王祖文,秦櫻瑞,黃先智,丁曉雯,*
(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,食品科學(xué)與工程國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心,重慶 400716;2.西南大學(xué)科技處,重慶 400716)
隨著社會(huì)環(huán)境和飲食習(xí)慣的改變,肥胖、高血糖和高血脂等發(fā)病率逐年上升,這些疾病已嚴(yán)重危害人類健康[1]。許多藥食同源的中藥材因含多種具有治療疾病和預(yù)防保健作用(如降糖、降脂、增強(qiáng)免疫力、抗衰老等[2-3])的活性成分而受到人們青睞。從植物資源中開發(fā)一些適用一般人群的食品來調(diào)節(jié)機(jī)體功能、減少疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)成為近年研究熱點(diǎn)。
桑葉、苦瓜均是藥食兩用植物。大量研究證明,桑葉富含多糖、生物堿、黃酮等功能成分[4],具有降糖[5-6]、降脂[7-9]、抗氧化[10]等諸多生理功能;苦瓜富含多糖、皂苷和多肽等活性成分,具有降糖[11-12]、降脂[13-14]、抗氧化[15]、抗菌[16]等作用。目前關(guān)于桑葉、苦瓜及其提取物降糖、降脂、抗氧化效果的研究已有諸多報(bào)道,如Ahmed等[17]報(bào)道苦瓜提取物對(duì)鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠具有降脂、降糖作用;杭悅宇等[18]報(bào)道,苦瓜凍干粉對(duì)四氧嘧啶誘導(dǎo)的高血糖小鼠具有良好的降糖作用;Andallu等[19]在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的食物中添加25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))干桑葉粉,發(fā)現(xiàn)其能抑制糖尿病大鼠肝組織脂質(zhì)過氧化和過氧化氫酶的活性,提高超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)等抗氧化酶的活性;Jeszka-Skowron等[6]用桑葉干粉的乙醇提取物灌胃STZ誘導(dǎo)的非肥胖II型糖尿病大鼠,結(jié)果表明桑葉具有降血糖、提高胰島素水平及抗氧化功能。
近幾年,本實(shí)驗(yàn)室也進(jìn)行了相關(guān)的研究,如鄒莉芳等[20]發(fā)現(xiàn)桑葉水提物(主要含桑葉生物堿)對(duì)高脂飲食小鼠有顯著降血脂作用,能有效減少脂肪積累,促進(jìn)膽固醇代謝;方太松等[21]研究了不同劑量桑葉超微粉奶茶灌胃alloxan誘導(dǎo)的糖尿病小鼠,能顯著降低實(shí)驗(yàn)小鼠總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglycerides,TG)和低密度脂蛋白膽固醇(lowdensity lipoprotein cholesterol,LDL-C)濃度,升高高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)濃度;李玲等[22]研究了桑葉-苦瓜混合粉的體外抗氧化能力,結(jié)果表明桑葉-苦瓜在體外抗氧化有協(xié)同增效作用;楊敏等[23]報(bào)道桑葉-苦瓜混合粉可顯著降低糖尿病小鼠TC、TG和LDL-C濃度,升高HDL-C濃度;彭曉蝶等[24]對(duì)糖尿病小鼠灌胃不同質(zhì)量濃度的桑葉-苦瓜混合粉,發(fā)現(xiàn)當(dāng)質(zhì)量濃度為0.20 g/mL,灌胃30 d后,與模型組相比,糖尿病小鼠體質(zhì)量下降受到顯著抑制,血糖濃度下降率超過40%,肝糖原濃度增加1 倍以上。
桑葉、苦瓜無論是單獨(dú)還是混合喂飼都對(duì)糖尿病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、高脂飲食實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均有顯著的降糖、降脂、抗氧化作用,特別是混合喂飼能極顯著降低糖尿病小鼠血糖,對(duì)肝糖原儲(chǔ)存能力的增強(qiáng)作用優(yōu)于二甲雙胍(降血糖藥物)[23-24]。但長(zhǎng)期攝入桑葉-混合苦瓜粉對(duì)正常實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血糖、血脂、抗氧化能力是否有調(diào)節(jié)作用,是否會(huì)造成正常動(dòng)物低血糖等還鮮見報(bào)道。為了驗(yàn)證桑葉、苦瓜混合粉對(duì)正常實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無不利影響,本實(shí)驗(yàn)利用桑葉-苦瓜混合粉喂飼正常小鼠,測(cè)定其血糖、血脂水平及抗氧化指標(biāo)并進(jìn)行分析,以期為桑葉、苦瓜混合粉相關(guān)功能保健食品的開發(fā)提供參考。
