川西獐牙菜SmSLS2基因的克隆、生物信息學(xué)及表達(dá)分析

李文靜 馮 雨 侯曉強(qiáng) 孫艷香 韓美玲 李曉雪 王 勇 向蓓蓓

(1.廊坊師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廊坊 065000； 2.南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300071； 3.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 300193)

藏藥川西獐牙菜(SwertiamussotiiFranch.)隸屬龍膽科(Gentianaceae)獐牙菜屬(SwertiaL.)，主要分布于我國(guó)西藏、云南、青海、四川等海拔在2 300～3 900 m地區(qū)，俗稱“藏茵陳”[1]。全草可入藥，性寒、味苦，具有清熱解毒、清肝利膽之功效，主治肝功能紊亂和黃疸等癥[2～3]。川西獐牙菜中次生代謝產(chǎn)物包括環(huán)烯醚萜類、萜類、三萜類黃酮、多元酚類等[4～5]。川西獐牙菜的藥理活性與其含有的代謝產(chǎn)物有著必然聯(lián)系[6]。其中獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、獐牙菜苷等環(huán)烯醚萜類化合物是主要藥效成分，具有清熱解毒、利膽退黃之功效，對(duì)于肝炎、糖尿病具有顯著效果[7～9]。近年來環(huán)烯醚萜類化合物的生物活性備受關(guān)注，但研究主要集中在新化合物的分類鑒定，藥理活性等方面[10～11]。獐牙菜苦苷、獐牙菜苷及龍膽苦苷在獐牙菜中含量極其微少，從原植物中提取遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需求；化學(xué)合成和半合成由于成本太高導(dǎo)致無商業(yè)前景[12]。利用分子生物學(xué)手段來提高川西獐牙菜有效成分含量成為有效手段。

川西獐牙菜目前尚無公開的基因組序列，目前裂環(huán)烯醚萜途徑僅SmGPPS、SmIS、SmDL7H、SmG10H等少數(shù)酶被成功克隆[13～16]，但這些酶都處于環(huán)烯醚萜合成途徑較上游位置。裂環(huán)馬錢子苷合成酶(secologanin synthase，SLS)是環(huán)烯醚萜類化合物合成途徑的關(guān)鍵限速酶，該酶能夠催化馬錢子苷到環(huán)烯醚萜途徑終產(chǎn)物裂環(huán)馬錢子苷，裂環(huán)馬錢子苷再與吲哚途徑的色胺在異胡豆苷合成酶(strictosidine synthase，STR)的催化下生成3α(S)-異胡豆苷，之后經(jīng)過一系列的酶促反應(yīng)生成環(huán)烯醚萜類化合物[17～18]。裂環(huán)馬錢子苷合成酶有兩種形式，SLS1和SLS2，在長(zhǎng)春花中這兩種亞型核苷酸一致性高達(dá)94%，而川西獐牙菜中SmSLS1和SmSLS2一致性僅達(dá)63%，且主要以SmSLS2形式存在，SmSLS1在根、莖、葉、花等器官中表達(dá)量都很低[19～20]。裂環(huán)馬錢子苷合成酶的功能研究目前僅在長(zhǎng)春花、喜樹、滇龍膽等少數(shù)植物中有報(bào)道[21～25]。

鑒于SmSLS2在環(huán)烯醚萜合成途徑中的重要作用，本研究以川西獐牙菜為材料，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，提取SmSLS2基因序列，設(shè)計(jì)引物分別對(duì)其cDNA和DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增，通過克隆、測(cè)序及相應(yīng)生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)其編碼產(chǎn)物理化性質(zhì)和高級(jí)結(jié)構(gòu)；構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-28a-sumo-SmSLS2，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，在37℃、0.5 mmol·L-1IPTG條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。以上研究為闡明川西獐牙菜中環(huán)烯醚萜化合物生物合成途徑提供了良好的理論依據(jù)，同時(shí)在蛋白應(yīng)用開發(fā)以及利用基因工程手段提高川西獐牙菜次生代謝產(chǎn)物有效成分的含量方面具有非常重要的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

