金屬離子對乳酸菌生物膜形成的影響及其機制研究進展

趙佳偉，敖曉琳*，趙 珂

（四川農業(yè)大學食品學院，四川 雅安 625014）

乳酸菌是對能利用乳糖或其他糖類轉化為乳酸的一類革蘭氏陽性兼性厭氧菌的總稱[1]。乳酸菌是食品發(fā)酵工業(yè)常用菌種，作為發(fā)酵劑被廣泛用于不同的發(fā)酵食品（如酸奶、泡菜、香腸等）中，對食品的風味及口感起到很大的改善作用。乳酸菌不僅在發(fā)酵食品中被廣泛應用，其作為生理菌群對人體的健康也起著至關重要的作用。許多研究表明，乳酸菌對于一些疾病具有控制和預防作用。如乳桿菌和雙歧桿菌可以改善阿爾茨海默病患者的認知、情緒功能。雙歧桿菌還可以幫助小鼠黏液層生長[2-3]。Swami等[4]的研究還證實常見的益生菌（包括乳桿菌屬、雙歧桿菌屬等）可以有效地降低糖尿病患者的空腹血糖、胰島素水平，并且能改善胰島素抵抗綜合征。因此，乳酸菌功能及應用開發(fā)是目前研究的熱點。

然而，在乳酸菌發(fā)酵食品的生產和貯藏過程中，通常會因為不良因素（如低酸、高溫、其他食品成分的抑制）而出現(xiàn)乳酸菌活菌數(shù)量下降，甚至顯著下降的情況，此時該產品再進入人體消化道，其中所含的乳酸菌若不能耐受胃酸及腸道環(huán)境，則最終所剩無幾，不能發(fā)揮改善人體健康等功能。因此研究如何改善乳酸菌的環(huán)境耐受性，使其在食品生產、貯藏及進入人體后的活性得到保持對于生產出有益的乳酸菌發(fā)酵食品具有重要的意義。

目前國內外研究提高乳酸菌活性的方法主要有以下幾種：通過離子凝膠等方法將乳酸菌進行微膠囊化，使其環(huán)境耐受性增強[5-6]；添加低聚糖促進乳酸菌生長；采用基因重組改良乳酸菌遺傳特性以及使乳酸菌產生生物膜來抵抗外界的環(huán)境變化[7-8]等方法。其中，生物膜由菌體本身生物合成，而且其能有效提高乳酸菌的抗逆性，因此受到越來越多學者的關注。

1 生物膜

生物膜這一專有名詞于1978年被提出，并很快被認可，也有其他學者將其翻譯為生物被膜[9]。生物膜由細菌細胞、胞外聚合物（extracellular polymeric substances，EPS）和其他顆粒物的水合混合物所組成[10]，是一種可循環(huán)發(fā)展的系統(tǒng)，其形成被認為是通過一系列不連續(xù)的步驟發(fā)生的，包括細胞附著到載體表面、小菌落形成、微菌落成熟或形成蘑菇狀結構[11]。然后由于外界環(huán)境變化，生物膜開始解聚，微生物逐漸從生物膜上脫落擴散，有的還能進入下一個生物膜結構的形成循環(huán)中[12]。

生物膜形成后顯著提高了其對環(huán)境的耐受性。Kubota等[13]研究了形成生物膜之后的植物乳桿菌JCM 1149和浮游菌株在各種有機酸（即乙酸、檸檬酸、乳酸和蘋果酸）、乙醇和次氯酸鈉中的生長情況，結果發(fā)現(xiàn)生物膜中的細菌細胞在靜止或對數(shù)期顯示比浮游細胞具有更好的抗逆性。而且，生物膜中的細菌細胞即使在懸浮或細胞懸浮液被稀釋后仍保持對乙酸的抗性。瑪依諾·木圖拉等[14]對保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的生物膜進行了研究，發(fā)現(xiàn)乳酸菌混菌生物膜具有較高的抗性并能穩(wěn)定地釋放菌體。通過這些研究表明，生物膜的形成可以有效提高乳酸菌的抗逆性。生物膜的形成受到很多的因素影響，包括載體表面的粗糙程度、pH值、黏附力、基因的調控和金屬離子等[15-17]。本文著重論述了金屬離子對于乳酸菌生物膜形成的影響及其機制。