昆明種清潔級(jí)小鼠,體質(zhì)量25~30 g,購(gòu)自重慶滕鑫有限責(zé)任公司,許可證號(hào):SCXK(渝)2007-006?;A(chǔ)飼料購(gòu)自重慶滕鑫有限責(zé)任公司。
桑葉品種為勝利大葉,由重慶市蠶業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院提供,75 ℃熱風(fēng)干燥60 min,粉碎備用[25](干燥桑葉粉中水分4.45%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)、DNJ含量227.47 mg/100 g、黃酮含量49.51 mg/g、多糖11.29%);苦瓜品種為綠玉,購(gòu)于北碚雄風(fēng)超市,60 ℃熱風(fēng)干燥8 h,粉碎備用[26](干燥苦瓜粉中含水分1.22%、皂苷2.31%、多糖7.43%、多肽0.11%)。
穩(wěn)捷型血糖試紙 美國(guó)LifeScan公司;糖原測(cè)定試劑盒、SOD測(cè)定試劑盒(WST-1法)、GSH-Px測(cè)定試劑盒、MDA測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所;TC測(cè)定試劑盒、TG測(cè)定試劑盒、LDL-C測(cè)定試劑盒、HDL-C測(cè)定試劑盒 四川邁克生物科技股份有限公司;羧甲基纖維素鈉(carboxymethylcellulose sodium,CMC-Na)(分析純) 成都市科龍化工試劑廠。
7020型全自動(dòng)生化分析儀 日本日立公司;Model680型酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Rad公司;ONE TOUCHTMBasicTMPlus穩(wěn)捷基礎(chǔ)倍加型血糖監(jiān)測(cè)儀 美國(guó)LifeScan公司;S22可見分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司;5810型臺(tái)式高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司。
1.3.1 桑葉-苦瓜混合粉的制備
根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果[24],將桑葉粉、苦瓜粉按3∶1的質(zhì)量比混合后,各取5、10、15、20 g混合粉分別溶入100 mL 0.01g/mL的CMC-Na水溶液中,得到質(zhì)量濃度分別為0.05、0.10、0.15、0.20 g/mL的桑葉-苦瓜混合液。
1.3.2 小鼠的分組與喂養(yǎng)
實(shí)驗(yàn)小鼠于西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)房?jī)?nèi)飼養(yǎng),室溫(23f1)℃,相對(duì)濕度約60%,12 h光暗交替處理(7∶00ü19∶00)。實(shí)驗(yàn)用正常小鼠100 只,隨機(jī)分為5 組,每組20 只,雌雄各半,自由進(jìn)食飲水,適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。各組小鼠均給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng),LD組(低劑量組)、MD組(中劑量組)、HD組(高劑量組1)、GD組(高劑量組2)小鼠分別灌胃質(zhì)量濃度為0.05、0.10、0.15、0.20 g/mL桑葉-苦瓜混合粉0.5 mL/d,連續(xù)灌胃30 d;NC組(對(duì)照組)灌胃同等體積的0.01 g/mL CMC-Na。
1.3.3 實(shí)驗(yàn)樣品采集
1.3.3.1 血清采集與制備
實(shí)驗(yàn)小鼠灌胃30 d后,禁食不禁水12 h,完成尾靜脈采血測(cè)定血糖值后,摘眼球取血,參照Tsuduki等[27]的方法制備血清,收集上清液,分裝后于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.3.2 肝勻漿的制備
采血完畢后的小鼠頸椎脫臼處死,打開胸、腹腔,取出肝臟,用冷生理鹽水漂洗除去表面血液,濾紙拭干,稱質(zhì)量。準(zhǔn)確稱取一定量的肝臟樣品,加入9 倍體積的生理鹽水,在冰浴上研磨制備肝勻漿,于3 000 r/min離心10 min,取上清液,分裝后于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.4 指標(biāo)測(cè)定
1.3.4.1 小鼠的體質(zhì)量測(cè)定
在小鼠灌胃前及灌胃后的第6、12、18、24、30天分別測(cè)定小鼠的體質(zhì)量,按公式(1)計(jì)算體質(zhì)量增長(zhǎng)率[28]。
