P119驅(qū)動amiRNA介導(dǎo)的PL基因沉默對草莓果實(shí)硬度的影響

周 敏 蔣 丹 劉玥秀 王小蓉 湯浩茹 陳 清

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，成都 611130)

草莓(Fragaria×ananassaDuch.)為薔薇科(Rosaceae)多年生草本果樹，原產(chǎn)于南美，在我國及世界許多國家廣為栽培，資源十分豐富[1]。果實(shí)含有豐富的糖、有機(jī)酸、游離氨基酸、多種維生素及微量元素等，尤其是人體鐵、鉀元素的優(yōu)質(zhì)來源。果實(shí)中大量的多酚類化合物在抗菌、抗腫瘤、抗HIV病毒等方面具有一定的效果[2]。草莓果實(shí)是典型的非呼吸躍變型果實(shí)，它們必須在親本植株上發(fā)育成熟，并且在完熟期或接近完熟期采摘才能達(dá)到最佳的食用品質(zhì)。但其果實(shí)屬漿果，柔軟多汁，果皮薄，組織嬌嫩，極易腐爛變質(zhì)，且其生產(chǎn)周期短，集中上市期間室溫存放2～3天就會失去商品價(jià)值。雖然生產(chǎn)上可采用提前采摘，但延緩草莓果實(shí)成熟軟化，適當(dāng)增加果實(shí)硬度，延長其貨架壽命，仍是草莓生產(chǎn)中亟需解決的問題。

果實(shí)的硬度主要由細(xì)胞本身的機(jī)械強(qiáng)度以及細(xì)胞與細(xì)胞之間的相對穩(wěn)定性來決定的。植物細(xì)胞壁具有剛性和彈性，在Tucker等人[3]提出的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)“經(jīng)緯”模型中：纖維素的微纖絲以平行于細(xì)胞壁平面的方向沉積，且不同層次方向各異，構(gòu)成了細(xì)胞壁的“經(jīng)”；結(jié)構(gòu)蛋白(富含羥脯氨酸的蛋白)由異二酪氨酸交聯(lián)成結(jié)構(gòu)蛋白網(wǎng)，垂直于細(xì)胞壁平面排列，構(gòu)成細(xì)胞壁的“緯”。半纖維素和果膠等膠體填充于經(jīng)緯網(wǎng)絡(luò)中，與次生壁共同作用，保持細(xì)胞與細(xì)胞之間的相對位置，使植物細(xì)胞與細(xì)胞間具有高穩(wěn)定性。其中，果膠主要由同聚半乳糖醛酸聚糖(Homogalacturonan，HG)，Ⅰ型鼠李糖半乳糖醛酸聚糖(RhamnogalacturonanⅠ，RGⅠ)和Ⅱ型鼠李糖半乳糖醛酸聚糖(RhamnogalacturonanⅡ，RGⅡ)三類聚糖組成，在確定細(xì)胞壁孔隙度、控制細(xì)胞離子轉(zhuǎn)運(yùn)和滲透性方面起著重要作用，也能調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化，定位和抑制植物病原體進(jìn)入細(xì)胞[4～5]。Uluisik等人[6]的最新研究進(jìn)一步豐富了果膠的作用：果膠形成的聚合物呈主鏈、支鏈交叉狀，使其與纖維素微纖絲緊密結(jié)合在一起，更利于纖維素微絲在細(xì)胞壁中的交聯(lián)。另外的研究也表明，果實(shí)成熟軟化主要是由于皮層薄壁組織細(xì)胞壁胞間層的降解增加了果膠釋放[7]，從而允許細(xì)胞間相對空間位置發(fā)生滑動。在這一生理過程中，果膠酶包括果膠酯酶(Pectin Methyl Esterase，PME)、聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase，PG)和果膠裂解酶(Pectate lyase，PL)，通過一種可控的方式以及一系列有序的調(diào)節(jié)過程分解果膠[8]。因此，影響這些酶活性的條件在一定程度上均能影響果實(shí)的硬度和軟化的進(jìn)程。而果膠裂解酶不同于其他降解果膠的酶，它主要通過β-轉(zhuǎn)移和消除機(jī)制作用于果膠，優(yōu)先裂解高等植物中膠層和初生細(xì)胞壁的β-1，4-半乳糖醛酸殘基，被認(rèn)為是通過分子改良果實(shí)硬度、阻止果實(shí)軟化的優(yōu)秀候選酶之一[9～10]。

