長鏈非編碼RNA KCNQ1重疊轉錄物1對肺鱗癌細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響

任開明

(中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院 胸外科, 遼寧 沈陽, 110004)

在中國，肺癌的發(fā)病率和病死率均居惡性腫瘤的首位，而肺鱗癌的發(fā)病率約占肺癌的1/3以上。多數肺鱗癌患者在初診時已是晚期，治療效果不佳[1]。目前，肺鱗癌主要的治療策略仍是手術切除輔助術后放射治療和化學藥物治療。近年來，針對肺鱗癌的突破性的精準治療，尤其是靶向治療方面無明顯進展，研究[2]肺鱗癌發(fā)生進展的分子機制，發(fā)現潛在的治療靶點尤為重要。長鏈非編碼RNA(lncRNA)一般是指大于200 nt的RNA, 位于細胞核內或胞漿中，不參與蛋白質編碼功能，以RNA形式在表觀遺傳調控、轉錄調控以及轉錄后調控等多種層面上調控下游的功能基因的表達水平，能夠參與細胞增殖、細胞周期、細胞分化、細胞凋亡以及細胞自噬性死亡等調節(jié)，進而發(fā)揮其生物學作用[3]。LncRNA KCNQ1重疊轉錄物1(KCNQ1OT1)定位11p15.5, 屬于lncRNA。研究[4]發(fā)現其在結腸、直腸癌中存在表達及功能異常，而其在肺鱗癌中的功能和分子機制迄今尚無深入的研究。本研究擬檢測lncRNA KCNQ1OT1在肺鱗癌組織中的表達，并研究KCNQ1OT1對肺鱗癌NCI-H266細胞增殖、遷移和侵襲等細胞生物學表型的調節(jié)作用[5], 現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 標本與試劑

收集51例手術切除的肺鱗癌組織及相應的距腫瘤5 cm以上的癌旁組織標本，標本來源于2015年1月—2016年12 月中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院胸外科手術患者，其中男28例，女23例。所有標本經病理鑒定均診斷為肺鱗癌。NCI-H266細胞系購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。KCNQ1OT1 smart silencer (siRNA-KCNQ1OT1)由廣州銳博公司合成。Real-time PCR基因檢測分析試劑盒購自TaKaRa公司, PCR引物委托大連TaKaRa公司合成。脂質體轉染試劑Lipofectamine 3000為Invitrogen公司產品, MTT試劑盒為碧云天公司產品, Transwell小室購自美國Corning公司，Matrigel膠購自美國Becton Dickinson公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 Real-time PCR: 待檢測組織標本置于預冷的研缽中，加入液氮用研杵研磨成粉末，加入TRIZOL, 提取總RNA并逆轉錄成cDNA。兩步法擴增KCNQ1OT1基因。KCNQ1OT1引物序列: Forward為5′-CTTTGCAGCAACCTCCTTGT -3′, Reverse為5′- TGGGGTGAGGGATCTGAA -3′。以GAPDH 基因為內參，根據實驗所獲Ct值對KCNQ1OT1進行相對定量分析，分析方法選用比較CT值法(2-ΔΔCT法)。

1.2.2 細胞轉染: 收獲處于對數生長期至60%～70%融合的NCI-H266細胞。應用Lipofectamine 3 000轉染試劑，按說明操作分別將si-KCNQ1OT1及si-NC轉染NCI-H266細胞。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細胞進行相應檢測。

1.2.3 細胞增殖活力檢測: 空白對照組為未轉染的NCI-H266細胞; 陰性對照組為轉染si-NC的NCI-H266細胞; KCNQ1OT1組為轉染si-KCNQ1OT1的NCI-H266細胞, MTT 法檢測細胞增殖活力。

1.2.4 細胞劃痕實驗: 將各組細胞接種到六孔板上，培養(yǎng)細胞匯合至80%左右時，用1 mL的移液槍頭在六孔板的中央迅速劃出一條直線，吸走培養(yǎng)液, PBS洗2次，放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)。連續(xù)觀察2 d, 查看劃痕的間距，并測量照相。

1.2.5 細胞侵襲實驗: 用無血清的opti-MEM培養(yǎng)基配Matrigel膠，均勻鋪在直徑為6.5 mm、孔徑為8.0 μm的Transwell小室內面?zhèn)溆?。?4孔板，每孔含20%胎牛血清的F12K培養(yǎng)基，放上Transwell小室; 將各組細胞消化后加入不含血清的opti-MEM培養(yǎng)基分別均勻地鋪在上室內培養(yǎng)。24 h后取出小室，清洗，上室面細胞擦涂凈; 將小室放入多聚甲醛固定液中，細胞固定，放入結晶紫染料中染色、清洗。在倒置鏡下觀察細胞個數。

1.3 統(tǒng)計學方法

每組實驗重復3次，應用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對數據進行處理，計量資料統(tǒng)計結果以均值±標準差表示。2組間差異比較采用t檢驗。多組間差異比較應用單因素方差分析，再用LSD-t檢驗做兩兩比較。檢驗水準α=0.05,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 KCNQ1OT1在肺鱗癌組織中的表達及其與臨床病理參數的關系

Real-time PCR結果采用比較Ct值法分析進行相對定量，結果顯示KCNQ1OT1在肺鱗癌組織中呈顯著高表達，為癌旁正常組織中KCNQ1OT1表達量的346%, 差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。KCNQ1OT1的表達與多種肺鱗癌的臨床病理參數相關，包括分化程度、腫瘤大小、淋巴結轉移情況以及TNM分期。隨著肺鱗癌分化程度的降低、腫瘤體積的增大、TNM分期的增加以及淋巴結轉移的出現，肺鱗癌中KCNQ1OT1的表達顯著增高(P<0.01); KCNQ1OT1表達與性別、年齡等其他臨床病理因素無相關性。見表1。

