漢黃芩素對LPS和ATP聯(lián)合誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的抑制作用①

張海麗 游雷鳴 劉 慧 劉歡葦 周思瑤 吳 珺 郝 鈺

(北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院免疫與微生物學(xué)系，北京100029)

黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)為唇形科植物黃芩的干燥根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，從秦漢時期開始，黃芩就已經(jīng)被應(yīng)用于臨床，到現(xiàn)在已經(jīng)有兩千多年的歷史。歷代的中醫(yī)藥文獻(xiàn)均有對黃芩的記載，黃芩的臨床配伍應(yīng)用廣泛，臨床療效顯著。漢黃芩素(5,7-二羥基-8-甲氧基黃酮)源自黃芩根提取物，為黃芩中主要的活性物質(zhì)，是一種天然存在的黃酮類化合物，該類化合物在結(jié)構(gòu)上的特異性，主要在于它們在黃酮B環(huán)上不含有4位羥基，而A環(huán)上具有大多數(shù)黃酮不具有的6位羥基(黃芩素)或8位甲氧基(漢黃芩素)。因其只在黃芩根部合成，故將其稱為根特異性黃酮。相關(guān)研究已經(jīng)證實，漢黃芩素可抑制腎臟炎癥，如減少巨噬細(xì)胞浸潤，減少炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生和抑制受損腎臟中NF-κB活化?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，漢黃芩素具有抑制腫瘤細(xì)胞生長、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抗血管生成和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化的作用[1-4]。

巨噬細(xì)胞(Macrophage,Mφ)是機(jī)體固有免疫系統(tǒng)的重要免疫細(xì)胞之一，在病原微生物的清除，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，誘發(fā)適應(yīng)性免疫應(yīng)答以及組織損傷后的修復(fù)與重構(gòu)過程中起關(guān)鍵作用[5]。內(nèi)源性或外源性的多種刺激可引起巨噬細(xì)胞活化，特別是細(xì)胞中NLRP3炎性體的活化[6]，進(jìn)而產(chǎn)生大量的促炎因子(如IL-1β、IL-18、IL-6以及TNF-α)和殺菌物質(zhì)，這些殺菌物質(zhì)包括基質(zhì)金屬蛋白酶12(Matrix metalloproteinase 12,MMP12)和活性氧(Reactive oxygen species,ROS)，其中ROS是O2帶電子后的產(chǎn)物，包括氧的一電子還原產(chǎn)物超氧陰離子(O2-)、二電子還原產(chǎn)物過氧化氫(H2O2)、三電子還原產(chǎn)物羥基自由基(·OH)以及一氧化氮等[7]。同時，巨噬細(xì)胞分泌的趨化因子，如CCL2 (MCP1)和IL-8 (CXCL8)，還可以募集趨化大量的中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞向炎癥部位遷移，以加重炎癥反應(yīng)[8]。雖然漢黃芩素有良好的抗炎作用，但其對巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的干預(yù)作用，特別是其抑制巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制還知之甚少。因此，本研究以脂多糖(LPS，一種病原相關(guān)分子模式)和三磷酸腺苷(ATP)(一種損傷相關(guān)分子模式)聯(lián)合刺激小鼠巨噬細(xì)胞為炎癥模型，探究漢黃芩素對巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的抑制作用。