在延緩草莓果實(shí)軟化進(jìn)程的研究中，Jimenez-bermudez等[11]采用35S啟動子驅(qū)動PL基因進(jìn)行反義RNA的轉(zhuǎn)錄，獲得了41個(gè)轉(zhuǎn)反義PL基因的草莓株系，果實(shí)中PL基因表達(dá)量下降30%，但有33個(gè)株系的產(chǎn)量顯著下降。以Pel1和Pel3兩個(gè)株系對其成熟果實(shí)進(jìn)行組織學(xué)切片觀察，與對照相比，轉(zhuǎn)基因草莓的細(xì)胞間隙更小，而細(xì)胞與細(xì)胞間的接觸面積更大，因此硬度更大。而這41個(gè)株系中有3株草莓沒有結(jié)實(shí)，與果膠裂解酶的活性與花粉粒萌發(fā)以及花粉管的伸長有關(guān)相一致[12]。因此，組成型表達(dá)進(jìn)行系統(tǒng)性PL基因的沉默必然帶來不利的影響。遺憾的是，在非呼吸躍變型果實(shí)(如草莓)中，關(guān)于成熟相關(guān)的啟動子區(qū)域信息的研究相當(dāng)有限。目前大多數(shù)應(yīng)用的果實(shí)特異性啟動子都是從番茄中分離鑒定的。比如，P119果實(shí)特異性啟動子在番茄中驅(qū)動RNAi介導(dǎo)PL基因沉默時(shí)取得了顯著的成效：在不影響產(chǎn)量和果實(shí)品質(zhì)的基礎(chǔ)上，增加了番茄果實(shí)硬度的同時(shí)延長了其貨架壽命[6,13]。

由于穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化耗時(shí)較長，目前在果實(shí)發(fā)育機(jī)理的研究中，瞬時(shí)基因表達(dá)技術(shù)的應(yīng)用日益廣泛，但瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)受到的限制因素較多，雖已有不少報(bào)道成功利用草莓果實(shí)進(jìn)行了瞬時(shí)表達(dá)基因功能驗(yàn)證[14～15]，但多利用傳統(tǒng)的組成型啟動子表達(dá)。若應(yīng)用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，對植株的自然生長發(fā)育有一定影響。番茄果實(shí)是典型的呼吸躍變型果實(shí)，與草莓有很大的差異，因此這些時(shí)空特異性啟動子的應(yīng)用仍有待驗(yàn)證。

本研究選取番茄P119時(shí)空特異性啟動子，驅(qū)動草莓果實(shí)amiRNA介導(dǎo)PL基因沉默，通過沉默后果實(shí)硬度變化，著色過程觀察，并綜合果實(shí)發(fā)育過程中的大綠期、白熟期、轉(zhuǎn)色期、片紅期、全紅期的果膠裂解酶活性變化，分析amiRNA干擾PL基因在延緩草莓果實(shí)軟化中的作用，為p119果實(shí)特異性啟動子在草莓中的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

‘紅顏’草莓(Fragaria×ananassaDuch ‘Benihoppe’)為栽培較廣的優(yōu)良品種，成熟后果實(shí)品質(zhì)好，但硬度低，質(zhì)地綿軟，不耐儲運(yùn)，是研究果實(shí)軟化進(jìn)程的典型材料。于2017年12月從四川農(nóng)業(yè)大學(xué)崇州教學(xué)科研實(shí)習(xí)基地，參考Fait等[16]的方法，選取大綠、白熟、轉(zhuǎn)色、片紅以及成熟期5個(gè)不同發(fā)育階段果實(shí)。保證發(fā)育期相同，無機(jī)械損傷、無病蟲害，于冰盒中1 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行測定。

