TRAF-6調(diào)控TGF-β1-Smad2/Smad3信號(hào)通路在Graves病免疫發(fā)病機(jī)制中的作用①

譚 燕 鄭曉雅 李 莎 劉 純

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，重慶400016)

Graves 病(Graves′ disease,GD)是一種常見的自身免疫性甲狀腺疾病，可釋放過量甲狀腺激素而導(dǎo)致甲狀腺功能亢進(jìn)，進(jìn)而引起多器官損害。目前，GD的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。Th17細(xì)胞是一種新發(fā)現(xiàn)的CD4+T細(xì)胞亞群，能夠分泌白介素-17A/F(Interleukine-17A/F,IL-17A/F)等多種效應(yīng)細(xì)胞因子[1]。前期研究發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞及其效應(yīng)因子IL-17參與GD的發(fā)病過程[2]。維甲酸相關(guān)孤兒受體γt(Retinoid-related orphan receptor gamma t,RORγt) 是Th17細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)Th17細(xì)胞的分化和IL-17的表達(dá)。Treg細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞的另一種細(xì)胞亞型，可以直接發(fā)揮免疫抑制作用，也可以通過分泌調(diào)節(jié)免疫的IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(Transforming growth factor-β，TGF-β)抑制細(xì)胞免疫[3-7]。Treg細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子在GD的發(fā)病過程中發(fā)揮免疫抑制的作用[8]。叉頭蛋白P3(Forkhead box protein p3,Foxp3)是Treg細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子，控制Treg細(xì)胞的發(fā)育和功能。Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的分化相互抑制，功能相互調(diào)節(jié)，在機(jī)體正常狀況下保持平衡，而Th17/Treg細(xì)胞失衡參與多種自身免疫性疾病的發(fā)生[9,10]，包括 GD[8]。然而，Th17/Treg細(xì)胞平衡的上游調(diào)控機(jī)制仍不清楚，有待進(jìn)一步研究。研究發(fā)現(xiàn)，IL-2可作為分化信號(hào)誘導(dǎo)初始CD4+T細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化，同時(shí)抑制Th17細(xì)胞的分化，進(jìn)而調(diào)控Th17/Treg細(xì)胞平衡[11-15]。耿明霞等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，IL-2在GD中表達(dá)降低，參與GD的發(fā)生過程。因此，IL-2可能通過調(diào)控Th17/Treg細(xì)胞平衡，進(jìn)而阻礙GD的發(fā)生。IL-2的表達(dá)在各個(gè)水平上都受到精密調(diào)控，過高或過低均會(huì)引起機(jī)體免疫功能紊亂。