1 材料與方法

1.1材料 小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7(ATCC:TIB-71)，由北京中醫(yī)藥大學(xué)免疫與微生物學(xué)系實驗室保存。漢黃芩素中藥單體購自中國藥品生物制品檢定所，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、ATP購自TaKaRa公司，RNA提取試劑TRIZOL購自Invitrogen公司，SYBGreen 熒光定量PCR試劑盒購自ToYoBo公司，LPS購自Sigma公司，兔抗小鼠NF-κB(P65亞基)抗體購自CST公司，山羊抗兔IgG抗體、小鼠TNF-α檢測 ELISA試劑盒及小鼠IL-6 檢測ELISA試劑盒均購自abcam公司，ROS檢測試劑盒購自凱基生物公司，胎牛血清購自HyClone公司，引物采用Primer 5.0設(shè)計，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將RAW264.7細(xì)胞接種在含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2漢黃芩素對巨噬細(xì)胞RAW264.7的最大無毒濃度測定 將處于對數(shù)期生長期的細(xì)胞用細(xì)胞刮刀刮下，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌離心后，用細(xì)胞培養(yǎng)液重懸調(diào)整細(xì)胞濃度至5×104個細(xì)胞/ml并加入96 孔板中(100 μl/孔)。活力測定實驗分為調(diào)零組(培養(yǎng)基)、對照組以及不同終濃度(28、56、70、84、98、112、140、168 μmol/L)漢黃芩素作用組，每組設(shè)6個復(fù)孔。細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加入MTT(終濃度0.5 mg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄掉孔內(nèi)上清，各孔加100 μl的DMSO，振蕩搖勻10 min以充分裂解細(xì)胞，使用全波長酶標(biāo)儀檢測OD值(波長570 nm)，分析不同濃度漢黃芩素對細(xì)胞活力(增殖)的影響，細(xì)胞增殖抑制率為10%時的藥物終濃度為漢黃芩素對巨噬細(xì)胞RAW264.7的最大無毒濃度，即本研究所用漢黃芩素的最大終濃度。細(xì)胞存活率(%)=(實驗組OD值-調(diào)零組OD值)/(對照組OD值-調(diào)零組OD值)×100%。

1.2.3漢黃芩素對LPS和ATP聯(lián)合刺激的巨噬細(xì)胞分泌TNF-α和IL-6的影響 將RAW264.7細(xì)胞接種到24孔板中，約5×105個細(xì)胞/孔，設(shè)對照組(正常培養(yǎng)不做刺激)，LPS和ATP聯(lián)合刺激組(LPS刺激4 h后加ATP繼續(xù)刺激30 min)，漢黃芩素干預(yù)組(LPS刺激4 h后加ATP繼續(xù)刺激30 min，刺激的同時加入漢黃芩素)，每組3個復(fù)孔。收集細(xì)胞上清液，參照ELISA試劑盒說明書分別測定各孔細(xì)胞上清液中炎性因子TNF-α、IL-1β的水平。實驗過程中LPS的終濃度為1 μg/ml，ATP的終濃度為5 mmol/L，漢黃芩素的終濃度為1 4、28、56 μmol/L(該濃度為1.2.2中測得的無毒濃度)。

表1 設(shè)計并合成的引物

Tab.1 Primers designed and synthesized in this study

PrimersSequence (5′to 3′)qR_IL-1β-FACAAGAGCTTCAGGCAGGCAGTATCqR_IL-1β-RTATGGGTCCGACAGCACGAGGCqR_IL-18-FCCTGGAATCAGACAACTTTGGCCGACTqR_IL-18-RCACTTTGATCAATATCAGTCATATCCTqR_IL-6-FTGCCTTCTTGGGACTGATqR_IL-6-RTTGCCATTGCACAACTCTTTqR_TNF-α-FCCTGCTGACGGGTTTACCTqR_TNF-α-RATGGCAGACAGGATGTTGACCqR_NLRP3-FATCTTTGCTGCGATCAACAGGCGqR_NLRP3-RCGCGTTCCTGTCCTTGATAGAGTqR_Caspase-1-FTGGAAGGTAGGCAAGACTqR_Caspase-1-RATAGTGGGCATCTGGGTCqR_GAPDH-FGGTGAAGGTCGGTGTGAACGqR_GAPDH-RCTCGCTCCTGGAAGATGGTG

1.2.4漢黃芩素對LPS-ATP刺激的巨噬細(xì)胞炎性相關(guān)分子mRNA水平的影響 將巨噬細(xì)胞RAW264.7接種到6孔板中(2×106個細(xì)胞/孔)，分組與方法1.2.3描述的相同，即對照組，LPS和ATP聯(lián)合刺激組，漢黃芩素(56 μmol/L)干預(yù)組，每組3個復(fù)孔。實驗過程中LPS和ATP及漢黃芩素的終濃度與方法1.2.3描述的相同。棄去各孔培養(yǎng)基后用PBS清洗各孔細(xì)胞，用TRIZOL試劑裂解細(xì)胞(500 μl/孔)，參照說明書的操作要求分離提取各孔細(xì)胞的總RNA。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明，各取1 μg(經(jīng)過DNA酶消化處理的)RNA來配制反轉(zhuǎn)錄體系(10 μl)合成相對應(yīng)的cDNA，得到的cDNA分別用無核酸酶的雙蒸水做10倍稀釋后備用。取1 μl 稀釋后的cDNA為模板，以小鼠GAPDH基因為內(nèi)參，加入相應(yīng)的引物(表1)，利用實時熒光定量PCR(qPCR)法分析各組細(xì)胞樣品中相應(yīng)基因的mRNA水平。定量分析的基因包括IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α、NLRP3以及Caspase-1，qPCR數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進(jìn)行處理和分析。

