糖維膠囊對2型糖尿病大鼠視網(wǎng)膜缺氧誘導因子-1α和核因子-κB水平的影響

崔 杰

糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic Retinopathy，DR)是糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)的嚴重微血管并發(fā)癥，也是造成患者失明的主要原因[1]。早期DR的特征是血管神經(jīng)炎癥、細胞凋亡和血-視網(wǎng)膜屏障(BRB)的破壞。雖然DM患者的臨床評估和視網(wǎng)膜解剖提供了關(guān)于DR的特征和進展的信息，但是該疾病的潛在病理生理機制尚未被闡明。缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)為一種重要的內(nèi)源性信號蛋白，研究表明，由缺血缺氧引起HIF-1α升高會導致血管新生[2]。核因子-κB(NF-κB)在DM并發(fā)癥中發(fā)揮重要作用，它可調(diào)節(jié)參與炎癥反應(yīng)眾多基因的轉(zhuǎn)錄[3]。目前對于DR的治療主要為控制血糖，糖維膠囊是一種以格列本脲為主，其它中藥為輔的中西藥結(jié)合控制血糖的藥物。本文旨在探討糖維膠囊對糖尿病視網(wǎng)膜病變的作用，為該藥的應(yīng)用提供基礎(chǔ)實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑和儀器

1.1.1動物和分組：選擇6-7周齡，體重200-250g的雄性SPF級SD大鼠45只(購自凱學生物技術(shù)有限公司，SCXK(滬)2016-36)。每籠兩只，置于室溫20-25℃，濕度50%± 5%和12 h光照/黑暗循環(huán)環(huán)境中，提供充足食物和水。將45只大鼠隨機分為對照組(NC組，n=10)和2型DM模型組(模型組，n=45)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后造模。

1.1.2主要試劑：糖維膠囊(成份：黃芪、黃精、天花粉、葛根、黃連、丹參、格列本脲；石藥集團河北唐威藥業(yè)有限公司，批號：20151126，規(guī)格：0.5g/囊)；格列本脲片(天津藥物研究院藥業(yè)有限公司，批號：20151023，規(guī)格：2.5mg/片)；鏈脲佐菌素(STZ，S0130; Sigma-Aldrich)；檸檬酸鈉、檸檬酸(大自然生物集團)；抗HIF-1α抗體(3716s，CST)；抗NF-κB抗體(8242s，CST)；抗β-actin抗體(sc-130656，Santa Cruz)。

1.1.3主要儀器：蔡司顯微鏡(Axio Lab.A1，zeiss)； Real-Time PCR檢測系統(tǒng)(Bio-Rad CFX96)，低溫高速離心機(湖南湘儀)；Western blot全能轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(Bio-Rad)；天平(FA2004B，上海平軒科學儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1大鼠2型DM模型制備：模型組大鼠用高脂高糖(大鼠基礎(chǔ)飼料68%，蔗糖10%、蛋黃粉10%、豬油10%、膽固醇1.8%、膽鹽0.2%)喂養(yǎng)8周，通過單次腹腔注射STZ(55mg/kg，采用0.1mol/L和pH4.4-4.5檸檬酸緩沖液制備)復制2型DM模型[4]。對照組大鼠腹腔注射等量檸檬酸緩沖液(無菌pH4.4-4.5)。72h后，空腹血糖水平> 16.7mmol/L即造模成功，2只在造模過程死亡，3只造模失敗，成模30只。

1.2.2成模大鼠分組與處理：將成模后大鼠隨機分為三個亞組：DM組、格列本脲治療組(DM+G組)、糖維膠囊治療組(DM+T組)。造模成功后，DM+G組大鼠給予20mg/kg/天格列本脲灌胃，DM+T組給予150mg/kg/天糖維膠囊灌胃，DM組和NC組給予等量生理鹽水灌胃。連續(xù)灌胃4周。

1.2.3視網(wǎng)膜標本采集與處理：大鼠灌胃4周后腹腔注射麻醉，手術(shù)摘除大鼠眼球后迅速置于-80℃冰箱，實驗前取出在高壓無菌環(huán)境中剝離大鼠視網(wǎng)膜。將視網(wǎng)膜組織常規(guī)石蠟包埋切片(4μm)。脫蠟脫水，常規(guī)HE染色，光學顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜病理變化。