表1 KCNQ1OT表達與肺鱗癌患者臨床病理參數的

與同一參數另一亞項比較, **P<0.01。

與癌旁組織比較, ?P<0.05圖1 51例肺鱗癌組織與相應癌旁正常肺組織中KCNQ1OT1的表達

2.2 沉默KCNQ1OT1基因對NCI-H266 細胞增殖、凋亡及侵襲能力的影響

Real-time PCR檢測顯示，與對照組細胞相比, si-KCNQ1OT1的轉染能夠顯著下調NCI-H266細胞中KCNQ1OT1的表達(P<0.05), 沉默KCNQ1OT1能夠顯著抑制NCI-H266細胞的增殖活力、遷移能力、侵襲能力(P<0.05)。見圖2。

3 討 論

目前，越來越多的證據支持lncRNA在多種生物學進程中發(fā)揮重要作用，并參與了包括腫瘤在內的多種人類疾病的發(fā)生，而且lncRNA參與了幾乎所有的生理和病理的細胞學特性，能夠通過復雜的調節(jié)機制調節(jié)細胞的增殖、凋亡、遷移和自噬等生物學表型[6-9]。某些lncRNA已被證實在多種腫瘤中存在表達和功能異常，而且可以作為腫瘤相關基因參與腫瘤的發(fā)生、惡性進展、侵襲轉移及化療耐藥等的調節(jié)[10-12]。KCNQ1OT1基因定位11p15.5, 屬于lncRNA。KCNQ1OT1的轉錄本是KCNQ1基因的反義鏈，是一個非拼接lncRNA。KCNQ1OT1與染色質互相作用，通過表觀遺傳學機制調節(jié)多個靶基因的轉錄。KCNQ1OT1在腫瘤中的研究尚處于起步階段。有研究[13-14]報道, KCNQ1OT1在結直腸癌中存在顯著表達和功能異常。Wan J等[14]研究發(fā)現, KCNQ1OT1中的短串聯(lián)重復序列(STR)多態(tài)性(rs35622507)與肝細胞癌的易感性相關。作者在lncRNA芯片篩查中發(fā)現, KCNQ1OT1在5例肺鱗癌組織中表達顯著上調。而后，作者應用實時定量PCR檢測了51例肺鱗癌組織，大樣本組織表達檢測證實了KCNQ1OT1在肺鱗癌中確實存在顯著的表達上調，這與李靜等[15]發(fā)現KCNQ1OT1在89例非小細胞肺癌中的表達水平明顯增高相符。這初步證實KCNQ1OT1的表達異?？赡芘c肺鱗癌的發(fā)生相關。本研究還發(fā)現, KCNQ1OT1的表達與多種肺鱗癌的臨床病理參數相關。隨著肺鱗癌腫瘤體積的增大、分化程度的降低、TNM分期的增加以及淋巴結轉移的出現，肺鱗癌中KCNQ1OT1的表達明顯增高，進一步提示KCNQ1OT1可能在肺鱗癌的進展和侵襲轉移中發(fā)揮作用。

Control表示空白對照組, si-NC表示轉染si-NC的NCI-H266細胞, si-KCNQ1OT1表示轉染si-KCNQ1OT1的NCI-H266細胞。

A: 轉染si-KCNQ1OT1顯著降低NCI-H266細胞中KCNQ1OT1表達，且與control、si-NC比較, *P<0.05;

B: MTT法檢測KCNQ1OT1表達沉默能抑制NCI-H266細胞的增殖活力，且與control、si-NC比較, *P<0.05;

C: KCNQ1OT1表達沉默能抑制NCI-H266細胞遷移能力; D: Transwell法檢測KCNQ1OT1表達沉默能抑制NCI-H266細胞的侵襲能力，且與control、si-NC比較, *P<0.05。

圖2 沉默KCNQ1OT1基因對NCI-H266細胞增殖、凋亡及侵襲能力的影響

KCNQ1OT1在肺鱗癌中的功能尚不清楚，亦無相關文獻報道。作者應用RNA干擾技術沉默了肺鱗癌NCI-H266細胞中的KCNQ1OT1表達，并檢測其表達沉默對NCI-H266細胞的增殖、凋亡及侵襲能力的影響。實驗結果發(fā)現, KCNQ1OT1沉默能夠顯著抑制NCI-H266細胞的增殖活力以及遷移和侵襲能力。KCNQ1OT1沉默能夠顯著地抑制NCI-H266細胞的惡性生物學表型，證明KCNQ1OT1在肺鱗癌中發(fā)揮腫瘤促進作用，可能是肺鱗癌潛在的癌基因。

上述研究結果證實KCNQ1OT1的腫瘤促進作用，但其作用機制尚不清楚。近期有研究[16]報道, KCNQ1OT1能夠促進印記基因SLC22A18的表達，而SLC22A18基因在非小細胞肺癌中表達上調[17], 沉默其表達能夠抑制非小細胞肺癌細胞的增殖和侵襲，并誘導細胞凋亡[15]。據此作者推測, KCNQ1OT1可能在肺鱗癌中通過促進SLC22A18基因的表達，進而參與肺鱗癌細胞的惡性生物學表達的調控中，這需要進一步地深入研究。