川西獐牙菜(SwertiamussotiiFranch)野生種子，由青海大學(xué)董匯澤教授采集于青海省玉樹縣并進(jìn)行鑒定。實(shí)驗(yàn)材料來自于實(shí)驗(yàn)室種植的川西獐牙菜植株。E.coliTrans10和BL21(DE3)菌種購(gòu)于全式金生物有限公司。pET-28a-sumo載體由廊坊師范學(xué)院遺傳與育種研究所保存。

DNA marker、6×Loading Buffer、Taq DNA聚合酶、10×PCR Buffer、XhoⅠ、SacⅠ限制性內(nèi)切酶、10×M Buffer和dNTP均購(gòu)自大連寶生物公司(TaKaRa)；Ligation high購(gòu)自東洋紡公司；2×A8 FastHiFi PCR MasterMix(+dye),Zero Background pTOPO-Blunt cloning kit購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司；快速瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒、高純度質(zhì)粒小提試劑盒、RNAprep pure植物總RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；GoScriptTMReverse Transcription System購(gòu)自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司；異丙基硫代半乳糖(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside，IPTG)、卡那霉素購(gòu)自生工生物科技有限公司；引物合成和基因測(cè)序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.2 總RNA提取及cDNA的合成

參照RNAprep pure植物總RNA提取試劑盒的說明書提取川西獐牙菜葉片總RNA，用NanoDrop 2000c對(duì)其濃度和純度進(jìn)行測(cè)定；按照GoScriptTMReverse Transcription System試劑盒說明書合成第一鏈cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SmSLS2全長(zhǎng)cDNA的克隆

由于川西獐牙菜植物目前沒有可用的基因組序列，我們前期提取了川西獐牙菜葉片RNA，送諾禾致源公司通過Illumina Hiseq 4000高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。通過生物信息學(xué)方法對(duì)獲得的大量Unigenes進(jìn)行功能注釋，同時(shí)從NCBI獲得長(zhǎng)春花CrSLS序列，通過同源比對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得SmSLS2基因cDNA序列。根據(jù)該cDNA序列和原核表達(dá)載體pET-28a-sumo多克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)一對(duì)含有限制性內(nèi)切酶的特異性引物：SmSLS-F 5′-AAGAGCTCATGGAGGTGGAGCTAATCAAGA-3′；SmSLS-R 5′-AACTCGAGAGCCGAGCTTCTTGTAAATCA-3′。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，50 μL PCR反應(yīng)體系由SmSLS-F(10 μmol/L)2 μL；SmSLS-R(10 μmol/L)2 μL；2×A8 FastHiFi PCR MasterMix 25 μL；ddH2O 21 μL；川西獐牙菜cDNA 1 μL組成。以該體系中的cDNA模板替換為ddH2O作為陰性對(duì)照。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸120 s，總計(jì)30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.4 SmSLS2基因結(jié)構(gòu)分析

參照艾德萊CTAB植物基因組DNA快速提取試劑盒提取川西獐牙菜葉片DNA，使用SmSLS-F和SmSLS-R引物分別對(duì)DNA和cDNA進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序。將測(cè)序獲得的DNA和cDNA序列提交https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì)，確定外顯子、內(nèi)含子位置及個(gè)數(shù)。