1.2.4RT-PCR檢測NF-κB、HIF-1α mRNA表達量：使用TRIzol(目錄號15596； Thermo Fisher Scientific，Inc.，Waltham，MA，USA)法提取視網(wǎng)膜(每組取3只大鼠)總RNA，測定濃度和純度后使用TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(目錄號AT301; TransGen Biotech Co.，Ltd.，Beijing，China)將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用TransStart Top Green qPCR SuperMix(目錄號AQ131; TransGen Biotech Co.Ltd)通過RT-qPCR檢測NF-κB和HIF-1α mRNA相對表達水平，以β-actin為內(nèi)參照。使用Primer Express軟件2.0版系統(tǒng)(Applied Biosystems; Foster City，CA，USA)設(shè)計引物。引物序列如下：β-actin，正向5'-AGC CAT GTA CGT AGC CAT CC-3'，反向5'-ACC CTC ATA GAT GGG CAC AG-3'；NF-κB，正向5'-TGA GGC TGT TTG GTT TGA GA-3'，反向5'-TTA TGG CTG AGG TCT GGT CTG-3'；HIF-1α，正向5'-ACA AGT CAC CAC AGG ACA G-3'，反向5'-AGG GAG AAA ATC AAG TCG-3'。使用以下循環(huán)方案進行PCR反應(yīng)：95℃ 5min預變性，95℃ 5s，58℃ 15s和72℃ 20s，45個循環(huán)。擴增后運行解離曲線以鑒定特定的PCR產(chǎn)物。所有程序均按照制造商的協(xié)議進行。使用2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達水平。

1.2.5Western blotting法檢測NF-κB、HIF-1α蛋白水平：采用蛋白提取試劑盒(北京中山金橋生物技術(shù); OriGene Technologies，Inc.，Rockville，MD，USA)提取視網(wǎng)膜蛋白質(zhì)，Bradford蛋白質(zhì)測定法測定蛋白濃度。操作步驟為：通過8%-12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量蛋白質(zhì)(800μmol/L)并電轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜(EMD Millipore，Billerica，MA，USA)上。將膜在5%脫脂奶中室溫封閉2h，并與抗HIF-1α抗體(多克隆兔抗大鼠； 1∶1 000)，抗NF-κB抗體(多克隆兔抗鼠； 1∶1 000)4℃過夜。將膜在0.1%TBS-Tween-20中洗滌，并在室溫下與抗兔IgG二抗(目錄號ZDR-5306；1∶5 000，北京中山金橋生物技術(shù))共孵育1h。最后用ChemiDoc TM MP系統(tǒng)(Bio-Rad Laboratories)對印跡進行掃描，并使用ImageJ 1.51軟件(National Institutes of Health，Bethesda，MA，USA)對條帶進行定量分析。以β-actin為內(nèi)參照，采用目標蛋白與β-actin蛋白條帶灰度比值代表該蛋白的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠視網(wǎng)膜病理改變

光鏡下觀察NC組、DM組、DM+G組及DM+T組視網(wǎng)膜變化。NC組大鼠視網(wǎng)膜的所有細胞層清晰整齊地排列，視網(wǎng)膜呈現(xiàn)疏松水腫。DM組，視網(wǎng)膜水腫，視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層出現(xiàn)核固縮，內(nèi)核層排列紊亂，DM+G組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層病變減輕，DM+T組大鼠，視網(wǎng)膜水腫顯著減弱，神經(jīng)節(jié)層整齊排列。詳見圖1。

圖1 不同組別大鼠視網(wǎng)膜病理改變情況(HE，×200)

2.2 各組大鼠NF-κB、HIF-1α mRNA表達量

各組大鼠NF-κB mRNA表達水平差異有統(tǒng)計學意義(F=24.852，P<0.05)。與NC組比較，DM組NF-κB mRNA表達水平明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(q=11.457，P<0.05)，與DM組比較，DM+G組和DM+T組NF-κB mRNA表達水平均下降(q=5.697、9.165，P均<0.05)，且DM+T組下降更明顯，差異有統(tǒng)計學意義(q=3.468，P<0.05)。各組大鼠視網(wǎng)膜組織HIF-1α mRNA表達水平差異有統(tǒng)計學意義(F=6.451，P<0.05)。與NC組比較，DM組大鼠HIF-1α mRNA表達水平明顯上升(q=5.297，P<0.05)，與DM組比較，DM+G組HIF-1α mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義(q=1.676，P>0.05)，DM+T組則明顯下降(q=4.827，P<0.05)。