近來研究表明，除了介導(dǎo)免疫炎癥，腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子-6(Tumor necrosis factor receptor-associated factor-6,TRAF-6)在維持免疫耐受方面也具有重要意義[17-19]。新近研究發(fā)現(xiàn)，TRAF-6可能通過阻礙TGF-β介導(dǎo)的Smad2/Smad3磷酸化而上調(diào)IL-2的表達(dá)，進(jìn)而抑制Th17細(xì)胞的分化，控制炎癥的發(fā)生，發(fā)揮免疫耐受的作用[20]。同時(shí)，TRAF-6在維持Treg細(xì)胞的擴(kuò)增和穩(wěn)定性中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并參與免疫耐受[21]。此外，TGF-β1在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)[22]。因此，TRAF-6可能通過下調(diào)TGF-β1介導(dǎo)的Smad2/Smad3磷酸化，解除對(duì)IL-2表達(dá)的抑制，進(jìn)而調(diào)控效應(yīng)T細(xì)胞的分化，參與維持免疫耐受。前期研究發(fā)現(xiàn)，GD患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中TRAF-6的mRNA和蛋白的表達(dá)較對(duì)照組減少，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[23]，提示TRAF-6可能通過發(fā)揮免疫耐受的作用，參與GD的發(fā)病。然而，在GD的發(fā)病過程中，TRAF-6是否發(fā)揮免疫耐受的作用及其具體的作用機(jī)制目前尚不清楚。因此，本研究旨在探索TRAF-6是否通過影響TGF-β1-Smad2/Smad3的磷酸化，解除對(duì)IL-2表達(dá)的抑制，調(diào)控Th17/Treg細(xì)胞的分化平衡，進(jìn)而在GD的發(fā)生中發(fā)揮免疫耐受的作用。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1研究對(duì)象 收集2016年11月至2017年6月在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科就診的GD病患者和參加體檢的健康人，將志愿者分為初診GD組、甲狀腺功能恢復(fù)正常的GD(eGD)組和對(duì)照組(NC)。根據(jù)2008年《中國(guó)甲狀腺疾病診治指南》[24]，初診GD組納入標(biāo)準(zhǔn)：首次診斷為 GD 且未服用任何抗甲狀腺藥物的患者，伴有甲狀腺功能亢進(jìn)的癥狀和體征;均有不同程度彌漫性甲狀腺腫大；血漿游離三碘甲狀腺原氨酸(Free triiodothyronine,FT3)或游離甲狀腺激素(Free thyroxine,FT4)升高及敏感促甲狀腺激素(Ultra-sensitive thyroid stimulat-ing hormono,uTSH)降低;血漿抗促甲狀腺素受體抗體(Thyrotrophin receptor antibody，TRAb)呈不同程度陽(yáng)性。 GD組共30例患者，其中23例女性，7例男性。eGD組納入標(biāo)準(zhǔn)：既往明確診斷為 GD 的患者，經(jīng)抗甲狀腺藥物治療時(shí)間≥1 年且甲狀腺功能恢復(fù)正常，現(xiàn)甲巰咪唑(賽治) 維持治療劑量5～10 mg/d的GD患者。eGD組共30例患者，其中19例女性，11例男性。NC組納入標(biāo)準(zhǔn)：性別及年齡匹配的健康人。NC組共28例，其中16例女性，12例男性。所有入選對(duì)象均需排除患有1型糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自身免疫性肝炎等常見的自身免疫性疾病、急性感染及慢性炎癥性疾病等且過敏、妊娠、長(zhǎng)期口服任何非甾體類或糖皮質(zhì)激素類藥物的患者。

1.1.2實(shí)驗(yàn)材料 人淋巴細(xì)胞分離液(天津TBD生物技術(shù)發(fā)展中心，中國(guó))；RNAiso Plus、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒 (TaKaRa，日本)；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE配制凝膠試劑盒(碧云天，中國(guó))；預(yù)染蛋白Marker Ladder(Thermo，美國(guó))；磷酸酶抑制劑(Roche，美國(guó))；ECL試劑盒(Advansta，美國(guó))；兔抗人β-actin、兔抗人TRAF-6、兔抗人Smad2/Smad3、兔抗人磷酸化Smad2、兔抗人磷酸化Smad3抗體(CST，美國(guó))；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，中國(guó))；脫脂奶粉(Bio-Rad，美國(guó))；PVDF膜(Millipore，美國(guó))；人IL-17、人IL-10、人IL-2、人TGF-β1 ELISA試劑盒(USCN，美國(guó));甲狀腺功能、甲狀腺自身抗體試劑盒(貝克曼庫(kù)爾特,美國(guó))和檢測(cè)儀器(Beckman Coulter UniCel DxI 800)；熒光定量PCR儀(CFX 96 Real-Time System，Bio-Rad，美國(guó))。

1.2方法

1.2.1樣本采集 采集研究對(duì)象靜脈血12 ml于EDTA抗凝真空采血管內(nèi)，其中2 ml靜脈血用于檢測(cè)甲狀腺功能和甲狀腺自身抗體，余下10 ml靜脈血用于PBMCs的提取。

1.2.2甲狀腺功能和甲狀腺自身抗體的檢測(cè) 甲狀腺功能(FT3,FT4,uTSH)以及自身抗體包括甲狀腺球蛋白抗體(Thyroglobulin antibody,TGAb),甲狀腺過氧化物酶抗體(Thyroid peroxidase antibody,TPOAb)和TRAb檢測(cè)采用美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特測(cè)定儀及其試劑，利用化學(xué)發(fā)光免疫分析法，由本科室專職實(shí)驗(yàn)人員完成。甲狀腺功能及其自身抗體的參考值：FT3為2.5～3.9 pg/ml；FT4為0.61～1.12 ng/dl；uTSH為0.35～3.5 uU/ml；TPOAb為0～9 U/ml；TGAb為0～4 U/ml；TRAb為0.3～1.8 U/L。