1.5 SmSLS2重組質(zhì)粒的獲得與鑒定

SmSLS2基因RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用天根瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒純化目的片段。取4 μL純化后的目的片段與0.5 μL Zero Background pTOPO Blunt Cloning Vector以及0.5 μL 10×enhancer混勻于25℃下反應(yīng)5 min。將5 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans 10感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有50 mg·L-1卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)10 h。使用SmSLS-F和SmSLS-F引物進(jìn)行菌液PCR，反應(yīng)體系如下：SmSLS-F和SmSLS-R(10 μmol·L-1)各1 μL；dNTP(2.5 mmol·L-1)2 μL；10×PCR Buffer 2 μL；ddH2O 12.8 μL；菌液1 μL；Taq DNA聚合酶(50 U·μL-1)0.2 μL。反應(yīng)條件為94℃、5 min；94℃、30 s；55℃、30 s；72℃ 120 s；30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。擴(kuò)大培養(yǎng)陽性克隆后獲得菌液，提取質(zhì)粒，進(jìn)行質(zhì)粒雙酶切鑒定。20 μL質(zhì)粒雙酶切鑒定體系為SacⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶(10 U·μL-1)各1 μL、10×M Buffer 2 μL、ddH2O 11 μL；質(zhì)粒5 μL。將雙酶切體系混勻后，37℃反應(yīng)2 h。選取菌液PCR和質(zhì)粒雙酶切鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，獲得重組載體pTOPO-Blunt Cloning Vector-SmSLS2(簡(jiǎn)稱pTOPO-B-SmSLS2)。

1.6 SmSLS2的生物信息學(xué)分析

利用ExPASy ProtParam tool工具(https://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)SmSLS2編碼氨基酸的相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)及疏水性，利用Signal P3.0 Server進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)；利用TMHMM Server2.0進(jìn)行蛋白跨膜區(qū)預(yù)測(cè)；利用NCBI網(wǎng)站上的CDD分析SmSLS2蛋白保守域。利用PredictProtein方法(https://ppopen.informatik.tu-muenchen.de/)、InterPro protein(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)和SWISS-MODEL軟件預(yù)測(cè)其二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。將SmSLS2蛋白全長(zhǎng)序列提交到NCBI的BLASTP中獲得其同源序列(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，利用culstal omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)和genedoc(http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html)進(jìn)行多重序列比對(duì)。將川西獐牙菜SmSLS2序列和水甘草Amsoniahubrichtii(AGX93046.1)、長(zhǎng)春花Catharanthusroseus(AGX93064.1)、秀麗藤Tabernaemontanaelegans(AGX93048.1)、小蔓長(zhǎng)春花Vincaminor(AGX93049.1)、蘿芙木Rauvolfiaserpentina(AGX93047.1)、短小蛇根草Ophiorrhizapumila(BAP90521.1)、金雞納樹Cinchonacalisaya(AGX93045.1)、青脆枝Nothapodytesnimmoniana(AQW38832.1)、喜樹Camptothecaacuminata(ADU19849.1)、滇龍膽Gentianarigescens(KF941191)的SLS氨基酸序列先用BioEdit[26]進(jìn)行比對(duì)和手工校對(duì)(采用軟件默認(rèn)設(shè)置的參數(shù))。然后用MEGA 5.0[27]進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析(Maximum Likelihood Tree，Bootstrap 1 000次重復(fù)檢驗(yàn)各分支的置信度)，分支處的數(shù)字表示該分支分析的可靠程度，數(shù)值越大，可信度越高。