1.2 果膠裂解酶活性及果實(shí)硬度的測定

果膠裂解酶測定參考Payasi等[17]的方法。果肉用0.05 mol·L-1磷酸鈉緩沖液，0.02 mol·L-1鹽酸半胱氨酸和1% Triton X-100進(jìn)行勻漿，14 000 r·min-14℃離心30 min，上清液為粗酶液。取2.5 mL 1%多聚半乳糖醛酸酶溶液，1.0 mL 0.01 mol·L-1CaCl2，1.5 mL酶液，混勻后37℃保溫3 h，加0.4 mL ZnSO4·7H2O緩沖液(9%)與0.3 mL 0.5 mol·L-1NaOH終止反應(yīng)。將混合液3 000 r·min-1離心15 min，取2.5 mL上清，加入1.5 mL 0.04 mol·L-1硫代巴比妥酸，0.75 mL 0.1 mol·L-1HCl和0.25 mL水，沸水浴30 min，冷卻后在550 nm下測定吸光度值。

果實(shí)硬度采用GY-B型果實(shí)硬度計(jì)測定，每個(gè)時(shí)期測定20個(gè)果實(shí)，每個(gè)果實(shí)測定兩次。以果實(shí)赤道外緣為基準(zhǔn)，取點(diǎn)1或2處測定果皮硬度，取平均值。

1.3 P119基因的啟動子獲得

參照Chen等改良的CTAB法[18]提取micro-Tom番茄葉片總DNA。根據(jù)番茄p119基因啟動子序列設(shè)計(jì)兩條引物p119、f119(表1)，采用PCR進(jìn)行啟動子擴(kuò)增。反應(yīng)體系為50 μL，包括模板DNA 0.5 μL，GXL polymerase 1 μL，5×GXL Buffer 10 μL，dNTP mixture 4 μL，上下游引物各1 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?8℃預(yù)變性10 s；98℃變性10 s，60℃退火15 s，68℃延伸150 s，30個(gè)循環(huán)；68℃再延伸5 min，12℃保存。按照產(chǎn)品說明書使用SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收。

1.4 amiFaPL載體的構(gòu)建

1.4.1 amiRNA靶點(diǎn)的設(shè)計(jì)

栽培草莓為八倍體，基因組中可能存在多個(gè)編碼PL的位點(diǎn)。以NCBI登錄的栽培草莓PL轉(zhuǎn)錄本(DQ076239)為種子序列，在課題組轉(zhuǎn)錄組測序[19]獲得的‘紅顏’草莓Unigene中進(jìn)行同源搜索(blastN，e-value<0.00001，匹配長度>200 bp)。比對上的序列作為候選基因轉(zhuǎn)錄本。于WMD3(http://wmd3.weigelword.org)在線軟件進(jìn)行靶點(diǎn)篩選設(shè)計(jì)(Fragaria×ananassaPUT v183，minimum number of included targets=1)。挑選設(shè)計(jì)好的amiRNA靶序列，能靶向上一步獲得的所有PL序列即為所得的amiRNA序列。

1.4.2 amiFaPL前體設(shè)計(jì)及結(jié)構(gòu)預(yù)測

草莓Pre-amiFaPL的序列設(shè)計(jì)根據(jù)AtMIR390a前體序列(Accession:MI0001000)的堿基偏好性進(jìn)行替換：Forwar doligonucleotide鏈的X1-X21用設(shè)計(jì)好的amiRNA替換；Reverse doligonucleotide的X1-X19與Forwar doligonucleotide鏈X21-X1互補(bǔ)配對，其中X9與Forwar doligonucleotide鏈的X11配對具有堿基偏好性(G-A，C-U，A-G，U-C)。分別在序列兩端增加KpnⅠ和BamHⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)后，由上海生物工程(生工)公司進(jìn)行合成。合成的序列保存到pUC57載體上，并于ViennaRNA Services(RNAfold server)預(yù)測設(shè)計(jì)pre-amiFaPL序列的二級結(jié)構(gòu)。

