川西獐牙菜SmSLS2基因的克隆、生物信息學及表達分析

李文靜 馮 雨 侯曉強 孫艷香 韓美玲 李曉雪 王 勇 向蓓蓓

(1.廊坊師范學院生命科學學院，廊坊 065000； 2.南開大學生命科學學院，天津 300071； 3.天津中醫(yī)藥大學中藥學院，天津 300193)

藏藥川西獐牙菜(SwertiamussotiiFranch.)隸屬龍膽科(Gentianaceae)獐牙菜屬(SwertiaL.)，主要分布于我國西藏、云南、青海、四川等海拔在2 300～3 900 m地區(qū)，俗稱“藏茵陳”[1]。全草可入藥，性寒、味苦，具有清熱解毒、清肝利膽之功效，主治肝功能紊亂和黃疸等癥[2～3]。川西獐牙菜中次生代謝產(chǎn)物包括環(huán)烯醚萜類、萜類、三萜類黃酮、多元酚類等[4～5]。川西獐牙菜的藥理活性與其含有的代謝產(chǎn)物有著必然聯(lián)系[6]。其中獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、獐牙菜苷等環(huán)烯醚萜類化合物是主要藥效成分，具有清熱解毒、利膽退黃之功效，對于肝炎、糖尿病具有顯著效果[7～9]。近年來環(huán)烯醚萜類化合物的生物活性備受關注，但研究主要集中在新化合物的分類鑒定，藥理活性等方面[10～11]。獐牙菜苦苷、獐牙菜苷及龍膽苦苷在獐牙菜中含量極其微少，從原植物中提取遠遠不能滿足市場需求；化學合成和半合成由于成本太高導致無商業(yè)前景[12]。利用分子生物學手段來提高川西獐牙菜有效成分含量成為有效手段。

川西獐牙菜目前尚無公開的基因組序列，目前裂環(huán)烯醚萜途徑僅SmGPPS、SmIS、SmDL7H、SmG10H等少數(shù)酶被成功克隆[13～16]，但這些酶都處于環(huán)烯醚萜合成途徑較上游位置。裂環(huán)馬錢子苷合成酶(secologanin synthase，SLS)是環(huán)烯醚萜類化合物合成途徑的關鍵限速酶，該酶能夠催化馬錢子苷到環(huán)烯醚萜途徑終產(chǎn)物裂環(huán)馬錢子苷，裂環(huán)馬錢子苷再與吲哚途徑的色胺在異胡豆苷合成酶(strictosidine synthase，STR)的催化下生成3α(S)-異胡豆苷，之后經(jīng)過一系列的酶促反應生成環(huán)烯醚萜類化合物[17～18]。裂環(huán)馬錢子苷合成酶有兩種形式，SLS1和SLS2，在長春花中這兩種亞型核苷酸一致性高達94%，而川西獐牙菜中SmSLS1和SmSLS2一致性僅達63%，且主要以SmSLS2形式存在，SmSLS1在根、莖、葉、花等器官中表達量都很低[19～20]。裂環(huán)馬錢子苷合成酶的功能研究目前僅在長春花、喜樹、滇龍膽等少數(shù)植物中有報道[21～25]。

鑒于SmSLS2在環(huán)烯醚萜合成途徑中的重要作用，本研究以川西獐牙菜為材料，根據(jù)本實驗室前期獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，提取SmSLS2基因序列，設計引物分別對其cDNA和DNA序列進行擴增，通過克隆、測序及相應生物信息學分析，預測其編碼產(chǎn)物理化性質(zhì)和高級結(jié)構(gòu)；構(gòu)建原核表達載體pET-28a-sumo-SmSLS2，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，在37℃、0.5 mmol·L-1IPTG條件下進行誘導表達。以上研究為闡明川西獐牙菜中環(huán)烯醚萜化合物生物合成途徑提供了良好的理論依據(jù)，同時在蛋白應用開發(fā)以及利用基因工程手段提高川西獐牙菜次生代謝產(chǎn)物有效成分的含量方面具有非常重要的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

川西獐牙菜(SwertiamussotiiFranch)野生種子，由青海大學董匯澤教授采集于青海省玉樹縣并進行鑒定。實驗材料來自于實驗室種植的川西獐牙菜植株。E.coliTrans10和BL21(DE3)菌種購于全式金生物有限公司。pET-28a-sumo載體由廊坊師范學院遺傳與育種研究所保存。