1.2.3PBMCs的分離 采用 Ficoll密度梯度離心法，分離的總PBMCs中將三分之一細(xì)胞(約3×106～4×106) 用于RNA提取，余下約三分之二PBMCs(約6×106～8×106)用于總蛋白提取。

1.2.4總RNA的提取和熒光定量RT-PCR法測(cè)定RORγt、Foxp3、IL-2和TRAF-6 mRNA的表達(dá) 細(xì)胞總RNA的提取按照RNAiso Plus的說明書進(jìn)行。cDNA 按照 Prime-ScriptTMRT reagent Kit 的說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成。RORγt、Foxp3、IL-2和TRAF-6 mRNA的引物序列見表1。熒光定量 PCR反應(yīng)條件為95℃、30 s；95℃、5 s,60℃、30 s，重復(fù) 40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系：cDNA 1.0 μl，上游引物0.4 μl，下游引物 0.4 μl，SYBE GREEN 5.0 μl，DEPC水3.2 μl。以NC組作對(duì)照，計(jì)算各組RORγt、Foxp3、IL-2和TRAF-6 mRNA的2-ΔΔCt，獲取各組目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5ELISA 法測(cè)定 IL-17A、IL-10、IL-2、TGF-β1的表達(dá) 取患者和健康人血清，ELISA法測(cè)定IL-17A、IL-10、IL-2、TGF-β1的表達(dá)，具體操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.6Western blot測(cè)定總Smad2/Smad3、p-Smad2/Smad3和TRAF-6蛋白的表達(dá) 以細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，等量的蛋白樣品行聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，電轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜。TBST 洗膜 3次，每次5 min，脫脂奶粉常溫封閉4 h，TBST洗膜3次，每次5 min。加入兔抗人 p-Smad2單抗(1∶1 000)、兔抗人 p-Smad3單抗(1∶1 000)、兔抗人Smad2/Smad3單抗(1∶1 000)、兔抗人 TRAF-6單抗(1∶1 000)、兔抗人β-actin單抗(1∶ 3 000) ，4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min，將膜放入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶5 000) ，室溫孵育 1 h，TBST沖洗后，ECL法顯色。Fusion凝膠成像系統(tǒng)掃描，并分析各陽(yáng)性條帶的吸光度值，設(shè)內(nèi)參β-actin作為對(duì)照，目標(biāo)蛋白的相對(duì)含量以目標(biāo)蛋白/β-actin 比值來表示。

表1 RORγt、Foxp3、IL-2、TRAF-6、β-actin mRNA的引物序列

Tab.1 Primer sequences for RORγt，F(xiàn)oxp3，IL-2，TRAF-6，β-actin mRNA

PrimersSequencesbpRORγtF 5′GTGCTGGTTAGGATGTGCCG3′143R 5′GCAATCTCATCCTCGGAAAAGT3′Foxp3F 5′AGAAGGGCAGGGCACAATG3′151R 5′TCGGATGATGCCACAGATGAA3′IL-2F 5′GATGAACTTGGACCTCTGCGG3′184R 5′ATCTCCTCAGAAAGTCCACCACA3′TRAF-6F 5′GGATTCTACACTGGCAAACCCG3′137R 5′CCAAGGGAGGTGGCTGTCATA3′β-actinF 5′CCACGAAACTACCTTCAACTCC3′132R 5′GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT3′

2 結(jié)果

2.1甲狀腺功能和甲狀腺自身抗體的表達(dá)水平 三組甲狀腺功能和甲狀腺自身抗體的表達(dá)水平見表2。

2.2三組RORγt、Foxp3、IL-2、TRAF-6的mRNA表達(dá)水平 與NC組相比，GD組中RORγt mRNA 的表達(dá)水平升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與NC組相比，GD組中Foxp3和IL-2 mRNA表達(dá)水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但RORγt、Foxp3、IL-2 mRNA表達(dá)水平在GD組和eGD組之間、eGD組和NC組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；GD組中TRAF-6 mRNA的表達(dá)水平與eGD組、NC組相比降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但eGD組和NC組之間水平表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。