1.7 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

將pTOPO-B-SmSLS2重組載體和pET-28a-sumo載體分別進(jìn)行SacⅠ和XhoⅠ雙酶切，20 μL雙酶切的體系為SacⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶(10 U·μL-1)各1 μL、10×M Buffer 2 μL、質(zhì)粒10 μL、雙蒸水6 μL，37℃反應(yīng)4 h?；厥漳康幕蚝洼d體片段，使用Ligation high進(jìn)行連接。其中10 μL連接體系為目的片段5 μL；載體片段1 μL；Ligation high 4 μL；16℃反應(yīng)30 min，轉(zhuǎn)化Trans10感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有卡那霉素(50 mg·L-1)的LB培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)10 h。挑取克隆進(jìn)行菌液PCR，之后利用質(zhì)粒小提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒的提取并進(jìn)行雙酶切鑒定。20 μL菌液PCR的體系為T7 pro和T7 ter(10 μmol·L-1)各1 μL；dNTP(2.5 mmol·L-1)2 μL；10×PCR Buffer 2 μL；ddH2O 12.8 μL；Taq DNA聚合酶(50 U·μL-1)0.2 μL；菌液1 μL。反應(yīng)條件均為94℃、5 min；94℃、30 s；55℃、30 s；72℃、120 s；30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。20 μL質(zhì)粒雙酶切鑒定的體系為SacⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶(10 U/μL)各1 μL、10×M Buffer 2 μL、質(zhì)粒10 μL、雙蒸水6 μL。將雙酶切體系混勻后，37℃反應(yīng)4 h。選取菌液PCR和質(zhì)粒雙酶切鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，獲得原核表達(dá)載體pET-28a-sumo-SmSLS2。

1.8 SmSLS2在大腸桿菌中的原核表達(dá)

利用熱激方法分別將重組質(zhì)粒pET-28a-sumo-SmSLS2和pET-28a-sumo空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，菌液PCR擴(kuò)增獲得成功轉(zhuǎn)化的菌株。挑取單菌落接種于1 mL的含50 mg·L-1卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 150 r·min-1過夜培養(yǎng)。次日以1∶100的比例轉(zhuǎn)接到新鮮LB液體培養(yǎng)基中，至OD600值0.6～0.8左右，菌液中分別加入IPTG至終濃度0.5 mmol·L-1，于37℃進(jìn)行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)時(shí)間分別為0、1、2和4 h。12 000 r·min-14℃離心2 min收集菌體，加入50 μL 2×SDS-PAGE上樣緩沖液(0.125 mol·L-1Tris-HCl(pH6.8)、4% SDS、0.5%溴酚藍(lán)、40%甘油、5% β-巰基乙醇，4 mol·L-1尿素)，震蕩渦旋混勻，100℃煮沸10 min。室溫12 000 r·min-1離心2 min，取10 μL上清液上樣進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠(4.5%濃縮膠和15%分離膠)電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 川西獐牙菜SmSLS2基因的開放閱讀框(ORF)的克隆

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序信息，設(shè)計(jì)含有SacⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)的特異性引物，RT-PCR擴(kuò)增SmSLS2基因全長(zhǎng)cDNA序列，得到一條約1 500 bp的DNA片段(SmSLS2 ORF大小為1 566 bp)(圖1)。將PCR產(chǎn)物與pTOPO-Blunt Cloning vector進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化，選取陽性克隆進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，得到一條與ORF全長(zhǎng)大小一致的片段(圖2)。進(jìn)一步對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，酶切獲得兩條帶，一條與pTOPO-Blunt Cloning vector大小一致(1 865 bp)，另一條與目的片段大小一致(圖3)。成功獲得了重組質(zhì)粒pTOPO-B-SmSLS2后送上海美吉生物公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明SmSLS2(登錄號(hào)為MH535904)全長(zhǎng)1 566 bp，編碼521個(gè)氨基酸(圖4)。以DNA為模板，使用SmSLS-F和SmSLS-R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得全長(zhǎng)2 576 bp DNA片段，包括4個(gè)大小分別為128、95、705、82 bp的內(nèi)含子。各擴(kuò)增電泳圖和內(nèi)含子位置見圖1,4。

圖1 SmSLS2基因的PCR與RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 M. DL5000 Marker；1.陰性對(duì)照；2.SmSLS2基因RT-PCR產(chǎn)物；3.SmSLS2基因PCR產(chǎn)物Fig.1 PCR and RT-PCR detection of SmSLS2 M. DL5000 Marker; 1.Control; 2.RT-PCR product of SmSLS2; 3.PCR product of SmSLS2