式中:m0為小鼠初始體質(zhì)量/g;m1為喂飼一定時(shí)間后小鼠體質(zhì)量增加量/g。
1.3.4.2 血糖濃度測(cè)定
實(shí)驗(yàn)小鼠灌胃前和灌胃第15、30天禁食不禁水12 h,用血糖儀測(cè)定小鼠空腹血糖濃度。按公式(2)計(jì)算血糖下降率[29]。
式中:I1為灌胃前血糖濃度;I2為灌胃后血糖濃度。
1.3.4.3 糖耐量測(cè)定
各組小鼠在末次灌胃前禁食不禁水12 h后,尾靜脈取血測(cè)定血糖作為空腹血糖濃度;灌胃3 h后經(jīng)口給予葡萄糖2.5 g/kg mb,分別于注射后0.5、1.0、2.0 h尾靜脈采血測(cè)血糖濃度。參考《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2003年版)[30],按公式(3)計(jì)算血糖曲線下面積(area under the curve,AUC)。
式中:cA為空腹血糖濃度/(mmol/L);cB、cC、cD分別為腹腔注射葡萄糖0.5、1.0、2.0 h后血糖濃度/(mmol/L)。
1.3.4.4 血清及肝勻漿肝糖原、血脂、抗氧化指標(biāo)測(cè)定
采用全自動(dòng)生化分析儀按照試劑盒說明書測(cè)定血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C濃度;采用酶標(biāo)儀按照試劑盒說明書測(cè)定肝勻漿中肝糖原含量、SOD、GSH-Px活力及MDA含量。
采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以fs表示,采用Duncan顯著性差異檢驗(yàn)進(jìn)行單因素方差分析,P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著,P<0.001為差異高度顯著。
體質(zhì)量能衡量動(dòng)物包括人的健康狀況,超重、肥胖或體質(zhì)量過輕都不是健康的表現(xiàn)。以小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)率為指標(biāo),考察用桑葉-苦瓜混合粉喂飼一定時(shí)間對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響。
表1 桑葉-苦瓜混合粉對(duì)正常小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)率的影響Table1 Effect of mulberry leaf and bitter melon powder blend on body mass gain in normal mice
由表1可知,在實(shí)驗(yàn)過程中,所有小鼠體質(zhì)量均有增加且雄鼠的增長(zhǎng)率高于雌鼠,隨著桑葉-苦瓜混合粉灌胃質(zhì)量濃度的增加,正常小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)率逐漸減小并趨于平緩。當(dāng)灌胃質(zhì)量濃度為0.15 g/mL,雌、雄鼠的體質(zhì)量增長(zhǎng)率分別為11.26%、18.55%,與NC組相比差異極顯著(P<0.01),說明桑葉-苦瓜混合粉對(duì)雌雄小鼠的體質(zhì)量有顯著抑制作用;當(dāng)質(zhì)量濃度增加到0.20 g/mL時(shí),抑制作用趨于穩(wěn)定,與HD組(0.15 g/mL)的體質(zhì)量增長(zhǎng)率無顯著差異(P>0.05)。結(jié)果表明,桑葉-苦瓜混合粉對(duì)正常雌雄小鼠的體質(zhì)量增加有較好的控制作用。
血糖值反應(yīng)了胰島β細(xì)胞對(duì)胰島素的分泌功能。桑葉、苦瓜均具有降血糖的作用,為考察桑葉-苦瓜混合粉是否會(huì)引起正常小鼠血糖濃度過多降低,測(cè)定了不同質(zhì)量濃度桑葉-苦瓜混合粉灌胃30 d對(duì)正常小鼠血糖濃度的影響。
表2 桑葉-苦瓜混合粉對(duì)正常小鼠血糖濃度的影響Table2 Effect of mulberry leaf and bitter melon powder blend on blood glucose in normal mice
由表2可知,NC組小鼠的血糖濃度一直維持在6.22~7.58 mmol/L范圍內(nèi),相對(duì)穩(wěn)定。與NC組相比,隨著灌胃桑葉-苦瓜混合粉時(shí)間的延長(zhǎng)和質(zhì)量濃度的增加,各組小鼠血糖濃度有一定下降,但也維持在4.78~6.46 mmol/L范圍內(nèi),本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與董英[31]、玄光善[32]等研究中昆明種正常小鼠血糖濃度分別為(5.56f1.21)、(5.05f2.37)mmol/L)接近。結(jié)果表明,正常小鼠長(zhǎng)時(shí)間服用桑葉-苦瓜混合粉,血糖濃度仍維持在正常范圍,不會(huì)出現(xiàn)低血糖。
