金桂快速繁殖煉苗技術(shù)的研究

葉天一 周 鑫 黃 艷 王曉紅

(國(guó)家林業(yè)局哈爾濱林業(yè)機(jī)械研究所，哈爾濱 150086)

桂花(Osmanthusfragrans)是木犀科(Oleaceae)木犀屬(Osmanthus)植物，常綠闊葉灌木或者小喬木，屬于我國(guó)十大傳統(tǒng)名花，同時(shí)也是世界上最早被用作園藝觀賞植物的其中之一[1～3]。目前我國(guó)的桂花品種可分為4個(gè)品種群，共157個(gè)品[4～5]。桂花常用的繁殖方法有嫁接、扦插、壓條、種子繁殖，其中以嫁接為主[6～11]。現(xiàn)階段微繁即組織培養(yǎng)作為桂花的一種繁殖方式，是一種新興的繁殖技術(shù)，具有繁殖系數(shù)大[12]、能夠保持品種的優(yōu)良性狀等特點(diǎn)，可彌補(bǔ)以往常規(guī)繁殖育苗的不足[13]，同時(shí)又能滿足市場(chǎng)對(duì)苗木大批量的需求[14]。實(shí)驗(yàn)是以植物組織培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ)開展的擴(kuò)繁研究工作，植物離體快繁技術(shù)是依賴于植物組織培養(yǎng)技術(shù)而興起的[15～17]。它是利用植物的營(yíng)養(yǎng)繁殖方法，植物組織培養(yǎng)的材料為外植體(explant)，器官、組織、胚胎、細(xì)胞以及原生質(zhì)體均可作為組織培養(yǎng)的材料[18～20]。將植物的組織塊或是器官消毒后放入無(wú)菌的培養(yǎng)環(huán)境中，在人工的培養(yǎng)條件下繁殖，快速的獲取較多的目的植株，達(dá)到快速擴(kuò)繁的目的。

迄今為止，桂花組織培養(yǎng)的室內(nèi)快速繁殖技術(shù)已經(jīng)基本上發(fā)展成熟，但是針對(duì)其煉苗鮮見(jiàn)系統(tǒng)的文獻(xiàn)報(bào)道，且工序復(fù)雜不系統(tǒng)，成苗率低，實(shí)用性不強(qiáng)。本研發(fā)內(nèi)容的開展，期望通過(guò)對(duì)金桂品種微繁的煉苗關(guān)鍵技術(shù)試驗(yàn)及其結(jié)果分析，探索其提高成活、成苗率的煉苗技術(shù)，為目標(biāo)品種的壯苗快繁提供煉苗的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

以廣西地區(qū)金桂(Osmanthusfragransvar.thunbergii)作為微繁培育苗木的試材，組培室內(nèi)培養(yǎng)溫度為25±3℃，光照14 h·d-1，光照強(qiáng)度為2 000～2 500 lx。

1.2 方法

1.2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)試管苗生根的影響

試驗(yàn)以金桂組織培養(yǎng)苗繼代增殖后生長(zhǎng)2.5 cm以上的無(wú)根苗為試材，將其轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基。試驗(yàn)包括基本培養(yǎng)基(A)、NAA(B)和6-BA(C)3個(gè)因素，每因素3個(gè)水平(表1)。根據(jù)設(shè)定的因素水平表，故選用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)施。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平表

Table 1 The levels and factors of the experiment

水平Level因素FactorA:基本培養(yǎng)基A:Minimal mediumB:NAA(mg·L-1)C:6-BA(mg·L-1)1MS002B520.0531/2MS40.10

設(shè)立兩個(gè)對(duì)照組：CK1：1/2MS基本培養(yǎng)基；CK2：B5基本培養(yǎng)基。

每個(gè)處理組合需桂花無(wú)根瓶苗5瓶，每瓶3株，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，本試驗(yàn)共需要165瓶無(wú)根苗。

1.2.2 不同預(yù)處理對(duì)煉苗的影響

以長(zhǎng)至6 cm左右的金桂微繁生根苗為材料，試驗(yàn)試劑為蒸餾水、3%蔗糖水即30 g蔗糖與1 L蒸餾水相溶、10倍稀釋的MS大量母液。

表2 試驗(yàn)因素水平表

本試驗(yàn)一個(gè)處理共設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)處理5瓶，每瓶3株，共需180瓶。

1.2.3 不同移栽基質(zhì)對(duì)煉苗的影響

經(jīng)過(guò)室內(nèi)煉苗的金桂微繁苗，腐殖土為購(gòu)買的淮安市土壤肥料研究所生產(chǎn)的有機(jī)基質(zhì)，苗圃土為商丘市農(nóng)林科學(xué)院桂花培育基地園土，珍珠巖為袋裝購(gòu)買。