圖2 菌液PCR產(chǎn)物檢測(cè) M.DL2000 Marker；1.陰性對(duì)照；2～4.菌液PCR產(chǎn)物Fig.2 Clonal PCR detection of SmSLS2 M.DL2000 Marker; 1.Control; 2-4.PCR product of SmSLS2

圖3 pTOPO-B-SmSLS2載體雙酶切鑒定圖 M.DL2000 Marker；1.pTOPO-B-SmSLS2質(zhì)粒；2.pTOPO-B-SmSLS2質(zhì)粒SacⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定Fig.3 Digestive detection of pTOPO-B-SmSLS2 plasmid M.DL2000 Marker; 1.pTOPO-B-SmSLS2 plasmid; 2.Double digestion of pTOPO-B-SmSLS2 plasmid digested by SacⅠ and XhoⅠ

圖4 SmSLS2 gDNA、cDNA及編碼氨基酸序列 黑色標(biāo)記部分代表外顯子；-代表內(nèi)含子位置；*代表終止密碼子Fig.4 Genomice DNA,cDNA and encoded amino acid sequences of SmSLS2 Black shaded parts were exons;- represented intron;* stands for stop codon

2.2 川西獐牙菜SmSLS2基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1 川西獐牙菜SmSLS2蛋白質(zhì)序列分析

利用ExPASy ProtParam tool工具對(duì)SmSLS2蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果表明SmSLS2相對(duì)分子質(zhì)量為59 792.74，等電點(diǎn)(pI)為8.92，分子式為C2718H4261N713O748S28，半衰期為30 h。不穩(wěn)定指數(shù)為33.21，說明SmSLS2蛋白較穩(wěn)定；脂肪族指數(shù)為90.75，總平均疏水性為-0.200。該蛋白由20種氨基酸組成，含量最高的三位分別是亮氨酸(11.1%)、賴氨酸(8.3%)和半胱氨酸(1.2%)(圖5)。SmSLS2蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)表明SmSLS2氨基酸序列中含有細(xì)胞色素P450保守結(jié)構(gòu)域，屬于P450超家族成員(圖6)。

圖5 SmSLS2氨基酸組成Fig.5 Amino acid composition of SmSLS2

圖6 SmSLS2蛋白保守域分析Fig.6 Conserved domain prediction of SmSLS2 protein

圖7 SmSLS2蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.7 Signal peptide of SmSLS2 predicted by Signal P

圖8 SmSLS2蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域分析Fig.8 Transmembrane domain analysis of SmSLS2

信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果表明SmSLS2是一分泌型蛋白，序列中有明顯的信號(hào)肽序列，其切割位點(diǎn)位于VVA和WV之間(圖7)；蛋白跨膜區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果表明SmSLS2第9～31位氨基酸是一個(gè)典型的跨膜區(qū)(圖8)；利用PredictProtein方法(https://ppopen.informatik.tu-muenchen.de/)對(duì)SmSLS2二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。結(jié)果表明該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋(H)占50.48%，延伸鏈占6.53%，無規(guī)卷曲(C)占42.99%。利用Swiss-Model Workspace以5veu.3.A為模板預(yù)測(cè)SmSLS2蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，序列相似度為24.39%，依據(jù)39-520位氨基酸建模，模型覆蓋率87%(圖9)，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

圖9 SmSLS2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.9 3D structure prediction of amino acid sequences of SmSLS2 protein

圖10 SmSLS2與其他植物中SLS氨基酸序列的多序列比對(duì)結(jié)果Fig.10 Multiple sequence alignment of SmSLS2 amino acid sequence with SLS in other plants

圖11 SmSLS2與相關(guān)物種SLS蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.11 Phylogentic analysis of SmSLS2 and relative SLS proteins