2 金屬離子對于乳酸菌生物膜形成的影響及其機制

金屬離子對于乳酸菌生物膜的形成具有顯著的影響，很多學者對此進行了研究，結果表明Mn2＋、Fe3＋、Fe2＋、Mg2＋和Na＋在一定濃度下會對生物膜形成起到促進作用，Cu2＋、Cu＋、Al3＋、Ca2＋、Pb＋和Zn＋等金屬離子則會對生物膜的形成起到抑制作用。目前研究較多的是錳離子、鐵離子、銅離子和鎂離子，而其他金屬離子對于乳酸菌生物膜形成影響的研究還相對較少。下面將詳細介紹常見的金屬離子對于乳酸菌生物膜形成的影響及其機制。

2.1 錳離子對生物膜形成的影響

錳離子作為乳酸菌生長的促進因子，在乳酸菌生物膜形成的過程中是否起重要作用，基于此問題，許多學者就錳離子對乳酸菌生物膜的形成作用進行了研究。張立冬等[18]的研究結果表明，MRS培養(yǎng)基中添加錳離子后，L. paracasei、L. rhamnosus、L. reuteri和L. plantarum 4 株乳酸菌生物膜的形成表現(xiàn)出較顯著的差異[18]。Nozaka等[19]的研究也顯示，不僅乳酸菌生長受到錳離子的限制，對于一些混合生物膜的形成也受到錳離子的影響，添加10 μmol/L的硫酸錳后植物乳桿菌ML11-11生物膜的形成量顯著增加。

Ibusquiza等[20]研究了單增李斯特菌和植物乳桿菌WCFS1混合生物膜的形成，在酸脅迫條件下，應激反應因子sigB促進了微生物的存活，在補充MnSO4后混合菌株的生物膜開始恢復。說明輕度的酸刺激會導致相關氧化應激產生，錳作為自由基清除劑和氧化應激中關鍵酶的輔助因子促進反應的開始。有研究表明，由于植物乳桿菌缺乏完整的電子傳遞鏈或克雷布斯（Krebs）循環(huán)，同時植物乳桿菌缺乏超氧化物歧化酶，所以需要積累高濃度的錳以清除超氧化物，并在發(fā)酵和有氧生長過程中將其轉化為過氧化氫，來促進生物膜的形成[21]。Watanabe等[22]的研究同樣表明，在高濃度錳離子條件下生長的細胞比用低濃度錳離子條件下生長的細胞對過氧化氫表現(xiàn)出更高的抗性。

在環(huán)境壓力下，細菌的形態(tài)對于維持活性和代謝有著重要的作用[23]。在應激條件下，細菌會分泌EPS來保護細菌免受不利環(huán)境的威脅[24]。有學者表示，過量的錳脅迫（5 760 mg/L）下細胞呈現(xiàn)聚集效應，表明植物乳桿菌CCFM436能調節(jié)其形態(tài)以抵抗錳脅迫[25]。而且在不同的錳離子濃度下，植物乳桿菌CCFM436可以通過精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和賴氨酸來提高EPS的分泌，增加生物膜的穩(wěn)定性[26]。有研究顯示，在錳脅迫條件下錳轉運蛋白調節(jié)劑（MntH和MntR）可以控制細胞間錳離子的濃度[27]。錳轉運蛋白（MntH 1-3）可能主要負責將錳轉運到細胞內，而錳轉運蛋白（MntH 4和MntH 5）在高錳脅迫下將錳轉運出細胞[28]。

由此可見，錳離子對乳酸菌生物膜的形成具有一定的促進作用。錳離子可以通過消除氧化應激促進生物膜的形成，提高EPS的分泌調節(jié)細胞形態(tài)增強生物膜穩(wěn)定性，同時細胞間錳離子濃度受到錳轉運蛋白的調節(jié)?？梢酝ㄟ^添加錳離子來促進乳酸菌生物膜的形成，以及提高乳酸菌生物膜的穩(wěn)定性。