DNA marker、6×Loading Buffer、Taq DNA聚合酶、10×PCR Buffer、XhoⅠ、SacⅠ限制性內(nèi)切酶、10×M Buffer和dNTP均購自大連寶生物公司(TaKaRa)；Ligation high購自東洋紡公司；2×A8 FastHiFi PCR MasterMix(+dye),Zero Background pTOPO-Blunt cloning kit購自北京艾德萊生物科技有限公司；快速瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒、高純度質(zhì)粒小提試劑盒、RNAprep pure植物總RNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；GoScriptTMReverse Transcription System購自普洛麥格(北京)生物技術有限公司；異丙基硫代半乳糖(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside，IPTG)、卡那霉素購自生工生物科技有限公司；引物合成和基因測序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.2 總RNA提取及cDNA的合成

參照RNAprep pure植物總RNA提取試劑盒的說明書提取川西獐牙菜葉片總RNA，用NanoDrop 2000c對其濃度和純度進行測定；按照GoScriptTMReverse Transcription System試劑盒說明書合成第一鏈cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SmSLS2全長cDNA的克隆

由于川西獐牙菜植物目前沒有可用的基因組序列，我們前期提取了川西獐牙菜葉片RNA，送諾禾致源公司通過Illumina Hiseq 4000高通量測序技術進行轉(zhuǎn)錄組測序。通過生物信息學方法對獲得的大量Unigenes進行功能注釋，同時從NCBI獲得長春花CrSLS序列，通過同源比對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得SmSLS2基因cDNA序列。根據(jù)該cDNA序列和原核表達載體pET-28a-sumo多克隆位點，設計一對含有限制性內(nèi)切酶的特異性引物：SmSLS-F 5′-AAGAGCTCATGGAGGTGGAGCTAATCAAGA-3′；SmSLS-R 5′-AACTCGAGAGCCGAGCTTCTTGTAAATCA-3′。以cDNA為模板進行PCR擴增，50 μL PCR反應體系由SmSLS-F(10 μmol/L)2 μL；SmSLS-R(10 μmol/L)2 μL；2×A8 FastHiFi PCR MasterMix 25 μL；ddH2O 21 μL；川西獐牙菜cDNA 1 μL組成。以該體系中的cDNA模板替換為ddH2O作為陰性對照。反應條件為94℃預變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸120 s，總計30個循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.4 SmSLS2基因結(jié)構(gòu)分析

參照艾德萊CTAB植物基因組DNA快速提取試劑盒提取川西獐牙菜葉片DNA，使用SmSLS-F和SmSLS-R引物分別對DNA和cDNA進行擴增并測序。將測序獲得的DNA和cDNA序列提交https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/網(wǎng)站進行比對，確定外顯子、內(nèi)含子位置及個數(shù)。

1.5 SmSLS2重組質(zhì)粒的獲得與鑒定

SmSLS2基因RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，用天根瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒純化目的片段。取4 μL純化后的目的片段與0.5 μL Zero Background pTOPO Blunt Cloning Vector以及0.5 μL 10×enhancer混勻于25℃下反應5 min。將5 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans 10感受態(tài)細胞，涂布于含有50 mg·L-1卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)10 h。使用SmSLS-F和SmSLS-F引物進行菌液PCR，反應體系如下：SmSLS-F和SmSLS-R(10 μmol·L-1)各1 μL；dNTP(2.5 mmol·L-1)2 μL；10×PCR Buffer 2 μL；ddH2O 12.8 μL；菌液1 μL；Taq DNA聚合酶(50 U·μL-1)0.2 μL。反應條件為94℃、5 min；94℃、30 s；55℃、30 s；72℃ 120 s；30個循環(huán)；72℃延伸10 min。擴大培養(yǎng)陽性克隆后獲得菌液，提取質(zhì)粒，進行質(zhì)粒雙酶切鑒定。20 μL質(zhì)粒雙酶切鑒定體系為SacⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶(10 U·μL-1)各1 μL、10×M Buffer 2 μL、ddH2O 11 μL；質(zhì)粒5 μL。將雙酶切體系混勻后，37℃反應2 h。選取菌液PCR和質(zhì)粒雙酶切鑒定正確的質(zhì)粒進行測序，獲得重組載體pTOPO-Blunt Cloning Vector-SmSLS2(簡稱pTOPO-B-SmSLS2)。