試驗(yàn)包括苗圃土(A)、珍珠巖(B)和腐殖土(C)3個(gè)因素，每因素3個(gè)水平(表3)，各因素水平之間為容積比。根據(jù)設(shè)定的因素水平表，試驗(yàn)選用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)施。

表3 試驗(yàn)因素水平表

Table 3 The levels and factors of the experiment

水平Level因素FactorA:苗圃土A:The nursery soilB:珍珠巖B:PerliteC:腐殖土C:Humus101121343257

設(shè)立一個(gè)對(duì)照組CK：只用苗圃土作為基質(zhì)。

每個(gè)處理組合需微繁苗15株，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，本實(shí)驗(yàn)共需要450株經(jīng)過(guò)室內(nèi)煉苗的桂花。

2 結(jié)果和分析

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)試管苗生根的影響

通過(guò)對(duì)不同處理組合的金桂微繁苗快繁生根性狀的調(diào)查分析，各指標(biāo)的平均值如表4所示。

從表4中可以看出，編號(hào)2(A1B2C2)得到了最大生根率，且顯著高于其他組合，說(shuō)明珍珠巖∶腐殖土為3∶4的時(shí)候有利于金桂的生根，而在兩組對(duì)照實(shí)驗(yàn)處理(CK1和CK2)來(lái)看，僅使用苗圃土的生根率最低，可以說(shuō)在金桂生根過(guò)程中，使用苗圃土?xí)档徒鸸鸬纳省?/p>

在直觀分析的基礎(chǔ)上，采用因素水平變化趨勢(shì)圖，解釋根系各生長(zhǎng)指標(biāo)隨因素的水平變化規(guī)律(圖1)。

表4 不同處理組合的生根指標(biāo)統(tǒng)計(jì)表

注：不同大、小寫字母分別表示差異極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)，下同。

Note:Different big and small letters mean extremely significant difference(P<0.01) and significant difference(P<0.05) respectively， the same as below.

圖1 根系各指標(biāo)隨因素的變化趨勢(shì)圖Fig.1 The chart of rooting parameter variation with the change of factorial levels

由圖1可看出，基本培養(yǎng)基類型對(duì)發(fā)芽率影響差異不顯著，NAA對(duì)發(fā)芽率影響達(dá)極顯著水平，6-BA對(duì)發(fā)芽率影響達(dá)顯著水平。基本培養(yǎng)基對(duì)根系各指標(biāo)的影響中，MS基本培養(yǎng)基對(duì)發(fā)芽率的影響效果最好，B5基本培養(yǎng)基對(duì)生根數(shù)的效果效果最好，由于當(dāng)基本培養(yǎng)基由A2(B5)變?yōu)锳3(1/2MS)時(shí)，對(duì)生根數(shù)的影響并不大，綜合可知B5對(duì)該根系各指標(biāo)的影響效果較好；NAA對(duì)根系各指標(biāo)的影響以2.0 mg·L-1最好，其生根率和生根數(shù)量分別達(dá)到85.93%和3.59條/株，均優(yōu)于NAA其他兩個(gè)濃度；6-BA對(duì)根系各指標(biāo)中，生根率隨其濃度的增加而增加，可達(dá)到60.74%，生根數(shù)隨其濃度的增加到一定數(shù)目不再改變，最高達(dá)到3.09條/株。從根系各指標(biāo)隨因素水平變化趨勢(shì)圖可以看出，試驗(yàn)的最佳組合為A2B2C3，即在B5基本培養(yǎng)基中添加2 mg·L-1NAA和0.10 mg·L-16-BA是促進(jìn)金桂微繁苗生根及根系生長(zhǎng)的較佳組合，與直觀分析的結(jié)果一致。

2.2 不同預(yù)處理對(duì)煉苗的影響

2.2.1 處理組合的成活率和苗木損失率指標(biāo)統(tǒng)計(jì)

對(duì)不同處理組合的金桂微繁苗煉苗室內(nèi)成活率、移栽成活率以及苗木損失率進(jìn)行調(diào)查統(tǒng)計(jì)，各指標(biāo)的平均值如表5所示。

表5 不同處理組合統(tǒng)計(jì)結(jié)果

(1)多重比較結(jié)果顯示，處理組合7、10和11的室內(nèi)成活率比較接近，分別為95.6%、97.8%和95.6%，可以說(shuō)明，在生根培養(yǎng)較長(zhǎng)時(shí)間、加入蒸餾水有利于金桂的移栽成活率。與其他處理組合的差異極顯著，并為室內(nèi)成活率最高的A組；處理組合5和6的室內(nèi)成活分別為84.4%、82.2%和66.7%，與其他處理組合的差異顯著，組成B組；處理組合3、6的室內(nèi)成活率分別為60.0%和62.2%，組成B組；處理組合9室內(nèi)成活率為75.6%，獨(dú)立為過(guò)渡組BC組；處理組合2室內(nèi)成活率為62.2%，與其他組差異極顯著為C組；處理組合處理組合1、3、4、8以及12的室內(nèi)成活率分別為48.9%、48.9%、40.0%、44.4%、51.1%，與C組的差異極顯著，組成室內(nèi)成活率最低的D組。