2.2 銅離子對生物膜形成的影響

經(jīng)研究證實，銅離子會抑制多種細菌的生長活性，同時對微生物生物膜形成也具有重要作用。胡學偉等[29]在研究Cu2＋對于生物膜及EPS的影響時發(fā)現(xiàn)，當Cu2＋質量濃度＜2 mg/L時，Cu2＋會抑制生物膜分泌EPS，當2 mg/L＜Cu2＋質量濃度＜5mg/L時，生物膜分泌EPS的量增加，當Cu2＋質量濃度＞5 mg/L，生物膜系統(tǒng)出現(xiàn)不穩(wěn)定的現(xiàn)象；比較蛋白質/多糖發(fā)現(xiàn)，Cu2＋對生物膜的抑制主要是對生物膜上胞外多糖的抑制，而生物膜對Cu2＋的抵抗表現(xiàn)為分泌更多的EPS，EPS與Cu2＋濃度呈線性正相關。Mosier等[30]研究了干酪乳桿菌和巴斯德酵母生物膜對于Cu2＋的吸收，發(fā)現(xiàn)在HCl洗滌和生物膜再生長之后，Cu2＋結合活性增加約5 倍。Yilmaz等[31]在研究屎腸球菌對于Cu2＋的吸附時也發(fā)現(xiàn)了相似的結果，即在pH 6.0下生物吸附能力達到最大。這些結果表明在HCl洗滌過程中被占據(jù)的Cu2＋結合位點被釋放，而且生物膜或底物（或兩者）被HCl調節(jié)暴露了另外的結合位點，從而破壞了生物膜的空間結構的穩(wěn)定性。

Cu2＋和Cu＋對于細菌生物膜都有一定的抑制和破壞作用，而且Cu＋的抑制作用更強[32]。根據(jù)Lee等[33]的研究顯示，Cu2＋和羥胺可以生成Cu＋，Cu＋將氧氣活化成過氧化氫，隨后Cu＋與過氧化氫能夠降解有機物質（蛋白質和多糖）的高活性氧化劑，從而破壞EPS。

通過相關研究結果可以看出，Cu2＋和Cu＋對于生物膜具有抑制形成和破壞作用，其中Cu2＋通過抑制生物膜分泌EPS來降低生物膜的穩(wěn)定性，而Cu＋通過形成高活性氧化劑來降解EPS，破壞生物膜結構。但在一定濃度內生物膜對其具有一定的耐受性。

2.3 鐵離子對生物膜形成的影響

鐵離子作為許多細菌生長的促進因子，對生物膜的形成過程也起著重要的作用。Bruslik等[34]研究了鐵參與鼠李糖乳酸菌生物膜形成的過程發(fā)現(xiàn)，在鐵離子濃度達到1 000 μmol/L時生物膜的形成顯著增加，并且添加乙二胺四乙酸（500～2 500 μmol/L）不影響細菌的生長，但當與FeCl3一起添加時生物膜的增長受到抑制，進一步表明鐵離子對于鼠李糖乳桿菌生物膜形成具有促進作用。陳凱[35]的研究結果顯示，鐵離子通過直接影響微生物生理或間接影響EPS組分對生物膜的形成造成影響。2 mg/L Fe3＋有助于生物膜的形成，而16 mg/L Fe3＋明顯抑制了生物膜的生長和活性，并且16 mg/L Fe3＋刺激了EPS的大量分泌；生物膜EPS組分結果進一步表明2 mg/L Fe3＋有利于溶解性EPS和松散附著型EPS的增加并促進微生物的聚集，而16 mg/L Fe3＋會刺激緊密黏附型EPS大量分泌，這為微生物提供了保護層；并且鐵離子對EPS中蛋白質的üCONH—、多糖中的CüO及核酸中的磷酸基團產生顯著影響，鐵離子會與EPS各基團中的碳原子或氧原子產生架橋作用。