1.4.3 amiFaPL沉默載體的獲得

將pUC57-amiRNA載體通過KpnⅠ和BamHⅠ雙酶切獲得amiRNA片段，接入中間載體pCambia1301-35SN；再以KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切pCambia1301-35SN-amiFaPL載體，接入pMDC83-35S-egfp載體以替換酶切位點(diǎn)；用HindⅢ和SalⅠ雙酶切pMDC83-35S-amiFaPL載體，以去除35S啟動子，最后采用同源重組的方式接入p119基因的啟動子(ClonExpress Entry One Step Cloning Kit)，獲得最終目標(biāo)載體。檢測正確的質(zhì)粒送上海生工生物工程有限公司檢測確認(rèn)。

1.5 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染白熟期草莓果實(shí)

測序確認(rèn)的重組質(zhì)粒通過凍融法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101，經(jīng)過菌液PCR檢測確認(rèn)后(菌液PCR檢測體系為：菌液1 μL，上下游引物M13FOR-L、amiRNA-FaPL各1 μL，2×PrimeStar Mix 10 μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。程序?yàn)?8℃預(yù)變性5 min；98℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸150 s，35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min，12℃保存)，參考Chen等[20]的方法，離體注射白熟期草莓果實(shí)。農(nóng)桿菌于YEB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600=1，室溫下4 000 r·min-1離心15 min，去上清。加入相同體積的MMG(1 mol·L-1MgCl20.5 mol·L-1MES(pH=5.6)，0.2 mol·L-1Acetosyringone)于黑暗中孵育4 h。室溫下4 000 r·min-1離心15 min后，將菌體調(diào)至OD600=0.8～1.0后進(jìn)行果實(shí)注射，每果實(shí)0.5 mL，以注射清水為對照。重復(fù)3組，每組10個(gè)果實(shí)。注射后的果實(shí)25℃，14 h光照8 000 lx，10 h黑暗進(jìn)行正常培養(yǎng)，拍照記錄果實(shí)變化情況。

1.6 注射后草莓采樣及保存

以果實(shí)表皮100%著色為商品成熟度標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)對照組果實(shí)達(dá)到100%著色時(shí)，以GY-B型果實(shí)硬度計(jì)測定果實(shí)硬度。將草莓果實(shí)縱切，一半用于硬度的測定，隨機(jī)選取兩點(diǎn)測定果實(shí)皮層硬度；另一半液氮速凍后保存在-80℃用于后續(xù)試驗(yàn)的開展。

1.7 RT-PCR分析PL基因相對表達(dá)量

采用改良CTAB法[18]提取沉默處理和H2O處理草莓果實(shí)總RNA，經(jīng)電泳檢測及核酸蛋白測定儀測定濃度后，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物)說明書合成cDNA用于后續(xù)PCR試驗(yàn)。根據(jù)克隆得到的草莓PL核酸序列，在miRNA靶點(diǎn)外設(shè)計(jì)半定量引物PL-1F和PL-1R，并以actin-smF和actin-smR(表1)為內(nèi)參引物。同時(shí)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行PL表達(dá)量分析(表1)。半定量PCR體系為：稀釋10倍的cDNA作為模板，上、下游引物各1 μL，2×Taq Master Mixture 10 μL，ddH2O 7 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?4℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 35 s，設(shè)置梯度循環(huán)數(shù)尋找最佳循環(huán)。在最佳循環(huán)數(shù)下進(jìn)行處理組和對照組的PCR擴(kuò)增，每個(gè)處理3組，每組重復(fù)3次。于QuantityOne(v4.6.2)軟件中計(jì)算灰度值。定量PCR在CFX96(BioRad，美國)熒光定量PCR上進(jìn)行，反應(yīng)體系為20 μL，含10 μL SYBR Green mix(上海生工，含2 mmol·L-1MgCl2)，上游引物PL-RTF 10 μmol·L-1，下游引物PL-RTR 10 μmol·L-1。采用三步法進(jìn)行擴(kuò)增：95℃預(yù)變性2.5 min，40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增(95℃變性15 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s)。每循環(huán)延伸結(jié)束進(jìn)行熒光采集。最后95℃維持15 s，65℃起按0.5℃步進(jìn)升溫至95℃，每步維持5s并采集熒光信號。內(nèi)參采用actin-RTF和actin-RTR為引物。采用2-ΔΔCt進(jìn)行表達(dá)量計(jì)算。

表1 試驗(yàn)所用引物

注：引物序列中小寫字母為同源重組接頭序列。

Note:The adaptor sequences for recombinationreaction were showed as lowercase letters in the primer.