糖耐量即對(duì)葡萄糖的耐受能力。正常人服用一定量葡萄糖后,血糖濃度先升高,經(jīng)過一段時(shí)間的代謝,葡萄糖在機(jī)體合成糖原并加以貯存,血糖濃度恢復(fù)到空腹水平。若服糖2 h后血糖濃度仍然保持較高水平,說明糖耐量能力降低,即機(jī)體對(duì)糖的吸收利用低于正常人[33]。此外,AUC反映葡萄糖被人體利用程度和清除情況,其值增大說明機(jī)體糖耐量能力下降,反之則糖耐量能力升高[24]。
表3 桑葉-苦瓜混合粉對(duì)正常小鼠糖耐量的影響Table3 Effect of mulberry leaf and bitter melon powder blend on glucose tolerance in normal mice
由表3可知,N C組小鼠0 h血糖濃度為(6.64f0.67)mmol/L,注射葡萄糖后2 h其血糖濃度為(5.94f0.51)mmol/L,與空腹血糖濃度比差異無顯著性(P>0.05),AUC為12.62f0.44,表明NC組小鼠對(duì)糖吸收和利用正常。喂飼不同質(zhì)量濃度桑葉-苦瓜混合粉均能不同程度地降低正常小鼠葡萄糖負(fù)荷后的血糖濃度,降低AUC,提高正常小鼠糖耐量。與NC組比較,HD組雌、雄鼠餐后AUC別為10.13f0.62、10.39f0.50(P<0.001),達(dá)到最低,下降率分別為19.73%、18.51%。結(jié)果表明,不同質(zhì)量濃度桑葉-苦瓜混合粉均能顯著降低小鼠餐后2 h血糖濃度,具有提高正常小鼠糖耐量的作用。
當(dāng)血糖升高時(shí)可在肝臟合成糖原,血糖降低,肝糖原將分解為葡萄糖以補(bǔ)充血糖。因此,肝糖原對(duì)維持血糖穩(wěn)定十分重要[34]。正常飲食能不斷補(bǔ)充肝糖原,減少糖原的異生作用。肝糖原的合成和降解受到胰島素的控制,當(dāng)胰島素控制失調(diào),肝糖原的合成也會(huì)失調(diào)[35]。
表4 桑葉-苦瓜混合粉對(duì)正常小鼠肝糖原含量的影響Table4 Effect of mulberry leaf and bitter melon powder blend on hepatic glycogen level in normal mice
由表4可知,N C組小鼠肝糖原含量維持在2.37~2.43 mg/g。隨著灌胃桑葉-苦瓜混合粉質(zhì)量濃度的增加,小鼠肝糖原含量隨之增加,呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。與NC組相比,GD組雌、雄小鼠肝糖原含量分別增長(zhǎng)了1.93、1.98 倍。結(jié)果表明,桑葉-苦瓜混合粉能增加正常小鼠肝糖原的合成,有助于實(shí)驗(yàn)小鼠血糖濃度保持在穩(wěn)定水平。
血脂是血漿中所含脂類的總稱,主要包括膽固醇和甘油三酯,血脂變化可反映體內(nèi)脂質(zhì)代謝的情況。血脂水平的升高與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生有關(guān),尤其是當(dāng)LDL-C濃度過高,其沉積于動(dòng)脈血管壁形成粥樣斑塊;HDL-C可把動(dòng)脈壁上的膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟中進(jìn)行代謝后排出體外,從而減少膽固醇在動(dòng)脈壁上的沉積[36]。在一定程度上降低LDL-C、升高HDL-C濃度有助于預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化[37]。
表5 桑葉-苦瓜混合粉對(duì)正常小鼠血脂濃度的影響Table5 Effect of mulberry leaf and bitter melon powder blend on blood lipids in normal mice mmol/L
由表5可知,與NC組相比,隨著桑葉-苦瓜混合粉灌胃質(zhì)量濃度的增加,正常小鼠血清TC、TG、LDL-C濃度下降,HDL-C濃度上升。各組之間的LDL-C、HDL-C濃度存在高度顯著差異(P<0.001),呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。與NC組相比,GD組雌鼠TC、TG、LDL-C濃度分別下降17.19%、15.00%、41.67%(P<0.01,P<0.001),雄鼠TC、TG濃度無顯著變化,LDL-C濃度下降45.83%(P<0.001);雌、雄鼠HDL-C濃度分別上升64.52%、72.22%(P<0.001)。結(jié)果表明,桑葉-苦瓜混合粉對(duì)正常小鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C濃度有調(diào)節(jié)作用,特別是對(duì)LDL-C、HDL-C濃度影響明顯。