Banin[11]、Oliveira[36]和Morrissey[37]等分別研究了鐵對銅綠假單胞菌和表皮葡萄球菌生物膜形成的影響，結果都表明鐵離子主要作用于生物膜形成初期，僅通過被動擴散無法提供足夠的鐵用于生物膜的形成，需要鐵載體ABC轉運蛋白的參與，在沒有足夠的內源性鐵的情況下，可以通過特定的鐵響應ECF σ因子系統(tǒng)來獲得檸檬酸鐵或鐵胺鹽用于生物膜形成。同時還有研究指出，鐵吸收調節(jié)因子（ferric uptake regulator，F(xiàn)ur）可以調節(jié)細胞內鐵水平的基因表達[38]。此外王婧等研究了羅伊氏乳桿菌EPS對于鐵離子的吸附表明，相比于Fe2＋，羅伊氏乳桿菌EPS更容易結合Fe3＋，這主要是由于Fe2＋的離子半徑大于Fe3＋，能更好地克服空間位阻，其中胞外多糖中的OüH、COO－和CüOH作為主要作用基團參與鐵離子的結合[39]。

從上述研究來看，鐵離子對乳酸菌生物膜的形成初期具有促進作用，鐵離子可以通過刺激EPS的分泌和產生架橋作用來提高生物膜穩(wěn)定性。乳酸菌生物膜形成過程中對鐵離子的吸收受到鐵轉運蛋白的調控，F(xiàn)ur可能對乳酸菌細胞內鐵水平的基因表達產生影響。

2.4 其他金屬離子對生物膜形成的影響

除了上述的幾種金屬離子外，還有一些金屬離子對于生物膜的形成也有不同程度的影響。張立冬等[18]的研究表明L. rhamnosus、L. reuteri在缺乏鎂離子的MRS培養(yǎng)基中，生物膜的形成受到顯著抑制。賴信可[40]的研究表明，鎂離子在低于24 mg/L時對生物膜的形成具有一定的促進作用，其主要影響掛膜期，對于進入到成熟期后影響基本不明顯。這可能主要是由于鎂離子作為一種結構離子，是生物體代謝過程必不可少的元素，并且是多種酶反應的輔助因子[41]；帶正電荷的鎂離子可以中和微生物細胞表面的負電荷，使細胞容易聚合[42]；鎂離子可以與EPS中帶負電的官能團結合，形成微生物間的橋接功能，保持生物膜結構的完整性[43]。而且在實驗中發(fā)現(xiàn)30 mg/L的鎂離子使生物膜的形成變慢。這可能是由于濃度過高帶正電的鎂離子使微生物細胞膠粒表面正電荷變得緊密，影響了微生物營養(yǎng)的攝入；鎂離子還可以與溶液中的CO32－和CO2反應生成MgCO3，導致傳質通道堵塞，影響生物膜的形成；過高濃度的鎂離子還會影響交聯(lián)靜電相互作用，從而抑制生物膜的形成[44-45]。從上述研究來看，鎂離子對于生物膜形成的影響時具有兩面性的。在低于24 mg/L時鎂離子對于生物膜的形成具有促進作用，而大于30 mg/L時則會產生抑制作用?？梢酝ㄟ^將鎂離子控制在合理濃度范圍來促進生物膜的形成。

對于Na＋來說，一定濃度的鈉離子可以促進生物膜的形成，張國麗等[12]的研究表明，在20 mg/mL＜Na＋質量濃度＜40 mg/mL時生物膜的形成量與其濃度成正比。這與徐文生等[46]研究雙歧桿菌生物膜形成的結果類似，低濃度的Na＋可以促進生物膜的形成。任曉鏷等[47]的研究結果也顯示出，在質量分數(shù)6%的NaCl條件下，戊糖乳桿菌可以形成相對較強的生物膜。這是由于細菌受到高滲透壓脅迫，或者其相關基因的表達受到影響而促進了生物膜的形成。Lim等[48]對金黃色葡萄球菌的研究表明，鹽誘導生物膜形成受到rbf基因的調控。Valle等[49]研究顯示滲透壓可以補償生物膜表型不穩(wěn)定，使生物膜變得平滑。但是也有學者研究表明，0.3 mol/L的NaCl對于鼠李糖乳桿菌生物膜的形成有輕微的抑制作用[50]。這可能是由于鼠李糖乳桿菌作為腸道微生物耐鹽性較差的緣故。