表1 各組大鼠NF-κB、HIF-1α mRNA相對表達量

注：與NC組比較，1)P<0.05；與DM組比較，2)P<0.05；與DM+G組比較，3)P<0.05

2.3 各組大鼠NF-κB、HIF-1α蛋白表達量

各組大鼠NF-κB 蛋白表達水平比較差異有統(tǒng)計學意義(F=54.782，P<0.05)。與NC組比較，DM組NF-κB蛋白表達水平明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(q=15.614，P<0.05)，與DM組比較，DM+G組和DM+T組NF-κB蛋白表達水平均下降(q=4.229、13.337，P<0.05)，且DM+T組下降更明顯，差異有統(tǒng)計學意義(q=9.108，P<0.05)。各組大鼠視網(wǎng)膜組織HIF-1α 蛋白表達水平差異有統(tǒng)計學意義(F=22.431，P<0.05)。與NC組比較，DM組大鼠HIF-1α 蛋白表達水平明顯上升(q=11.060，P<0.05)，與DM組比較，DM+G組和DM+T組HIF-1α 蛋白表達水平明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(q=5.530、8.391，P>0.05)。

表2 各組大鼠NF-κB、HIF-1α蛋白相對表達量

注：與NC組比較，1)P<0.05；與DM組比較，2)P<0.05；與DM+G組比較，3)P<0.05

3 討 論

DR是一種以細胞凋亡和神經(jīng)炎癥為特征的血管性神經(jīng)炎癥疾病，為DM致盲的主要原因，也是DM最常見的并發(fā)癥之一[5]。DR的發(fā)病機制未闡明，認為是多種因素作用的結(jié)果。DR在DM實驗模型中的早期征兆是缺氧應(yīng)激引起的血管炎癥，促炎細胞因子和炎性介質(zhì)已被報道可促進血管通透性增加、白細胞黏附和視網(wǎng)膜細胞死亡[6]。

研究顯示，視網(wǎng)膜NF-κB在DM早期被激活，并保持激活達14個月[7]。糖尿病視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞核中NF-κB的p50亞基積聚增加，提示NF-κB在DM患者的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)中也明顯被激活。本研究表明，在高血糖環(huán)境中，視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞NF-κB表達增加，這與上述研究結(jié)果一致。HIF是一種異二聚體轉(zhuǎn)錄因子，在低氧條件下被激活和穩(wěn)定，并促進血管生成因子如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-3)，紅細胞生成因子如紅細胞生成素(EPO)細胞存活和增殖因子如 (IGF-2)、分化抑制因子2(ID2)、一氧化氮合酶(NOS)等生成增加[8]。HIF-1α是一個氧敏感的亞基，在低氧條件下表達，據(jù)報道阻斷或沉默HIF-1α調(diào)節(jié)的VEGF通路對DM有潛在益處[9]。在本研究中，DM大鼠視網(wǎng)膜NF-κB和HIF-1α表達增多。NF-κB和HIF-1α均是炎癥相關(guān)因子，在高血糖誘導的低氧環(huán)境中，二者均會導致血管新生。本研究中，DM+G組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層病變減輕，且NF-κB、HIF-1α mRNA及蛋白表達水平均下降，從一定程度上減輕了視網(wǎng)膜損傷的嚴重程度，但療效不如DM+ T組。這可能與糖維膠囊在控制血糖治療的同時通過黃芪[10]益氣養(yǎng)精、丹參活血通絡(luò)等的作用，協(xié)同降低血糖，通暢脈絡(luò)，降低因高血糖引起的缺氧壓力有關(guān)。本文DM+T組大鼠NF-κB及HIF-1α表達水平較DM+G組下降明顯，也從分子層面闡釋了糖維膠囊在降低血糖及減輕低氧壓力中的作用較格列本脲作用顯著。結(jié)合本文結(jié)果推測糖維膠囊的治療作用主要體現(xiàn)在其有效控制血糖的能力，但其是否直接作用于NF-κB及HIF-1α有待進一步深入研究。

綜上所述，糖維膠囊因其中西藥結(jié)合相互作用的結(jié)果，能夠有效降低DM大鼠視網(wǎng)膜NF-κB及HIF-1α表達水平，對控制血糖、減輕視網(wǎng)膜缺氧壓力有顯著作用。