(2)對(duì)不同處理組合間的移栽成活率方差分析，結(jié)果P=7.36E-10<0.01差異極顯著。多重比較結(jié)果表明，處理組合7移栽成活率最高，為84.4%，與其他處理組合的差異極顯著，獨(dú)立為A組；處理組合5、6和10的移栽成活率分別為68.9%、64.4%，兩者無(wú)極顯著差異但與其他處理組合的室內(nèi)成活率差異顯著而為次大的B組；處理組合1、2、3、11的移栽成活率分別為46.7%、53.3%、44.4%和40.0%，組成C組；處理組合8和9的移栽成活率分別為26.7%、28.9%，獨(dú)立為D組；處理組合4和12的移栽成活率分別為17.8%、8.9%，與D組的差異極顯著，組成移栽成活率最低的D組。

2.3 不同移栽基質(zhì)對(duì)煉苗的影響

金桂微繁苗煉苗移栽30 d后，通過(guò)對(duì)不同處理組合的成活率以及苗木增長(zhǎng)率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，各指標(biāo)的平均值如表6所示。

表6 不同處理組合生長(zhǎng)指標(biāo)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

(1)多重比較結(jié)果，試驗(yàn)的成活率表現(xiàn)出以下特征：處理組合1的成活率最高，達(dá)到82.2%，與其他處理組合的差異極顯著，獨(dú)立為成活率最高的A組；處理組合2、3和7成活率分別為66.7%、73.3%和71.1%，與其他處理組合的成活率差異顯著而為成活率次大的B組；處理組合3、6的生根率較接近，分別為48.9%、55.6%和51.1%，組成成活率次低的C組；處理組合5、9以及10三者的生根率極顯著地低于其他處理組合的，組成成活率最低的D組。

(2)不同處理組合間的苗木增長(zhǎng)率方差分析結(jié)果與成活率類似，其差異達(dá)到極顯著水平，即P=2.69E-18<0.01。多重比較結(jié)果表明，處理組合3、7和8(41.7、42.9、42.2%)的苗木增長(zhǎng)率極顯著地大于其他處理組合，組成苗木增長(zhǎng)率最大的A組；處理組合2的苗木增長(zhǎng)率為33.0%，與其他處理組合的苗木增長(zhǎng)率差異極顯著而為苗木增長(zhǎng)率次大的B組；處理組合1、4和6的苗木增長(zhǎng)率無(wú)顯著差異(28.4、27.8、28.5%)，組成苗木增長(zhǎng)率次小的C組；處理組合5、9和10的苗木增長(zhǎng)率較少，分別為8.0%、7.6%和8.2%，組成苗木增長(zhǎng)率最少的D組(表1～6)。

通過(guò)以上分析，初步揭示了不同基質(zhì)處理組合對(duì)金桂微繁苗煉苗成活率和苗木生長(zhǎng)狀況的影響較大。

3 結(jié)論

影響金桂微繁苗生根率的最優(yōu)理論組合為A2B2C3，但是，該試驗(yàn)組合在本次試驗(yàn)中未實(shí)施，平均生根數(shù)的最優(yōu)理論組合為A3B2C2(C3)。實(shí)際試驗(yàn)中以處理組合A3B2C3(1/2MS培養(yǎng)基，2 mg·L-1NAA，0.10 mg·L-16-BA)的處理，對(duì)金桂微繁苗的各個(gè)生根指標(biāo)最好，其生根率、平均生根數(shù)分別為：91.11%、3.83條/株。由于基本培養(yǎng)基(A因素)對(duì)生根率和生根數(shù)的影響不顯著，且故綜合分析結(jié)果，最優(yōu)組合為A3B2C3，即以B5基本培養(yǎng)基+2 mg·L-1NAA+0.10 mg·L-16-BA作為生根培養(yǎng)基，是提高金桂微繁苗生根率和生根數(shù)的最佳處理組合。