抗氧化物質(zhì)可減少機(jī)體自由基的產(chǎn)生,降低自由基的副作用。SOD、GSH-Px、MDA是常用的反映組織抗氧化能力和氧化損害程度的指標(biāo),其中MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的主要代謝產(chǎn)物,可嚴(yán)重破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu);而SOD、GSH-Px等構(gòu)成了機(jī)體重要的抗氧化酶系統(tǒng),可減少氧自由基的產(chǎn)生,防止脂質(zhì)過氧化及其中間代謝產(chǎn)物對(duì)機(jī)體的損害[38-39]。研究表明,桑葉、苦瓜單獨(dú)使用均能增強(qiáng)糖尿病鼠的抗氧化能力[40-41]。桑葉-苦瓜混合粉對(duì)正常小鼠肝臟抗氧化能力影響的結(jié)果如表6所示。
表6 桑葉-苦瓜混合粉對(duì)正常小鼠抗氧化指標(biāo)的影響Table6 Effect of mulberry leaf and bitter melon powder blend on hepatic antioxidant parameters in normal mice
由表6可知,與NC組相比,隨著桑葉-苦瓜混合粉灌胃質(zhì)量濃度的增加,正常小鼠肝臟SOD、GSH-Px活力隨之增強(qiáng),MDA含量逐漸減少。各組之間的SOD、G S H-P x活力、M D A含量存在高度顯著差異(P<0.001),呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。與NC組相比,GD組雌鼠SOD、GSH-Px活力分別上升41.77%、29.04%(P<0.001),MDA含量下降36.71%(P<0.001);雄鼠SOD、GSH-Px活力分別上升48.41%、27.21%(P<0.001),MDA含量下降37.73%(P<0.001)。結(jié)果表明,一定劑量的桑葉-苦瓜混合粉可增強(qiáng)正常小鼠的抗氧化能力,減少脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生,保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷,保證肝臟脂質(zhì)代謝正常。
本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明,桑葉-苦瓜聯(lián)合作用對(duì)糖尿病小鼠具有很強(qiáng)的降糖、降脂功能[23-24]。桑葉主要活性成分多糖、生物堿對(duì)α-葡萄糖苷酶均有抑制作用,在高質(zhì)量濃度下具有協(xié)同作用[42],進(jìn)而發(fā)揮降血糖的作用。桑葉中的黃酮類物質(zhì)一方面可作為α-葡萄糖苷酶抑制劑[43],另一方面可作為胰島素促分泌劑來降低血糖水平[44]??喙显碥諏?duì)α-葡萄糖苷酶雖無抑制,但能顯著提高正常小鼠糖耐量,恢復(fù)胰島β細(xì)胞的活力,刺激肝糖原合成同時(shí)抑制肝糖原釋放,提高機(jī)體肝糖原的貯存能力[45]??喙显碥者€能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子-α,誘導(dǎo)和增強(qiáng)SOD和GSH-Px的活力。此外,桑葉和苦瓜均富含多酚類物質(zhì),因其具有清除自由基、增強(qiáng)抗氧化能力的作用,可保護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激的傷害,能有效預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)生[46]。
鑒于桑葉、苦瓜兩種藥食同源植物對(duì)糖尿病及高脂血癥小鼠均具有降糖、降脂、抗氧化的功效,為了驗(yàn)證桑葉、苦瓜混合使用對(duì)正常實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無不利影響,本實(shí)驗(yàn)采用桑葉-苦瓜混合粉喂飼正常小鼠,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,隨著灌胃質(zhì)量濃度增加和時(shí)間延長(zhǎng),桑葉-苦瓜混合粉能有效地控制小鼠的體質(zhì)量增長(zhǎng);不會(huì)引起正常小鼠低血糖,同時(shí)還能提高正常小鼠血糖調(diào)節(jié)能力,促進(jìn)肝糖原合成;此外,一定質(zhì)量濃度的桑葉-苦瓜混合粉可調(diào)節(jié)小鼠血脂濃度,有效預(yù)防高血脂癥,增強(qiáng)抗氧化能力,保護(hù)肝臟細(xì)胞免受氧化損傷,保證肝臟脂代謝的穩(wěn)定性。這些結(jié)果均表明桑葉和苦瓜混合飼喂對(duì)正常實(shí)驗(yàn)動(dòng)物并無不利影響,這為桑葉、苦瓜混合粉開發(fā)相關(guān)功能保健食品的適用性提供了參考依據(jù)。