2.3三組細(xì)胞因子IL-17A、IL-10、IL-2、TGF-β1的表達(dá) GD組中IL-17A蛋白的表達(dá)水平較NC組增高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；IL-10、IL-2和TGF-β1蛋白的表達(dá)水平較NC組降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但這些差異在GD組和eGD組之間、eGD組和NC組之間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

2.4PBMCs中p-Smad2/Smad3、TRAF-6蛋白的表達(dá) GD組中p-Smad2/Smad3的蛋白表達(dá)水平均高于NC組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而GD組中TRAF-6蛋白的表達(dá)水平有一定的下降趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；這些差異在GD組與eGD組之間、eGD組和NC組之間也均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3、4。

2.5相關(guān)性分析 GD組中，IL-2 mRNA與IL-17A蛋白之間的表達(dá)水平正相關(guān)(r=0.423,P=0.020)，IL-2 mRNA分別與RORγt mRNA、Foxp3 mRNA、IL-10蛋白之間的表達(dá)水平均不相關(guān)(r=0.098,P=0.618;r=-0.177,P=0.351;r=-0.031,P=0.872)。IL-2蛋白分別與RORγt mRNA、IL-17A蛋白、Foxp3 mRNA、IL-10蛋白之間的表達(dá)水平均不相關(guān)(r=-0.122,P=0.535;r=-0.199,P=0.291;r=0.090,P=0.635;r=0.180,P=0.342)。GD組中p-Smad2蛋白與IL-2 mRNA之間的表達(dá)水平負(fù)相關(guān)(r=-0.631,P=0.000)，p-Smad2蛋白與IL-2 蛋白之間的表達(dá)水平不相關(guān)(r=-0.217,P=0.249)。GD組中p-Smad3蛋白分別與IL-2 mRNA、IL-2蛋白之間的表達(dá)水平不相關(guān)(r=-0.250,P=0.183;r=-0.210,P=0.266)。GD組中，TRAF-6 mRNA分別與p-Smad2蛋白、p-Smad3蛋白之間的表達(dá)水平不相關(guān)(r=-0.275,P=0.141;r=-0.216,P=0.251)。TRAF-6 蛋白與p-Smad2蛋白之間表達(dá)水平正相關(guān)(r=0.382,P=0.037)，TRAF-6蛋白與p-Smad3蛋白之間的表達(dá)水平不相關(guān)(r=0.108,P=0.570)，見圖5。

GDeGDNCPn(M/F)7/2311/1912/160.278Age(years)34.67±11.62 37.93±11.0939.61±12.440.266FT3(pg/ml)8.02±5.571)2)3.59±1.633.58±0.340.000FT4(ng/dl)3.11±1.471)2)0.86±0.560.80±0.100.000uTSH(uU/ml)0.08±0.241)2)2.99±2.322.09±1.000.000TRAb (U/L)14.18±11.581)2) 4.44±10.291)0.54±0.330.000TPOAb(U/ml)184.67±318.431) 99.15±240.311)1.99±2.010.000TGAb(U/ml)77.51±88.671)2) 17.61±22.721)0.22±0.180.000

Note：Compared with NC group,1)P<0.05;compared with eGD group,2)P<0.05.

圖1 三組RORγt、Foxp3、IL-2、TRAF-6 mRNA的表達(dá)水平Fig.1 mRNA expression of RORγt,Foxp3,IL-2 and TRAF-6 in three groupsNote: Compared with NC group,*.P<0.05;compared with eGD group,#.P<0.05.

圖2 三組細(xì)胞因子IL-17A、IL-10、IL-2、TGF-β1的表達(dá)水平Fig.2 Expression of IL-17A，IL-10，IL-2 and TGF-β1 in three groupsNote: Compared with NC group,*.P<0.05.

圖3 三組中p-Smad2/Smad3、總Smad2/Smad3、TRAF-6蛋白的表達(dá)Fig.3 Protein expression of p-Smad2/Smad3,total Smad2/Smad3 and TRAF-6 detected by West-ern blot

圖4 定量分析p-Smad2/Smad3和TRAF-6蛋白在PBMCs中的表達(dá)Fig.4 Quantitative analysis of p-Smad2/Smad3 and TRAF-6 expression in PBMCsNote: Compared with NC group,*.P>0.05.