圖1 果實(shí)成熟過程中果膠裂解酶活性及硬度的變化BG.大綠期；W.白熟期；TR.轉(zhuǎn)色期；PR.片紅期；FR.全紅期Fig.1 The changes of the Pectate lyase activity andfirmness in fruit ripening process BG.Big green; W.White; TR.Turning red; PR.Partial red; FR.Full red

2 結(jié)果與分析

2.1 草莓果實(shí)果膠裂解酶活性及硬度的相關(guān)性

草莓果實(shí)中PL的活性變化與果實(shí)硬度變化的結(jié)果如圖1所示：果膠裂解酶活性總體上呈增加的趨勢。果實(shí)在大綠到白熟果膠裂解酶活性低，隨著草莓果實(shí)的發(fā)育，果膠裂解酶活性逐漸增加，尤其在轉(zhuǎn)色期后，果膠裂解酶活性急劇增加，于全紅期達(dá)最大。與之相反，果實(shí)硬度在果實(shí)發(fā)育過程中逐漸降低，尤其在大綠到轉(zhuǎn)色期這一過程中。隨后硬度降低的速度減緩。值得注意的是，果膠裂解酶活性在果實(shí)前期(轉(zhuǎn)色期之前)雖然有輕微波動，但總體差異較小，而這個(gè)時(shí)期的果實(shí)硬度呈迅速下降趨勢，反而在后期果膠裂解酶活性增加迅速，但果實(shí)硬度減小放緩。因此可以推斷果膠裂解酶對果實(shí)發(fā)育后期的軟化起著重要的推動作用，但除果膠裂解酶活性外，還有其他因素參與果實(shí)前期的果實(shí)軟化的過程。

圖2 FaPL序列多重比對及amiFaPL靶點(diǎn)預(yù)測(*為靶位點(diǎn))Fig.2 Multiple sequence alignment of FaPLs and amiFaPL target prediction(indicated with asterisk marks)

2.2 amiRNA-PL靶點(diǎn)的選擇和載體構(gòu)建

以DQ076239.1為種子序列比對轉(zhuǎn)錄組Unigenes共獲得了2條PL轉(zhuǎn)錄本序列。其中DN83964_c4_g9_i1長度為1 581 bp，DN83964_c4_g9_i2長度為1 484 bp。多重序列比對顯示(圖2)，該轉(zhuǎn)錄本包含有109 bp 5′UTR區(qū)，具有15個(gè)SNP位點(diǎn)。相較DQ076239，DN83964轉(zhuǎn)錄本3′端多編碼了43個(gè)氨基酸。而兩條轉(zhuǎn)錄本之間，i1比i2多一個(gè)長度為97 bp的內(nèi)含子保留(intron retention)。

通過WMD3在線軟件，設(shè)計(jì)得到amiRNA靶序列：5′-ATGGCTGATGGTGATGGTATA-3′。該靶點(diǎn)可以同時(shí)靶向這2個(gè)PL轉(zhuǎn)錄本(圖2)。根據(jù)堿基偏好性以AtMIR390a前體序列將人工合成的amiRNA進(jìn)行替換，再利用ViennaRNA Services預(yù)測設(shè)計(jì)好的amiFaPL前體序列結(jié)構(gòu)。如圖3A所示，所選擇的miRNA前體基因序列轉(zhuǎn)錄后可以形成典型的頸環(huán)結(jié)構(gòu)。通過中間載體的替換，最后成功構(gòu)建了干擾載體P119::amiFaPL(圖3B)。