1.2.5漢黃芩素對LPS和ATP聯(lián)合刺激的巨噬細(xì)胞NF-κB的核定位的影響 將巨噬細(xì)胞RAW264.7接種到激光共聚焦培養(yǎng)皿中(2×106個細(xì)胞/皿)，分組與方法1.2.3描述的相同，即對照組，LPS和ATP聯(lián)合刺激組，漢黃芩素(56 μmol/L)干預(yù)組，每組3個復(fù)孔。實驗過程中LPS，ATP及漢黃芩素的使用終濃度與方法1.2.3描述的相同。棄去培養(yǎng)基后，用PBS清洗細(xì)胞(2次，1 min/次)，用4%多聚甲醛溶液室溫固定細(xì)胞15 min后，用PBS清洗細(xì)胞(3次，1 min/次)。接著，用0.1% Triton X-100處理細(xì)胞15 min(細(xì)胞破膜穿孔)后，PBS清洗細(xì)胞(2次，1 min/次)，然后用山羊血清封閉細(xì)胞30 min，經(jīng)PBS清洗細(xì)胞后(3次，1 min/次)，滴加兔抗NF-κB抗體工作液(P65亞基單抗，1∶500稀釋)，4℃過夜結(jié)合，PBS清洗細(xì)胞(3次，1 min/次)，滴加羊抗兔IgG的二抗工作液(1∶500稀釋)，37℃孵育30 min后，PBS清洗細(xì)胞(3次，1 min/次)，經(jīng)DAPI襯染細(xì)胞核后(藍(lán)色)，在激光共聚焦顯微鏡下觀察NF-κB(紅色)聯(lián)合定位情況。

1.2.6漢黃芩素對LPS和ATP聯(lián)合刺激的巨噬細(xì)胞胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的影響 將細(xì)胞接種到6孔板中(2×106個/孔)，設(shè)對照組(正常培養(yǎng)不做刺激)，LPS-ATP聯(lián)合刺激組(LPS刺激4 h后加ATP繼續(xù)刺激 30 min)，漢黃芩素干預(yù)組(LPS刺激4 h后加ATP繼續(xù)刺激30 min，刺激的同時加入不同濃度的漢黃芩素)，每組3個復(fù)孔。實驗過程中所用的LPS和ATP終濃度與方法1.2.3中描述的相同。收集各組細(xì)胞，加入DCFH-DA(ROS敏感的熒光探針)工作液，37℃孵育30 min后1 000 r/min離心10 min收集細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌細(xì)胞后(2次，1 300 r/min)，收集細(xì)胞沉淀物，用200 μl的PBS重懸細(xì)胞沉淀后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的熒光(各組細(xì)胞中的熒光細(xì)胞比例及熒光強弱代表活性氧水平的高低)。

2 結(jié)果

2.1漢黃芩素對巨噬細(xì)胞RAW264.7的最大無毒濃度 MTT實驗結(jié)果顯示，用不同濃度的漢黃芩素處理RAW264.7巨噬細(xì)胞24 h后，終濃度為56 μmol/L 時對巨噬細(xì)胞的增殖抑制率為10%，即漢黃芩素對巨噬細(xì)胞RAW264.7的最大無毒濃度可以定為56 μmol/L。

2.2漢黃芩素可以有效降低LPS和ATP聯(lián)合刺激的巨噬細(xì)胞分泌TNF-α和IL-6 巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α和IL-6水平的ELISA結(jié)果顯示(圖1)，與空白對照組相比，LPS和ATP聯(lián)合刺激組細(xì)胞的IL-6和TNF-α水平明顯升高(P<0.001)。與LPS和ATP聯(lián)合刺激組細(xì)胞相比，漢黃芩素干預(yù)組細(xì)胞分泌的IL-6、TNF-α明顯減少(P<0.01)，且漢黃芩素的濃度越高，IL-6和TNF-α的分泌水平也越低。