2.2.2 氨基酸序列同源性分析

經(jīng)culstal omega比對(duì)分析，川西獐牙菜SmSLS2蛋白序列與其他植物具有較高相似性(圖10)。圖10中不同顏色代表SmSLS2氨基酸與其他植物中SLS氨基酸的同源程度，黑色區(qū)域代表同源程度高達(dá)100%。川西獐牙菜(MH535904)與水甘草(AmsoniahubrichtiiAGX93046.1)、長(zhǎng)春花(CatharanthusroseusAGX93064.1)、秀麗藤(TabernaemontanaelegansAGX93048.1)、小蔓長(zhǎng)春花(VincaminorAGX93049.1)、蘿芙木(RauvolfiaserpentinaAGX93047.1)、短小蛇根草(OphiorrhizapumilaBAP90521.1)、金雞納樹(CinchonacalisayaAGX93045.1)、青脆枝(NothapodytesnimmonianaAQW38832.1)、喜樹(CamptothecaacuminataADU19849.1)的SLS蛋白質(zhì)的相似度分別為75.62%、74.28%、73.90%、72.94%、72.74%、72.12%、68.92%、66.35%和62.94%。其保守性可能與其在植物體內(nèi)的功能有關(guān)。最大似然法系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，川西獐牙菜(Swertiamussotii)SLS2蛋白與其他物種(水甘草、長(zhǎng)春花、秀麗藤、小蔓長(zhǎng)春花、蘿芙木、短小蛇根草、金雞納樹、青脆枝、喜樹)SLS蛋白未聚在一個(gè)分支，親緣關(guān)系均較遠(yuǎn)(圖11)。

2.3 川西獐牙菜SmSLS2蛋白的原核表達(dá)

2.3.1SmSLS2基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建

將克隆得到的SmSLS2基因片段與原核表達(dá)載體pET-28a-sumo進(jìn)行酶切連接，陽性克隆用SacⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定(圖12)并進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果無誤后，將其轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)中。

圖12 pET-28a-sumo-SmSLS2雙酶切檢測(cè) M.DL2000 marker；1.pET-28a-sumo-SmSLS2質(zhì)粒；2.pET-28a-sumo-SmSLS2質(zhì)粒SacⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定Fig.12 Digestive detection of pET-28a-sumo-SmSLS2 plasmid M.DL2000 marker; 1.Plasmid of pET-28a-sumo-SmSLS2; 2.Detection of pET-28a-sumo-SmSLS2 digested by SacⅠ and XhoⅠ

2.3.2 將pET-28a-SmSLS2轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株BL21(DE3)中進(jìn)行原核表達(dá)

將重組質(zhì)粒pET-28a-sumo-SmSLS2轉(zhuǎn)入宿主菌株BL21(DE3)后，菌落PCR檢測(cè)獲得正確的轉(zhuǎn)化菌株，并使用IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)。一般原核蛋白誘導(dǎo)表達(dá)需要從標(biāo)簽蛋白、IPTG的濃度、誘導(dǎo)溫度及時(shí)間方面入手[28]。SmSLS2蛋白原核表達(dá)首先選擇0.5 mmol·L-1IPTG，37℃溫度進(jìn)行誘導(dǎo)，故本研究主要是通過調(diào)整誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。如圖13所示，空載體經(jīng)0、1、2、4 h誘導(dǎo)后獲得20 kDa sumo標(biāo)簽蛋白，而pET-28a-sumo-SmSLS2經(jīng)0、1、2、4 h誘導(dǎo)后獲得一條與預(yù)期蛋白一致(77 kDa)的特異性條帶。蛋白表達(dá)量隨誘導(dǎo)時(shí)間增加而增多，在4 h時(shí)達(dá)到最高水平(圖13)。結(jié)果表明pET-28a-sumo-SmSLS2載體構(gòu)建成功，并成功通過IPTG誘導(dǎo)獲得了目的蛋白。