圖3 amiFaPL前體二級結(jié)構(gòu)預(yù)測(A)及amiFaPL重組載體構(gòu)建(B) M1.對應(yīng)條帶大小分別為200,500,800,1 200,2 000,3 000,4 500 bp；泳道1.P119啟動子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果；M2.D15000 marker，對應(yīng)條帶大小分別為250,1 000,2 500,5 000,7 500,10 000,15 000 bp；泳道2.pMD83空載；泳道3.重組質(zhì)粒；泳道4.重組質(zhì)粒BamHⅠ酶切鑒定Fig.3 The predicted secondary structure of amiFaPL transcript(A) andthe T-DNA region of the constructed amiFaPL plasmid(B) M1.DNA marker III,the size for each band equals to 200,500,800,1 200,2 000,3 000,4 500 bp respectively; Lane 1.Amplification of P119 promoter; M2.DNA marker D15000,the bands correspond to 250,1 000,2 500,5 000,7 500,10 000,15 000 bp in size; Lane 2.Empty vector of pMD83; Lane 3.The recombinant plasmid DNA; Lane 4.BamHⅠ digested recombinant plasmid DNA

圖4 PL沉默對草莓果實(shí)著色及果實(shí)硬度的影響 A.PL沉默對果實(shí)著色進(jìn)程的影響；B.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測amiRNA介導(dǎo)的PL基因沉默相對于對照(清水注射)的相對表達(dá)量；C.PL基因沉默對草莓果實(shí)硬度的影響 **表示t檢驗(yàn)極顯著差異(P<0.01)；*表示t檢驗(yàn)差異顯著(P<0.05)Fig.4 Effects of PL silencing on the appearance and fruit firmness of strawberry A.Coloring process of strawberry fruits subjected pectate lyase gene silencing; B.Relative expressions of PL genes in fruits with P119::amiRNA-PL infiltration detected by Real-time quantitative PCR; C.Affection of PL gene silencing on fruit firmness ** and * indicate significantly different(P<0.01) or different(P<0.05) through student’st test respectively

2.3 PL沉默對草莓果實(shí)顏色發(fā)育及果實(shí)硬度的影響

為進(jìn)一步確認(rèn)PL在草莓果實(shí)成熟軟化過程中的作用，我們對P119驅(qū)動下離體瞬時(shí)表達(dá)amiFaPL的果實(shí)進(jìn)行了分析。從沉默處理開始，處理組和對照組果實(shí)轉(zhuǎn)色集中在注射后的第3～4天，兩者并沒有出現(xiàn)顯著性差異(圖4A)。至注射后第4天，對照組果實(shí)96.7%全紅，而處理組也達(dá)到96.7%果實(shí)全紅。因此，PL的沉默并不會干擾果實(shí)中花青素苷的積累。與對照組相比，半定量PCR結(jié)果表明amiRNA介導(dǎo)的基因沉默后PL的表達(dá)量顯著下降，這一結(jié)果也得到了定量PCR結(jié)果的驗(yàn)證(66.5±18.6%)(圖4B)。該結(jié)果表明，P119這一果實(shí)特異性啟動子在草莓果實(shí)中仍然具有活性。雖然兩組處理在顏色變化上同步，但果實(shí)全紅時(shí)，PL沉默組的果實(shí)硬度顯著高于對照組(圖4C)。以上結(jié)果表明，沉默PL可以延緩草莓果實(shí)軟化進(jìn)程，但不會影響草莓成熟的著色過程。

3 討論

果實(shí)的軟化是果實(shí)成熟的重要標(biāo)志，同時(shí)也是影響果品貨架期以及果品商品價(jià)值的重要因素[9]。對多數(shù)水果而言，通過有序的，適當(dāng)?shù)能浕?，伴隨著復(fù)雜的生理和生化變化如糖酸的變化，揮發(fā)性物質(zhì)的代謝等，從而形成特有的品質(zhì)特征。而過快的軟化限制了果品的運(yùn)輸和銷售范圍。如何能控制果實(shí)軟化的進(jìn)程，同時(shí)又不會干擾果實(shí)成熟過程中的其他變化，如色澤的積累、香氣的形成和營養(yǎng)成分的匯聚是很多相關(guān)育種工作者努力的方向。

