shí)，為響應(yīng)面法應(yīng)用于中藥提取工藝的可行性提供依據(jù)。

1.資料與方法

1.1 儀器

JY2002電子天平、DHG-9140電熱鼓風(fēng)干燥箱、KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器、GB-204電子天平、60-A型多功能切片機(jī)、UV750紫外分光光度儀等。

1.2 試劑與試藥

蘆丁對(duì)照品（080-9002）由中國生物制品檢定所提供；純化水；甲醇、95%乙醇、NaNO2、硝酸鋁、NaOH、鹽酸等均為分析純。

1.3 樣品中總黃酮含量測定

1.3.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取對(duì)照品溶液適量，加甲醇制成每毫升含0.2056mg的溶液，即得。

1.3.2 供試品溶液的制備 取藥材1g，10倍量60%乙醇，超聲提取1次，20min/次，精密吸取1ml稀釋至10ml，搖勻，即得。

1.3.3 顯色條件 精密吸取1ml置10ml容量瓶中，加5%NaNO2溶液0.4ml，混勻，放置6min，加10%硝酸鋁溶液0.4ml，搖勻，放置6min，加NaOH溶液4ml，再加水置刻度，搖勻，放置15min，以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外-可見分光光度法，在500nm波長處測定吸光度。

1.4 單因素試驗(yàn)考察

1.4.1 提取時(shí)間考察 取藥材1g三份，加10ml 60%乙醇，超聲提取3次，提取時(shí)間分別為20min、40min、60min，濾液合并。取0.5ml顯色，測吸光度。

1.4.2 溶媒倍量考察 藥材1g三份，分別加入10ml、20ml、30ml60%乙醇超聲提取1次，20min/次。取適量供式品稀釋顯色，測吸光度。

1.4.3 提取次數(shù)考察 藥材1g，分別用10ml60%乙醇超聲提取3次，20min/次。取適量供式品顯色，測吸光度。

1.5 中心組合設(shè)計(jì)優(yōu)選提取工藝條件

采用響應(yīng)面法將上述3個(gè)影響因素作為自變量，將藤梨枝總黃酮含量作為響應(yīng)結(jié)果。

2.結(jié)果

2.1 總黃酮含量測定線性范圍

2.1.1 檢測波長的確定 取對(duì)照品溶液標(biāo)準(zhǔn)系列中含量為0.4861mg的蘆丁對(duì)照品溶液。以相應(yīng)試劑為空白對(duì)照，以200～800nm波長掃描，測定總黃酮在510nm波長處有最大吸收值。

2.1.2 線性關(guān)系考察 精密稱取無水蘆丁對(duì)照品適量進(jìn)行1.2.3中顯色處理，以相應(yīng)試劑為空白，在500nm波長處測定吸光度。以蘆丁含量為橫坐標(biāo)，以測得的吸光度為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程為：Y=11.987，X-0.0869，（R2=0.9998）。表明在0.2056mg～0.8224mg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 提取時(shí)間考察 采用20min、40min、60min超聲的總黃酮提取率分別為1.05%、0.99%、1.10%，無顯著差異，確定超聲時(shí)間為20min/次。

2.2.2 溶媒倍量考察 加入溶媒10倍、20倍、30倍的總黃酮提取率分別為2.61%、2.24%、2.50%，無顯著差異，確定溶媒倍量為10倍。

2.2.3 超聲次數(shù)考察 提取兩次時(shí)，總黃酮的提取率達(dá)到了88.40%，見表。

表 超聲時(shí)間考察結(jié)果（%）

2.3 中心組合設(shè)計(jì)優(yōu)選水提工藝條件

2.3.1 總黃酮含量方程式 根據(jù)以上結(jié)果，由Box-Behnken試驗(yàn)擬合出的總黃酮含量Y對(duì)超聲時(shí)間X1、溶媒倍量X2、超聲次數(shù)X3的二次多項(xiàng)回歸方程為:Y=-0.24122+0.11663*X1-0.11761*X3+8.33333E-004*X1*X2+0.026000*X1*X3+3.33333E-003*X2*X3-4.12000E-003*X12+1.61111E-003*X22-0.71200*X32。

2.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化與分析 根據(jù)二次多項(xiàng)式方程，分別回執(zhí)指標(biāo)與與響應(yīng)顯著的交互項(xiàng)的響應(yīng)曲面圖和等高線圖，比較圖1～圖3中響應(yīng)曲面圖可知，超聲時(shí)間和超聲次數(shù)的交互作用對(duì)總黃酮的含量最為顯著。根據(jù)實(shí)際情況及可操作性，調(diào)整后最佳提取工藝條件為超聲時(shí)間25min，加水倍量10倍，提取次數(shù)2次。

圖1

圖2

圖3

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

按修正過的最佳條件進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)的總黃酮含量（%）分別為2.53、2.51、2.52，平均值為2.52。

3.討論

甲醇法是目前提取藤梨根黃酮用的比較多的方法，考慮到甲醇的毒性以及工藝的安全，乙醇替代甲醇并超聲輔助提取藤梨根黃酮[6]。本實(shí)驗(yàn)中。采用超聲和回流提取總黃酮，根據(jù)試驗(yàn)所測結(jié)果表明，兩種方法所得總黃酮含量都較高，沒有顯著差異性。為了實(shí)驗(yàn)簡便、快速及減小試驗(yàn)操作中的人為誤差，最終采用超聲作為藤梨枝藥材總黃酮含量測定的制備方法。藤梨枝溶媒篩選時(shí)，選取了40%、60%、80%三個(gè)濃度的乙醇，超聲提取3次，合并濾液，測得60%乙醇提取率最高，確定60%乙醇作為提取溶媒。本實(shí)驗(yàn)以藤梨枝中主要成分總黃酮含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用響應(yīng)面法優(yōu)選最佳提取工藝研究，確定了最優(yōu)的提取條件為加60%乙醇10倍，提取2次，每次25min。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該工藝穩(wěn)定可行。