影響金桂微繁苗生根率的最優(yōu)理論組合為A2B4C3D2E3，但是，該試驗(yàn)組合在本次試驗(yàn)中未實(shí)施，結(jié)合實(shí)際試驗(yàn)中以處理組合A3B4C2D3E2的移栽成活率達(dá)到最高為84.4%，并且其室內(nèi)成活率為95.6%，與室內(nèi)最高成活率接近，苗木損失率也為最低組僅11.6%，因此可考慮最為煉苗預(yù)處理的技術(shù)措施，即生根苗培養(yǎng)40 d，閉瓶6 d，開瓶6 d，3/4開瓶方式，加入3%蔗糖水。

試驗(yàn)的最優(yōu)理論處理組合為A1B1C3(苗圃土∶珍珠巖∶腐殖土=0∶1∶7)，在實(shí)際試驗(yàn)中該處理組合未實(shí)施，需在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究中進(jìn)行驗(yàn)證。在實(shí)際試驗(yàn)中，與最優(yōu)處理組合相近的試驗(yàn)組合是A3B2C3，其成活率和苗木增長(zhǎng)率分別為82.2%、42.2%，雖其苗木增長(zhǎng)率低于處理組合A3B1C2，但是兩者的苗木增長(zhǎng)率接近差異不顯著，而且在實(shí)際生產(chǎn)中，苗圃土比較方便收集以及成本低，因此，可考慮在實(shí)際生產(chǎn)中以A3B2C3(苗圃土∶珍珠巖∶腐殖土=2∶3∶7)作為金桂微繁苗煉苗基質(zhì)的配比組合。

4 討論

以往的研究者依據(jù)培養(yǎng)的不同物種、組織和目的，設(shè)計(jì)了許多不同類型的基本培養(yǎng)基[21]。在桂花的組織培養(yǎng)中，其初代培養(yǎng)和增殖培養(yǎng)，選用的基本培養(yǎng)基略有不同，但是其基本培養(yǎng)基常用的有MS和B5兩類[22]。在二十世紀(jì)九十年代，秦新民在對(duì)秋桂嫩莖誘導(dǎo)叢生芽的組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，就選用了MS作為基本培養(yǎng)基，獲得了實(shí)驗(yàn)的成功；在1998年，Kazutaka和Nishikaw兩位科學(xué)家對(duì)在桂花莖尖進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)以MS+6-BA 1.5 mg·L-1+2，4-D 0.1 mg·L-1為初代培養(yǎng)基，得到了愈傷組織[16]；在對(duì)桂花新稍莖段初代及其繼代培養(yǎng)、胚幼苗生長(zhǎng)的研究中發(fā)現(xiàn)，LMc培養(yǎng)基優(yōu)于MS培養(yǎng)基[13]。但是袁王俊等人通過(guò)對(duì)桂花莖尖以及胚的組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究得出，MS和DCR培養(yǎng)基沒(méi)有B5效果好[16,19]。

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑又被稱為外源激素，它與植物體內(nèi)分泌的激素具有相似的生理和生物學(xué)效應(yīng)。經(jīng)過(guò)以往大量研究發(fā)現(xiàn)，激素在各類植物的組織培養(yǎng)中是不可或缺的，并且根據(jù)不同的植物、不同的目的等，其在應(yīng)用中的種類、濃度以及配比是不同的?，F(xiàn)在應(yīng)用的激素主要有：生長(zhǎng)素類，如2，4-D、萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)等；細(xì)胞分裂素類，能夠促使細(xì)胞快速分裂，以及側(cè)芽的生長(zhǎng)和不定芽的分化等，如在組織培養(yǎng)中我們最常用的6-芐基腺嘌呤(6-BA)，另外還有激動(dòng)素(KT)等；赤霉素類、水楊酸等等。

在桂花組織培養(yǎng)中，常用6-BA誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽、NAA誘導(dǎo)生根、2，4-D誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生等作為外源激素添加到相應(yīng)的培養(yǎng)基中[16]。2013年，王麗霞等以桂花葉盤、莖段為外植體，基質(zhì)用基本培養(yǎng)基MS，然后添加不同濃度的6-BA和NAA，并調(diào)節(jié)其配比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者直接分化不定芽的最佳培養(yǎng)基不同，前者為MS+1 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1NAA，后者則為MS+2 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA[23]。

在植物組織培養(yǎng)基中添加蔗糖，主要作用是為植物外植體的初期生長(zhǎng)提供碳源和能源。添加蔗糖而不是葡萄糖，主要是前者可以形成穩(wěn)定的滲透壓，便于植物細(xì)胞的吸收，同時(shí)也可以減少微生物的污染，因?yàn)槠咸烟鞘俏⑸镒钸m合的碳源。關(guān)于在桂花培養(yǎng)基中蔗糖的濃度常選用3%，主要是因?yàn)槿粽崽堑臐舛冗^(guò)高或低都會(huì)造成培養(yǎng)基的滲透壓改變，從而不利于外植體的生長(zhǎng)。