有研究表明，鋁離子對于生物膜形成的初期有抑制作用，這可能是由于鋁離子對于微生物生長有一定的毒害作用，但是鋁離子對于生物膜的毒害是非急性且可逆的，到了生物膜形成的成長期和成熟期時抑制作用就會下降，主要是生物膜對鋁離子產生了耐受性[51-52]。

王堯禹等[53]研究了氫氧化鈣作用后糞腸球菌生物膜相關基因，包括明膠酶明膠酶E基因（gelE）、表面蛋白基因（esp）、膠質蛋白黏附素基因（ace）、細胞溶血素A基因（cylA）的表達情況，得出氫氧化鈣作用生物膜可抑制糞腸球菌基因gelE、cylA、ace、esp的表達。從而抑制糞腸球菌生物膜的形成。

Gerbino等[54]研究了L. keir JCM818和L. keir CIDCA 8348兩個菌株，發(fā)現(xiàn)相對原子質量較小的金屬離子（Ni＋、Zn2＋）比相對原子質量大的金屬離子（Pb＋）更容易進入生物膜內部。這是由于金屬離子會對S層蛋白產生影響。S層蛋白是指是覆蓋在細胞外殼最外層的結構，通過非共價鍵連接到肽聚糖層，由蛋白質組成，有排列大小相同的孔，可以使活細胞與金屬離子進行交換。S層蛋白有大量的金屬結合位點，低特異性，可以結合不同的金屬[55]。S層蛋白與金屬離子之間是通過金屬與Asp和Glu的羧酸鹽側鏈發(fā)生配位反應[56]。金屬離子會導致β-折疊含量的增加和α-螺旋含量的減少[57]。在L. keir中肽骨架中的氮原子不參與同金屬離子的配位反應。而且較小的金屬離子會更容易穿過L. keir JCM818的S層蛋白并干擾到細胞使其變得更加疏水。通過傅里葉變換紅外光譜檢測發(fā)現(xiàn)JCM5818的α-螺旋含量的減少和CIDCA8348的β-折疊含量的增加幾乎與金屬離子的半徑呈線性關系。這就表明金屬離子還可以影響生物膜的空間結構，從而破壞生物膜的穩(wěn)定性，抑制生物膜的形成。

3 結 語

綜上，Mn2＋、Fe3＋、Mg2＋和Na＋在一定濃度下都可以對生物膜產生促進作用（表1）。Mn2＋主要是通過消除氧化應激，刺激分泌更多的EPS來促進生物膜的形成；在一定濃度內的Mg2＋可以促進初期生物膜的形成，而過高濃度則會導致傳質通道堵塞，影響營養(yǎng)的攝入抑制生物膜形成。有研究表明一些金屬二價陽離子對于對細菌的脂多糖有穩(wěn)定作用，其與陰離子產生的靜電相互作用也有助于細菌的聚集和黏附[58]。Fe3＋主要是促進EPS的分泌，產生架橋作用，提高基因的表達水平來提高生物膜的穩(wěn)定性；Na＋則主要是在低濃度下促進相關基因的表達和補償生物膜表型不穩(wěn)定來促進生物膜的形成。

表1 金屬離子對乳酸菌生物膜形成的促進作用Table1 Promotion effect of metal ions on biof i lm formation of Lactobacillus

然而Cu2＋、Cu＋、Al3＋、Ca2＋、Pb＋和Zn＋等金屬離子會對生物膜的形成產生抑制（表2）。其中Cu2＋主要形成高氧化劑分解有機物質，還可以破壞生物膜的結構來影響生物膜；Ca2＋則通過影響相關基因的表達來抑制生物膜的形成；Al3＋通過影響微生物的活性來影響生物膜的形成；Pb＋、Zn＋等金屬離子則主要通過影響S層蛋白進而影響生物膜的空間結構。

表2 金屬離子對乳酸菌生物膜形成的抑制作用Table2 Inhibitory effect of metal ions on the biof i lm formation of Lactobacillus

目前國內外對于生物膜的研究還主要集中在相關基因的表達和防治生物膜的形成方面，而對于乳酸菌生物膜的利用研究較少，本文通過綜述金屬離子對于乳酸菌生物膜形成的影響及機制，希望可以為利用生物膜改善乳酸菌活性提供一定的理論依據(jù)和研究方向。