沙生蠟菊總黃酮最佳提取工藝的研究

李怡瑋， 王 瑩， 蘭 衛(wèi),3

(新疆醫(yī)科大學(xué)1中醫(yī)學(xué)院， 烏魯木齊 830011； 2附屬中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部， 烏魯木齊 830002; 3新疆名醫(yī)名方與特色方劑學(xué)實(shí)驗(yàn)室， 烏魯木齊 830011)

沙生蠟菊[Helichrysumarenarium(L)Moench.]為菊科蠟菊屬植物的全草，主要分布于我國新疆阿勒泰、青河、布爾津等地區(qū)[1],具有降糖、降脂、利尿、抗氧化等功效，臨床上多用于膽囊炎、急慢性腎炎的治療[2-8],其中主要的化學(xué)成分為黃酮類和多酚類化合物[9-11]。研究發(fā)現(xiàn)沙生蠟菊黃酮類成分主要有山柰酚、槲皮素、芹菜素、柚皮素、木犀草素、蒙花苷、柯伊利素等，其中槲皮素含量較高且具有代表性[12-16]。本研究以乙醇濃度、料液比和提取時(shí)間為考察因素，以槲皮素為對照品，通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)確定沙生蠟菊中總黃酮的最佳提取工藝，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器AL204型電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司),DK-S24型電熱恒溫水浴鍋 (上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司),SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司),UV2550型紫外可見分光光度計(jì)(上海菁華科技儀器有限公司),DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，EYELA SB-1000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)。

1.2 試劑槲皮素(購自上海源葉生物科技有限公司，批號C20J6Y1722)，無水乙醇(天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號20180203)，亞硝酸鈉(天津市化學(xué)試劑三廠，批號20171115)，硝酸鋁(天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號20180120)，氫氧化鈉(天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司，批號20170314)，以上試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.3 藥材沙生蠟菊2017年4月采集于新疆阿勒泰地區(qū)，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院中藥資源教研室主任盛萍教授鑒定確認(rèn)為菊科蠟菊屬植物沙生蠟菊[Helichrysumarenarium(L)Moench]的干燥全草。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮的含量測定

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 稱取槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品2.14 mg于25 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，搖勻，備用，得0.085 6 mg/mL槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 稱取沙生蠟菊藥材2.0 g置于圓底燒瓶中，用80%乙醇溶液，溫度75℃，料液比為1∶15，提取2次，每次1 h，后取1 mL上清液于100 mL容量瓶中，蒸餾水定容，搖勻，即得供試品溶液。

2.1.3 回歸方程的建立 分別吸取“2.1.1”項(xiàng)下槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品溶液1、2、3、4、5 mL于10 mL容量瓶中，用蒸餾水補(bǔ)足至5 mL，加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL搖勻，反應(yīng)6 min，加10%硝酸鋁溶液0.3 mL搖勻，反應(yīng)6 min，再加入4%氫氧化鈉溶液3 mL搖勻，最后用70%乙醇定容，反應(yīng)15 min，于375 nm處測量其吸光度A(空白對照為只有顯色劑無槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品)，取3次吸光度平均值。以槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品為橫坐標(biāo)(X)，吸光度為縱坐標(biāo)(Y)軸，得回歸方程式為Y=14.558X+0.003 8，r=0.999 3，槲皮素濃度范圍在0.008 6～0.042 8 mg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.4 精密度實(shí)驗(yàn) 吸取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液5 mL，按“2.1.3”項(xiàng)下方法操作，測定375 nm處吸光度A，連續(xù)測定6次，結(jié)果RSD=0.7%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 吸取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液5 mL，按“2.1.3”項(xiàng)下方法操作，測定375 nm處吸光度A。在180 min內(nèi)，每隔30 min測定1次，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果RSD=0.9%(n=6)，表明供試品溶液在3 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 按“2.1.2”項(xiàng)下方法重復(fù)提取供試品溶液6次，按“2.1.3”項(xiàng)下方法操作，測定375 nm處吸光度A，RSD=0.8%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.7 加樣回收實(shí)驗(yàn) 吸取已知總黃酮含量的供試品溶液5 mL，共6份，分別加入槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，搖勻，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行顯色反應(yīng)后，測定375 nm處吸光度A。結(jié)果平均回收率為96.61%，RSD=0.9%(n=6)，表明方法加樣回收率良好。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 乙醇濃度對沙生蠟菊黃酮提取含量的影響 稱取6份沙生蠟菊藥材，每份2.0 g置于圓底燒瓶中，分別加入0%、20%、40%、60%、80%、100%乙醇溶液，溫度75℃，料液比1∶15，提取2次，每次1 h，取1 mL上清液于100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，按“2.1.3”項(xiàng)下方法測定，計(jì)算總黃酮含量。當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)，沙生蠟菊總黃酮含量最高，故選則60%乙醇溶液為最佳提取溶液,見表1。