果實(shí)硬度是反應(yīng)果實(shí)成熟軟化的指標(biāo)，主要取決于細(xì)胞的膨壓以及細(xì)胞壁的完整性[21]，而細(xì)胞壁組分的有序變化和結(jié)構(gòu)的重構(gòu)是其中的關(guān)鍵因素。在果實(shí)發(fā)育過程中，多聚半乳糖醛酸酶PG、果膠酯酶PE、果膠裂解酶PL、纖維素酶(Cellulases，Cel)以及膨脹素(Expansin，EXP)等在細(xì)胞壁的變化中起著不同的作用。PE水解果膠分子鏈上半乳糖醛酸羧基上的酯化基團(tuán)，形成可供PG消化的果膠酸，PG隨機(jī)切除果膠分子的1,4-2-D-半乳糖苷鍵從而使得果實(shí)軟化。同樣的，PL則隨機(jī)裂解中膠層和初生細(xì)胞壁的β-1,4-半乳糖醛酸，主要是影響了由果膠緊密鏈接纖維素微絲、半纖維素形成的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到果膠結(jié)構(gòu)的裂解促進(jìn)果實(shí)軟化。這些酶通過程序化的產(chǎn)生，促進(jìn)了果實(shí)的軟化。因此這些酶及其編碼基因都是作為成熟軟化調(diào)控的靶標(biāo)。在‘豐香’草莓中，PG在果實(shí)的白果期已有表達(dá)，并在后期迅速升高，全紅期又開始下降[22]。而反義抑制PG表達(dá)，可以明顯降低草莓軟化程度[23～24]。相反，PE則在多數(shù)情況下被認(rèn)為不是果實(shí)軟化的關(guān)鍵酶[25]。近期的研究表明，PL在果實(shí)軟化過程中的作用超過了PG和PE。RNAi引發(fā)的PL基因沉默可以非常有效的延緩番茄的軟化過程，而其他的生長以及果實(shí)品質(zhì)形成均不受影響[6]。但這一結(jié)論在不同的物種中表現(xiàn)并不一致。在草莓中，PL的沉默確實(shí)會顯著增加果實(shí)的硬度，但果實(shí)普遍較對照減小，座果率也不同程度的受到影響，產(chǎn)量銳減[7]。其主要原因可能是PL參與的細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)過程除了在果實(shí)中以外，還在諸如幼嫩器官的生長，花粉的活力等方面發(fā)揮作用。因此組織特異性干擾PL的表達(dá)可能是解決該問題的途徑之一。

在周鶴瑩等的研究中，森林草莓基因組編碼了至少3個(gè)果膠裂解酶基因：PLA，PLB和PLC，并且在草莓各器官中均有表達(dá)[26]。在本研究中，因?yàn)樵耘嗖葺蚪M序列的不完整，尚不能獲得準(zhǔn)確的編碼基因數(shù)目。但在栽培草莓‘紅顏’中的PL至少有兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本，兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本之間是否存在組織特異性或功能分化目前尚不清楚。但同森林草莓一致的是，PL的活性隨著果實(shí)的成熟而增加，同時(shí)伴隨著果實(shí)硬度的減小(圖1)，進(jìn)一步證明PL在草莓果實(shí)軟化中起重要作用。通過人工設(shè)計(jì)miRNA同時(shí)靶向這2個(gè)PL基因，沉默效率為35%左右，較報(bào)道的amiRNA效率低[27]，究其原因可能是因?yàn)樵囼?yàn)采用的是瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)。同時(shí)，也可能與番茄的P119啟動子的活性在草莓果實(shí)中并不高有關(guān)。試驗(yàn)中采用了清水對照，該處理在前期的試驗(yàn)中與空載農(nóng)桿菌并沒有表現(xiàn)出顯著差異。盡管如此，在草莓果實(shí)中沉默PL可以顯著增加果實(shí)硬度，同時(shí)不會對果實(shí)正常著色產(chǎn)生影響，這與Jiménez-Bermúdez等[11]的結(jié)果一致，進(jìn)一步證明PL是一個(gè)良好的調(diào)控靶標(biāo)。在果實(shí)特異性啟動子的驅(qū)動下，PL的沉默是否會影響植株的營養(yǎng)生長和坐果等，有待于穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化研究。