1.6 SmSLS2的生物信息學分析

利用ExPASy ProtParam tool工具(https://web.expasy.org/protparam/)預測SmSLS2編碼氨基酸的相對分子質(zhì)量、等電點及疏水性，利用Signal P3.0 Server進行信號肽預測；利用TMHMM Server2.0進行蛋白跨膜區(qū)預測；利用NCBI網(wǎng)站上的CDD分析SmSLS2蛋白保守域。利用PredictProtein方法(https://ppopen.informatik.tu-muenchen.de/)、InterPro protein(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)和SWISS-MODEL軟件預測其二級和三級結(jié)構(gòu)。將SmSLS2蛋白全長序列提交到NCBI的BLASTP中獲得其同源序列(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，利用culstal omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)和genedoc(http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html)進行多重序列比對。將川西獐牙菜SmSLS2序列和水甘草Amsoniahubrichtii(AGX93046.1)、長春花Catharanthusroseus(AGX93064.1)、秀麗藤Tabernaemontanaelegans(AGX93048.1)、小蔓長春花Vincaminor(AGX93049.1)、蘿芙木Rauvolfiaserpentina(AGX93047.1)、短小蛇根草Ophiorrhizapumila(BAP90521.1)、金雞納樹Cinchonacalisaya(AGX93045.1)、青脆枝Nothapodytesnimmoniana(AQW38832.1)、喜樹Camptothecaacuminata(ADU19849.1)、滇龍膽Gentianarigescens(KF941191)的SLS氨基酸序列先用BioEdit[26]進行比對和手工校對(采用軟件默認設置的參數(shù))。然后用MEGA 5.0[27]進行系統(tǒng)發(fā)育分析(Maximum Likelihood Tree，Bootstrap 1 000次重復檢驗各分支的置信度)，分支處的數(shù)字表示該分支分析的可靠程度，數(shù)值越大，可信度越高。

1.7 原核表達載體的構(gòu)建

將pTOPO-B-SmSLS2重組載體和pET-28a-sumo載體分別進行SacⅠ和XhoⅠ雙酶切，20 μL雙酶切的體系為SacⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶(10 U·μL-1)各1 μL、10×M Buffer 2 μL、質(zhì)粒10 μL、雙蒸水6 μL，37℃反應4 h?；厥漳康幕蚝洼d體片段，使用Ligation high進行連接。其中10 μL連接體系為目的片段5 μL；載體片段1 μL；Ligation high 4 μL；16℃反應30 min，轉(zhuǎn)化Trans10感受態(tài)細胞，涂布于含有卡那霉素(50 mg·L-1)的LB培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)10 h。挑取克隆進行菌液PCR，之后利用質(zhì)粒小提試劑盒進行質(zhì)粒的提取并進行雙酶切鑒定。20 μL菌液PCR的體系為T7 pro和T7 ter(10 μmol·L-1)各1 μL；dNTP(2.5 mmol·L-1)2 μL；10×PCR Buffer 2 μL；ddH2O 12.8 μL；Taq DNA聚合酶(50 U·μL-1)0.2 μL；菌液1 μL。反應條件均為94℃、5 min；94℃、30 s；55℃、30 s；72℃、120 s；30個循環(huán)；72℃延伸10 min。20 μL質(zhì)粒雙酶切鑒定的體系為SacⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶(10 U/μL)各1 μL、10×M Buffer 2 μL、質(zhì)粒10 μL、雙蒸水6 μL。將雙酶切體系混勻后，37℃反應4 h。選取菌液PCR和質(zhì)粒雙酶切鑒定正確的質(zhì)粒進行測序，獲得原核表達載體pET-28a-sumo-SmSLS2。

1.8 SmSLS2在大腸桿菌中的原核表達

利用熱激方法分別將重組質(zhì)粒pET-28a-sumo-SmSLS2和pET-28a-sumo空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，菌液PCR擴增獲得成功轉(zhuǎn)化的菌株。挑取單菌落接種于1 mL的含50 mg·L-1卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 150 r·min-1過夜培養(yǎng)。次日以1∶100的比例轉(zhuǎn)接到新鮮LB液體培養(yǎng)基中，至OD600值0.6～0.8左右，菌液中分別加入IPTG至終濃度0.5 mmol·L-1，于37℃進行誘導。誘導時間分別為0、1、2和4 h。12 000 r·min-14℃離心2 min收集菌體，加入50 μL 2×SDS-PAGE上樣緩沖液(0.125 mol·L-1Tris-HCl(pH6.8)、4% SDS、0.5%溴酚藍、40%甘油、5% β-巰基乙醇，4 mol·L-1尿素)，震蕩渦旋混勻，100℃煮沸10 min。室溫12 000 r·min-1離心2 min，取10 μL上清液上樣進行聚丙烯酰胺凝膠(4.5%濃縮膠和15%分離膠)電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 川西獐牙菜SmSLS2基因的開放閱讀框(ORF)的克隆