2.3漢黃芩素可以降低LPS和ATP聯(lián)合刺激的巨噬細(xì)胞炎性相關(guān)分子mRNA水平 定量PCR結(jié)果顯示(圖2)，與未經(jīng)刺激的對照組巨噬細(xì)胞相比，LPS和ATP聯(lián)合刺激的巨噬細(xì)胞中IL-1β、IL-18、IL-6和TNF-α mRNA水平顯著升高。特別的，編碼NLRP3炎性復(fù)合體關(guān)鍵組分NLRP3和Caspase-1的mRNA水平也顯著降低。但是，在LPS和ATP聯(lián)合刺激時加入漢黃芩素干預(yù)，巨噬細(xì)胞中這些促炎因子的mRNA水平的升高可以得到明顯的抑制。這些結(jié)果表明，漢黃芩素能有效降低LPS-ATP刺激的巨噬細(xì)胞炎性相關(guān)因子的mRNA水平，這將會抑制巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

圖1 漢黃芩素對LPS和ATP聯(lián)合刺激的巨噬細(xì)胞(RAW264.7)分泌IL-6和TNF-α的影響Fig.1 Effects of wogonin on secretion of IL-6 and TNF-α in LPS and ATP-challenged macrophages (RAW264.7)

圖2 漢黃芩素對LPS和ATP聯(lián)合刺激的RAW264.7細(xì)胞炎癥相關(guān)因子mRNA水平的影響Fig.2 Effects of wogonin on mRNA level of inflammation factors in LPS and ATP-challenged macrophages (RAW264.7)Note: The detected inflammation factor mRNAs include IL-1β,IL-18,IL-6 and TNF-α.Also,the mRNAs for the key component of NLRP3-inflammasome complex were detected,including NLRP3 and Caspase-1.

圖3 漢黃芩素對LPS和ATP刺激的巨噬細(xì)胞(RAW264.7)NF-κB核定位的影響Fig.3 Effect of wogonin on nuclear location of NF-κB in LPS and ATP-challenged macrophages(RAW264.7)Note: A.Nuclear translocation of NF-κB in macrophages observed under confocal fluorescence microscope.Unchallenged.RAW264.7 cells not challenged;LPS/ATP.RAW264.7 cells were challenged with LPS and ATP;LPS/ATP+wogonin.RAW264.7 cells were stimulated with LPS and ATP in the wogonin-contained medium；B.Comparison for percentage of macrophages in which the nuclear translocation of NF-κB was observed.

圖4 漢黃芩素對LPS和ATP聯(lián)合刺激的巨噬細(xì)胞(RAW264.7)胞內(nèi)活性氧(ROS)產(chǎn)生的影響Fig.4 Effects of wogonin on generation of ROS in LPS and ATP-challenged macrophages (RAW264.7)Note: A.Histogram analysis of FACS (fluorescence activated cell sorting) for ROS-generated cells.The region (ROS-positive cells) defines the ROS-generated cells.Control.RAW264.7 cells not challenged;LPS/ATP.RAW264.7 cells were challenged with LPS and ATP;LPS/ATP+wogonin.RAW264.7 cells were stimulated with LPS and ATP in the wogonin-contained medium；B.Comparison for percentage of ROS-positive cells.

2.4漢黃芩素可降低LPS和ATP聯(lián)合刺激的巨噬細(xì)胞胞內(nèi)NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的核定位 激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)錄因子NF-κB核定位，發(fā)現(xiàn)LPS和ATP聯(lián)合刺激組巨噬細(xì)胞胞內(nèi)NF-κB被激活并發(fā)生核轉(zhuǎn)位(圖3)，當(dāng)加入漢黃芩素(56 μmol/L)干預(yù)時，細(xì)胞核觀察到的NF-κB明顯減少。這些結(jié)果表明，漢黃芩素的干預(yù)可以明顯減少NF-κB因子的核定位，而核內(nèi)NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的減少將會導(dǎo)致NF-κB靶基因的轉(zhuǎn)錄水平降低，包括NF-κB調(diào)控的一些炎性相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄，這將弱化巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