圖5 GD患者相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性分析Fig.5 Correlation between relevant indicators in Graves′ disease patientsNote: A-D.Correlation between IL-2 mRNA and RORγt mRNA,Foxp3 mRNA,IL-17A protein,IL-10 protein;E-H.Correlation between IL-2 protein and RORγt mRNA,Foxp3 mRNA,IL-17A protein,IL-10 protein;I-J.Correlation between p-Smad2 protein and IL-2 mRNA,IL-2 protein;K-L.Correlation between p-Smad3 protein and IL-2 mRNA,IL-2 protein;M-N.Correlation between TRAF-6 mRNA and p-Smad2 protein,p-Smad3 protein;O-P.Correlation between TRAF-6 protein and p-Smad2 protein,p-Smad3 protein.

3 討論

GD的發(fā)病與效應(yīng)性T細(xì)胞分化失衡有關(guān)，本研究旨在探討效應(yīng)T細(xì)胞分化失衡的上游免疫耐受調(diào)控機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞均在GD的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用[2,8]，在本實(shí)驗(yàn)中，GD組的RORγt mRNA和IL-17A蛋白的表達(dá)均較NC組增加。這與前期研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[2]，提示Th17細(xì)胞的表達(dá)增加可能促進(jìn)GD的發(fā)病。同時(shí)，GD組的Foxp3 mRNA和IL-10蛋白的表達(dá)均較NC組減少，提示Treg細(xì)胞的表達(dá)減少可能誘發(fā)GD的發(fā)生。這與楊渝等[25]的研究結(jié)果趨勢(shì)一致。因此，Th17/Treg細(xì)胞平衡破環(huán)可能導(dǎo)致GD的發(fā)病。但調(diào)控Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞分化和功能的上游具體機(jī)制仍不完全清楚。

研究表明，IL-2作為分化信號(hào)作用于初始CD4+T細(xì)胞后，能通過STAT5信號(hào)通路抑制RORγt的表達(dá)和Th17細(xì)胞的分化，同時(shí)能促進(jìn)Foxp3的表達(dá)和Treg細(xì)胞的分化[11-15,26]，進(jìn)而調(diào)控Th17/Treg細(xì)胞平衡。在本實(shí)驗(yàn)中，IL-2的mRNA和蛋白表達(dá)較NC組均減少，這與謝克儉等[27]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，提示IL-2的低表達(dá)可能促進(jìn)GD的發(fā)病，但他們的研究?jī)H探討了IL-2表達(dá)降低與GD發(fā)生的關(guān)系，我們的研究探討了IL-2通過調(diào)控Th17/Treg細(xì)胞分化平衡，進(jìn)而參與GD的發(fā)病。以上研究結(jié)果充分說明了在GD的發(fā)生發(fā)展過程中，IL-2的低表達(dá)可能無法有效激活STAT5信號(hào)通路，導(dǎo)致RORγt 和Th17細(xì)胞的表達(dá)增加，分泌更多的IL-17效應(yīng)炎癥因子，同時(shí)抑制Foxp3和Treg細(xì)胞的表達(dá)，使免疫調(diào)節(jié)因子IL-10的表達(dá)減少，進(jìn)而引起Th17/Treg細(xì)胞失衡。但是，如何導(dǎo)致IL-2的表達(dá)減少，進(jìn)而引起Th17/Treg細(xì)胞失衡的免疫過程仍不清楚。

在本實(shí)驗(yàn)中，GD組的p-Smad2/Smad3蛋白表達(dá)較NC組雖然差異均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但都展示出增加的趨勢(shì)，這提示高表達(dá)的p-Smad2/Smad3蛋白可能導(dǎo)致GD的發(fā)生，而GD組與NC組之間蛋白表達(dá)的差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是由于GD中TGF-β1的表達(dá)減少，導(dǎo)致Smad2/Smad3磷酸化水平降低。GD組的TGF-β1表達(dá)較正常組更低，提示TGF-β1的異常表達(dá)可能參與GD的發(fā)生。這與王建國(guó)等[28]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，而與李紅林等[29]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果趨勢(shì)相反。這可能由于本研究和李紅林的實(shí)驗(yàn)所選實(shí)驗(yàn)對(duì)象群體不一致，或患者所處疾病發(fā)展階段不一致。而GD組中TGF-β1的表達(dá)降低，可能是由于在GD的發(fā)生過程中，機(jī)體為維持免疫平衡進(jìn)行自我調(diào)節(jié)，通過降低TGF-β1的表達(dá)來減少TGF-β1-p-Smad2/3途徑誘導(dǎo)的Th17細(xì)胞分化。同時(shí)，GD組中TRAF-6的mRNA表達(dá)較NC組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而GD組中的TRAF-6的蛋白表達(dá)較NC組有下降的趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與前期研究結(jié)果趨勢(shì)一致[23]，提示低表達(dá)的TRAF-6可能促發(fā)GD。