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序信息，設計含有SacⅠ和XhoⅠ酶切位點的特異性引物，RT-PCR擴增SmSLS2基因全長cDNA序列，得到一條約1 500 bp的DNA片段(SmSLS2 ORF大小為1 566 bp)(圖1)。將PCR產(chǎn)物與pTOPO-Blunt Cloning vector進行連接，轉(zhuǎn)化，選取陽性克隆進行菌落PCR擴增，得到一條與ORF全長大小一致的片段(圖2)。進一步對重組質(zhì)粒進行雙酶切驗證，酶切獲得兩條帶，一條與pTOPO-Blunt Cloning vector大小一致(1 865 bp)，另一條與目的片段大小一致(圖3)。成功獲得了重組質(zhì)粒pTOPO-B-SmSLS2后送上海美吉生物公司測序。測序結(jié)果表明SmSLS2(登錄號為MH535904)全長1 566 bp，編碼521個氨基酸(圖4)。以DNA為模板，使用SmSLS-F和SmSLS-R引物進行PCR擴增，獲得全長2 576 bp DNA片段，包括4個大小分別為128、95、705、82 bp的內(nèi)含子。各擴增電泳圖和內(nèi)含子位置見圖1,4。

圖1 SmSLS2基因的PCR與RT-PCR擴增產(chǎn)物 M. DL5000 Marker；1.陰性對照；2.SmSLS2基因RT-PCR產(chǎn)物；3.SmSLS2基因PCR產(chǎn)物Fig.1 PCR and RT-PCR detection of SmSLS2 M. DL5000 Marker; 1.Control; 2.RT-PCR product of SmSLS2; 3.PCR product of SmSLS2

圖2 菌液PCR產(chǎn)物檢測 M.DL2000 Marker；1.陰性對照；2～4.菌液PCR產(chǎn)物Fig.2 Clonal PCR detection of SmSLS2 M.DL2000 Marker; 1.Control; 2-4.PCR product of SmSLS2

圖3 pTOPO-B-SmSLS2載體雙酶切鑒定圖 M.DL2000 Marker；1.pTOPO-B-SmSLS2質(zhì)粒；2.pTOPO-B-SmSLS2質(zhì)粒SacⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定Fig.3 Digestive detection of pTOPO-B-SmSLS2 plasmid M.DL2000 Marker; 1.pTOPO-B-SmSLS2 plasmid; 2.Double digestion of pTOPO-B-SmSLS2 plasmid digested by SacⅠ and XhoⅠ

圖4 SmSLS2 gDNA、cDNA及編碼氨基酸序列 黑色標記部分代表外顯子；-代表內(nèi)含子位置；*代表終止密碼子Fig.4 Genomice DNA,cDNA and encoded amino acid sequences of SmSLS2 Black shaded parts were exons;- represented intron;* stands for stop codon

2.2 川西獐牙菜SmSLS2基因的生物信息學分析

2.2.1 川西獐牙菜SmSLS2蛋白質(zhì)序列分析

利用ExPASy ProtParam tool工具對SmSLS2蛋白的理化性質(zhì)進行分析，結(jié)果表明SmSLS2相對分子質(zhì)量為59 792.74，等電點(pI)為8.92，分子式為C2718H4261N713O748S28，半衰期為30 h。不穩(wěn)定指數(shù)為33.21，說明SmSLS2蛋白較穩(wěn)定；脂肪族指數(shù)為90.75，總平均疏水性為-0.200。該蛋白由20種氨基酸組成，含量最高的三位分別是亮氨酸(11.1%)、賴氨酸(8.3%)和半胱氨酸(1.2%)(圖5)。SmSLS2蛋白保守結(jié)構(gòu)域預測表明SmSLS2氨基酸序列中含有細胞色素P450保守結(jié)構(gòu)域，屬于P450超家族成員(圖6)。

圖5 SmSLS2氨基酸組成Fig.5 Amino acid composition of SmSLS2

圖6 SmSLS2蛋白保守域分析Fig.6 Conserved domain prediction of SmSLS2 protein

圖7 SmSLS2蛋白信號肽預測Fig.7 Signal peptide of SmSLS2 predicted by Signal P

圖8 SmSLS2蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域分析Fig.8 Transmembrane domain analysis of SmSLS2