圖13 原核表達(dá)SmSLS2的SDS-PAGE電泳檢測(cè) M.Dual Color Prestained Protein Marker；0、1、2和4 h代表轉(zhuǎn)入pET-28a-sumo和pET-28a-sumo-SmSLS2載體的BL21菌株誘導(dǎo)0、1、2、4 h的總蛋白Fig.13 Prokaryotic expression detection of SmSLS2 gene by SDS-PAGE M.Dual Color Prestained Protein Marker; 0, 1, 2 and 4 h represent the expressed product of pET-28a-sumo and pET-28a-sumo-SmSLS2 with 0.5 mmol·L-1 of IPTG induction for 0, 1, 2 and 4 h at 37℃

3 討論

裂環(huán)馬錢子苷合成酶是調(diào)控次生代謝產(chǎn)物獐牙菜苦苷及龍膽苦苷的關(guān)鍵酶，能夠催化裂環(huán)馬錢子苷生成馬錢子苷。該酶含有兩種亞型，SmSLS1和SmSLS2，SmSLS1在根、莖、葉片、花等器官中表達(dá)量均較低，主要以SmSLS2形式存在[20]。本研究成功在川西獐牙菜中克隆到SmSLS2基因的ORF及基因組序列，同源序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)川西獐牙菜SmSLS2的氨基酸序列與其他植物的相似性較高，表明其確為SLS基因，編碼蛋白屬于P450家族成員。SmSLS2蛋白與其他植物中SLS相似度較高，系統(tǒng)進(jìn)化樹分析與其他蛋白均未聚于一個(gè)分支，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。滇龍膽與川西獐牙菜同屬于龍膽科，但目前滇龍膽中僅克隆得到GrSLS1基因，川西獐牙菜中SmSLS1與SmSLS2兩個(gè)基因核苷酸同源性僅達(dá)63%[20]，因此SmSLS2與GrSLS1未聚于同一分支。除滇龍膽外其他物種與獐牙菜不同屬于龍膽科，該結(jié)果與傳統(tǒng)分類結(jié)果相一致。

真核生物基因的原核表達(dá)受載體所帶標(biāo)簽、宿主菌株、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間、IPTG濃度等因素的影響[28]。本研究最初采用pet28a載體進(jìn)行表達(dá)，從誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間、IPTG濃度多方面進(jìn)行改進(jìn)，均未獲得重組蛋白。后來將SmSLS2構(gòu)建到pet28a-sumo載體上，該載體在目的蛋白N端添加了sumo標(biāo)簽，增加了目的蛋白的可溶性和快速純化能力。在37℃和0.5 mmol·L-1IPTG濃度下，成功誘導(dǎo)出與預(yù)期大小一致的目的蛋白，且隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，蛋白濃度升高，誘導(dǎo)表達(dá)4 h，蛋白量可以滿足純化需求。

川西獐牙菜主要有效成分獐牙菜苦苷及龍膽苦苷為環(huán)烯醚萜化合物，在獐牙菜中含量極其微少，如何提高有效成分含量至關(guān)重要。近年利用分子生物學(xué)手段來提高川西獐牙菜有效成分含量成為有效途徑。本課題組在對(duì)川西獐牙菜轉(zhuǎn)錄組測(cè)序之后，克隆了川西獐牙菜裂環(huán)烯醚萜途徑兩個(gè)關(guān)鍵酶(SmGPPS和SmIS)[13～14]。裂環(huán)馬錢子苷合成酶是環(huán)烯醚萜合成途徑最下游的一個(gè)關(guān)鍵酶，以SmSLS2為元件，通過合成生物學(xué)手段提高次生代謝產(chǎn)物具有重要意義。本研究成功從川西獐牙菜葉片中克隆了環(huán)烯醚萜生物合成關(guān)鍵酶基因SmSLS2，對(duì)其蛋白質(zhì)進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，并構(gòu)建原核表達(dá)載體，成功誘導(dǎo)表達(dá)了該蛋白，對(duì)進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)川西獐牙菜及類似以環(huán)烯醚萜化合物為主要活性成分植物的遺傳改良、提高藥材品質(zhì)具有十分重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。