在對(duì)GD組的數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)，p-Smad2蛋白與IL-2 mRNA之間的表達(dá)水平負(fù)相關(guān)，提示p-Smad2對(duì)IL-2表達(dá)的調(diào)控可能在GD的發(fā)生過程中發(fā)揮作用；然而其余相關(guān)性分析結(jié)果與本研究假設(shè)不相符，可能是由于本研究收集的樣本量太少，這提示要深入探討在GD的發(fā)生過程中，TRAF-6通過影響TGF-β1介導(dǎo)的Smad2/Smad3蛋白磷酸化，維持IL-2對(duì)Th17/Treg細(xì)胞平衡的調(diào)控作用，我們需要大量的樣本進(jìn)行驗(yàn)證。綜上所述，GD患者中TRAF-6的低表達(dá)，可能不足以抑制TGF-β1介導(dǎo)的Smad2/3磷酸化，導(dǎo)致增多的Smad2/3磷酸化蛋白下調(diào)IL-2表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)Th17細(xì)胞的分化，同時(shí)抑制Treg細(xì)胞的分化，使得機(jī)體不能維持免疫耐受，促進(jìn)GD的發(fā)生。

然而，TRAF-6抑制TGF-β1介導(dǎo)的Smad2/Smad3磷酸化過程的具體途徑目前尚無報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)，CD4+T細(xì)胞中，TGF-β通過跨膜絲氨酸(Ser)/蘇氨酸(Thr)激酶受體家族轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，該家族主要通過Ⅰ型(TβRⅠ)、Ⅱ(TβRⅡ)型受體傳導(dǎo)信號(hào)[30]。TGF-β先結(jié)合至TβRⅡ的胞外端,其胞內(nèi)段的Ser/Thr激酶被活化,使 TβRⅠ因甘氨酸(Gly)-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser結(jié)構(gòu)域磷酸化而活化[31]，磷酸化的TβRⅠ引起下游轉(zhuǎn)錄因子Smad2和Smad3的磷酸化，而磷酸化的Smad2和Smad3與Smad4協(xié)同將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核[32-34]，進(jìn)而調(diào)控下游基因，包括IL-2的轉(zhuǎn)錄。因此，TRAF-6可能抑制TGF-β1結(jié)合至TβRⅡ的胞外端、阻礙胞內(nèi)段的 Ser/Thr 激酶活化、抑制TβRⅠ的活化、阻礙磷酸化的TβRⅠ對(duì)Smad2和Smad3進(jìn)化磷酸化，進(jìn)而減少TGF-β1介導(dǎo)的Smad2/Smad3的磷酸化。然而，TRAF-6抑制TGF-β1介導(dǎo)的Smad2/Smad3的磷酸化過程的具體途徑有待進(jìn)一步探究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示的三組間甲狀腺功能和甲狀腺自身抗體水平變化，可能是由于eGD病人經(jīng)過藥物治療后免疫炎癥狀態(tài)有所緩解，但還未達(dá)到正常人水平，也提示TRAF-6調(diào)控TGF-β1介導(dǎo)的Smad2/3磷酸化，進(jìn)而調(diào)控Th17/Treg細(xì)胞平衡的機(jī)制在GD的發(fā)病過程中與免疫狀態(tài)有關(guān)，而不依賴于甲狀腺。

本研究探討了GD中TRAF-6的免疫耐受作用及其可能的具體作用機(jī)制，為效應(yīng)T細(xì)胞失衡的上游機(jī)制提供了新角度和新靶點(diǎn)，同時(shí)提供了GD免疫發(fā)病機(jī)制的新方向和針對(duì)GD發(fā)病機(jī)制的診斷與治療的新靶點(diǎn)。