2.5漢黃芩素可以降低LPS和ATP聯(lián)合刺激的巨噬細(xì)胞胞內(nèi)ROS產(chǎn)生 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示(圖4)，與未刺激的對照細(xì)胞相比，LPS和ATP聯(lián)合刺激組巨噬細(xì)胞中ROS含量明顯升高；與LPS和ATP聯(lián)合刺激組相比，不同濃度的漢黃芩素(14、28、56 μmol/L)干預(yù)組的巨噬細(xì)胞中ROS含量都明顯下降。表明漢黃芩素能顯著降低LPS和ATP聯(lián)合刺激的RAW264.7細(xì)胞ROS產(chǎn)生。

3 討論

機(jī)體或細(xì)胞在受到有害物質(zhì)刺激后，其抗氧化-氧化系統(tǒng)失衡，這一過程會導(dǎo)致活性物質(zhì)的過多產(chǎn)生和異常堆積，尤其是ROS的大量產(chǎn)生。胞內(nèi)過量的ROS可激活或增強NF-κB等炎性信號通路導(dǎo)致大量炎性因子基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而增強炎癥反應(yīng)[9]。正常情況下，NF-κΒ二聚體由p65(RelA)或p50構(gòu)成，但p65或p50形成的二聚體和IκB(NF-κΒ抑制蛋白)結(jié)合而滯留在細(xì)胞質(zhì)，此時NF-κΒ信號通路處于失活狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到如細(xì)胞因子、LPS和ROS等物質(zhì)刺激時，IκB的激酶(IKK)活化，活化的IKK使IκB的絲氨酸殘基磷酸化并在泛素連接酶的作用下泛素化進(jìn)而被蛋白酶體降解，NF-κΒ得以入核啟動炎癥相關(guān)基因(如NLRP3、IL-1β、IL-18和TNF-α等)的轉(zhuǎn)錄以介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[10]。

機(jī)體在不同生理和病理狀態(tài)下，巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出不同的類型，分為M1型和M2型兩大類，一類是在M1型中特異高表達(dá)的基因群(M1基因群)；另一類是在M2型中特異高表達(dá)的基因群(M2 基因群)。M1基因群具有“促炎”性，M2基因群普遍具有“抗炎”的功能。這些基因的表達(dá)產(chǎn)物可作為分析鑒定M1、M2 型的標(biāo)志分子。通常M1基因群的高表達(dá)產(chǎn)物為TNF-α、IL-6等炎性因子，其細(xì)胞形態(tài)為圓形；M2基因群的高表達(dá)產(chǎn)物為IL-10、IL-4抗炎因子，其細(xì)胞形態(tài)為纖維細(xì)胞樣。LPS刺激巨噬細(xì)胞后，可激活其胞內(nèi)的IKK復(fù)合物，進(jìn)而活化NF-κB炎癥信號通路，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1型極化，從而產(chǎn)生多種促炎細(xì)胞因子，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[11]。本研究以LPS和ATP聯(lián)合刺激的RAW264.7巨噬細(xì)胞為炎癥細(xì)胞模型，當(dāng)巨噬細(xì)胞同時受到LPS和ATP聯(lián)合刺激時，胞內(nèi)NF-κΒ信號通路和NLRP3炎性體(促進(jìn)IL-1β和IL-18前體蛋白的加工和成熟)同時活化，炎癥因子IL-6、TNF-α分泌水平增高，激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞多呈圓形[12,13]。當(dāng)LPS和ATP聯(lián)合刺激的同時加入漢黃芩素干預(yù)，巨噬細(xì)胞胞內(nèi)ROS水平明顯下降，NF-κΒ的核定位減弱，相應(yīng)的炎癥分子的mRNA轉(zhuǎn)錄降低。表明漢黃芩素可抑制LPS和ATP聯(lián)合誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。漢黃芩素似乎是通過減少胞內(nèi)ROS，降低胞內(nèi)的NF-κB活性，以弱化NF-κB介導(dǎo)的炎癥基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)而減弱巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。但什么機(jī)制讓ROS減少了，是漢黃芩素直接減少ROS產(chǎn)生和釋放，還是漢黃芩素活化了Nrf2抗氧化信號通路來降解過多的ROS，還有待進(jìn)一步的實驗以檢測Nrf2信號通路的活化情況。本研究在一定程度上豐富了漢黃芩素抗炎作用的研究內(nèi)容，也為進(jìn)一步探究其抗炎作用的分子機(jī)制提供了基礎(chǔ)。