信號肽預測結(jié)果表明SmSLS2是一分泌型蛋白，序列中有明顯的信號肽序列，其切割位點位于VVA和WV之間(圖7)；蛋白跨膜區(qū)預測結(jié)果表明SmSLS2第9～31位氨基酸是一個典型的跨膜區(qū)(圖8)；利用PredictProtein方法(https://ppopen.informatik.tu-muenchen.de/)對SmSLS2二級結(jié)構(gòu)進行分析。結(jié)果表明該蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋(H)占50.48%，延伸鏈占6.53%，無規(guī)卷曲(C)占42.99%。利用Swiss-Model Workspace以5veu.3.A為模板預測SmSLS2蛋白的三級結(jié)構(gòu)，序列相似度為24.39%，依據(jù)39-520位氨基酸建模，模型覆蓋率87%(圖9)，與二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果一致。

圖9 SmSLS2蛋白三級結(jié)構(gòu)預測Fig.9 3D structure prediction of amino acid sequences of SmSLS2 protein

圖10 SmSLS2與其他植物中SLS氨基酸序列的多序列比對結(jié)果Fig.10 Multiple sequence alignment of SmSLS2 amino acid sequence with SLS in other plants

圖11 SmSLS2與相關物種SLS蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.11 Phylogentic analysis of SmSLS2 and relative SLS proteins

2.2.2 氨基酸序列同源性分析

經(jīng)culstal omega比對分析，川西獐牙菜SmSLS2蛋白序列與其他植物具有較高相似性(圖10)。圖10中不同顏色代表SmSLS2氨基酸與其他植物中SLS氨基酸的同源程度，黑色區(qū)域代表同源程度高達100%。川西獐牙菜(MH535904)與水甘草(AmsoniahubrichtiiAGX93046.1)、長春花(CatharanthusroseusAGX93064.1)、秀麗藤(TabernaemontanaelegansAGX93048.1)、小蔓長春花(VincaminorAGX93049.1)、蘿芙木(RauvolfiaserpentinaAGX93047.1)、短小蛇根草(OphiorrhizapumilaBAP90521.1)、金雞納樹(CinchonacalisayaAGX93045.1)、青脆枝(NothapodytesnimmonianaAQW38832.1)、喜樹(CamptothecaacuminataADU19849.1)的SLS蛋白質(zhì)的相似度分別為75.62%、74.28%、73.90%、72.94%、72.74%、72.12%、68.92%、66.35%和62.94%。其保守性可能與其在植物體內(nèi)的功能有關。最大似然法系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，川西獐牙菜(Swertiamussotii)SLS2蛋白與其他物種(水甘草、長春花、秀麗藤、小蔓長春花、蘿芙木、短小蛇根草、金雞納樹、青脆枝、喜樹)SLS蛋白未聚在一個分支，親緣關系均較遠(圖11)。

2.3 川西獐牙菜SmSLS2蛋白的原核表達

2.3.1SmSLS2基因原核表達載體的構(gòu)建

將克隆得到的SmSLS2基因片段與原核表達載體pET-28a-sumo進行酶切連接，陽性克隆用SacⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定(圖12)并進行測序，測序結(jié)果無誤后，將其轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞BL21(DE3)中。

圖12 pET-28a-sumo-SmSLS2雙酶切檢測 M.DL2000 marker；1.pET-28a-sumo-SmSLS2質(zhì)粒；2.pET-28a-sumo-SmSLS2質(zhì)粒SacⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定Fig.12 Digestive detection of pET-28a-sumo-SmSLS2 plasmid M.DL2000 marker; 1.Plasmid of pET-28a-sumo-SmSLS2; 2.Detection of pET-28a-sumo-SmSLS2 digested by SacⅠ and XhoⅠ

2.3.2 將pET-28a-SmSLS2轉(zhuǎn)入表達菌株BL21(DE3)中進行原核表達

將重組質(zhì)粒pET-28a-sumo-SmSLS2轉(zhuǎn)入宿主菌株BL21(DE3)后，菌落PCR檢測獲得正確的轉(zhuǎn)化菌株，并使用IPTG誘導重組蛋白表達。一般原核蛋白誘導表達需要從標簽蛋白、IPTG的濃度、誘導溫度及時間方面入手[28]。SmSLS2蛋白原核表達首先選擇0.5 mmol·L-1IPTG，37℃溫度進行誘導，故本研究主要是通過調(diào)整誘導時間進行優(yōu)化。如圖13所示，空載體經(jīng)0、1、2、4 h誘導后獲得20 kDa sumo標簽蛋白，而pET-28a-sumo-SmSLS2經(jīng)0、1、2、4 h誘導后獲得一條與預期蛋白一致(77 kDa)的特異性條帶。蛋白表達量隨誘導時間增加而增多，在4 h時達到最高水平(圖13)。結(jié)果表明pET-28a-sumo-SmSLS2載體構(gòu)建成功，并成功通過IPTG誘導獲得了目的蛋白。