表1 乙醇濃度對沙生蠟菊黃酮提取含量的影響

2.2.2 料液比對沙生蠟菊黃酮提取含量的影響 稱取6份沙生蠟菊藥材，每份2.0 g置于圓底燒瓶中，按照料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35加入60%乙醇，溫度75℃，提取2次，每次1 h,取1 mL上清液于100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，按“2.1.3”項(xiàng)下方法測定，計(jì)算總黃酮含量。當(dāng)料液比為1∶20時(shí)，沙生蠟菊總黃酮含量最高，故選則1∶20為其最優(yōu)料液比，見表2。

表2 料液比對沙生蠟菊黃酮提取含量的影響

2.2.3 提取時(shí)間對沙生蠟菊黃酮提取含量的影響 稱取6份沙生蠟菊藥材，每份2.0 g置于圓底燒瓶中，料液比為1∶20，加入60%乙醇，分別提取30、60、90、120、150、180 min，溫度75℃，提取2次，取1 mL上清液于100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，按“2.1.3”項(xiàng)下方法測定，計(jì)算總黃酮含量。當(dāng)提取時(shí)間為120 min時(shí)，沙生蠟菊總黃酮含量最高，見表3。

表3 提取時(shí)間對沙生蠟菊黃酮提取含量的影響

2.3 正交實(shí)驗(yàn)根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時(shí)間(C)為考察因素，總黃酮的含量為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)3個水平3個因素，通過L9(33)做正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，見表4?？傸S酮的最佳提取工藝為A2B2C2,即60%的乙醇溶液，物料比為1∶20,提取120 min。由方差分析可以看出，因素A(乙醇濃度)、因素B(料液比)、因素C(提取時(shí)間)都具有顯著性差異(P<0.05)，各因素對沙生蠟菊總黃酮含量影響的主次順序?yàn)锽(料液比)>A(乙醇濃度)>C(提取時(shí)間)，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合，見表5-6。

表4 實(shí)驗(yàn)因素水平表

表5 總黃酮提取工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表6 方差分析表

2.4 最佳工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)采用優(yōu)選出的最佳工藝進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，平行提取5次，計(jì)算平均總黃酮含量及其RSD值，判斷此工藝的穩(wěn)定性及可靠性。用60%乙醇，1∶20料液比，提取120 min，提取2次，溫度75℃，平行5份，平均沙生蠟菊總黃酮含量為46.572 mg/g,RSD為2.3%，見表7。

表7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

本研究采用乙醇回流提取法提取沙生蠟菊總黃酮，通過對乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間3個因素進(jìn)行單因素考察，通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了沙生蠟菊總黃酮的提取工藝。結(jié)果表明，對沙生蠟菊總黃酮提取率的主要影響因素為料液比，其次是乙醇濃度和提取時(shí)間。本方法設(shè)備要求簡單，操作簡便，成本較低，適用于沙生蠟菊總黃酮的提取。