圖13 原核表達SmSLS2的SDS-PAGE電泳檢測 M.Dual Color Prestained Protein Marker；0、1、2和4 h代表轉(zhuǎn)入pET-28a-sumo和pET-28a-sumo-SmSLS2載體的BL21菌株誘導0、1、2、4 h的總蛋白Fig.13 Prokaryotic expression detection of SmSLS2 gene by SDS-PAGE M.Dual Color Prestained Protein Marker; 0, 1, 2 and 4 h represent the expressed product of pET-28a-sumo and pET-28a-sumo-SmSLS2 with 0.5 mmol·L-1 of IPTG induction for 0, 1, 2 and 4 h at 37℃

3 討論

裂環(huán)馬錢子苷合成酶是調(diào)控次生代謝產(chǎn)物獐牙菜苦苷及龍膽苦苷的關鍵酶，能夠催化裂環(huán)馬錢子苷生成馬錢子苷。該酶含有兩種亞型，SmSLS1和SmSLS2，SmSLS1在根、莖、葉片、花等器官中表達量均較低，主要以SmSLS2形式存在[20]。本研究成功在川西獐牙菜中克隆到SmSLS2基因的ORF及基因組序列，同源序列比對分析發(fā)現(xiàn)川西獐牙菜SmSLS2的氨基酸序列與其他植物的相似性較高，表明其確為SLS基因，編碼蛋白屬于P450家族成員。SmSLS2蛋白與其他植物中SLS相似度較高，系統(tǒng)進化樹分析與其他蛋白均未聚于一個分支，親緣關系較遠。滇龍膽與川西獐牙菜同屬于龍膽科，但目前滇龍膽中僅克隆得到GrSLS1基因，川西獐牙菜中SmSLS1與SmSLS2兩個基因核苷酸同源性僅達63%[20]，因此SmSLS2與GrSLS1未聚于同一分支。除滇龍膽外其他物種與獐牙菜不同屬于龍膽科，該結(jié)果與傳統(tǒng)分類結(jié)果相一致。

真核生物基因的原核表達受載體所帶標簽、宿主菌株、誘導溫度、誘導時間、IPTG濃度等因素的影響[28]。本研究最初采用pet28a載體進行表達，從誘導溫度、誘導時間、IPTG濃度多方面進行改進，均未獲得重組蛋白。后來將SmSLS2構(gòu)建到pet28a-sumo載體上，該載體在目的蛋白N端添加了sumo標簽，增加了目的蛋白的可溶性和快速純化能力。在37℃和0.5 mmol·L-1IPTG濃度下，成功誘導出與預期大小一致的目的蛋白，且隨著誘導時間延長，蛋白濃度升高，誘導表達4 h，蛋白量可以滿足純化需求。

川西獐牙菜主要有效成分獐牙菜苦苷及龍膽苦苷為環(huán)烯醚萜化合物，在獐牙菜中含量極其微少，如何提高有效成分含量至關重要。近年利用分子生物學手段來提高川西獐牙菜有效成分含量成為有效途徑。本課題組在對川西獐牙菜轉(zhuǎn)錄組測序之后，克隆了川西獐牙菜裂環(huán)烯醚萜途徑兩個關鍵酶(SmGPPS和SmIS)[13～14]。裂環(huán)馬錢子苷合成酶是環(huán)烯醚萜合成途徑最下游的一個關鍵酶，以SmSLS2為元件，通過合成生物學手段提高次生代謝產(chǎn)物具有重要意義。本研究成功從川西獐牙菜葉片中克隆了環(huán)烯醚萜生物合成關鍵酶基因SmSLS2，對其蛋白質(zhì)進行功能預測，并構(gòu)建原核表達載體，成功誘導表達了該蛋白，對進一步實現(xiàn)川西獐牙菜及類似以環(huán)烯醚萜化合物為主要活性成分植物的遺傳改良、提高藥材品質(zhì)具有十分重要的理論意義和實踐價值。