HPLC法同時測定泰山紫草中5種萘醌類成分的含量

山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)，山東 泰安 271016

泰山紫草(又稱硬紫草)為紫草科植物紫草LithospermumerythrorhizonSieb.etZuce的干燥根[1]。據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》記載，紫草味苦、性寒，具有涼血、活血、清熱、解毒、消炎和透疹的功能，紫草中主要有效成分為羥基萘醌類，具有抗菌、抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抗過敏、保肝降酶等作用[2]?！吨袊幍洹酚涗浭且宰喜菟?、β，β-二甲基丙烯酰紫草素作為指標(biāo)性成分來對紫草藥材飲片進(jìn)行質(zhì)量控制[3]。紫草在我國的各地均有分布，主要產(chǎn)地包括山東、新疆、內(nèi)蒙古、甘肅等，查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)對泰山紫草成分含量研究的較少，多是HPLC法分析新疆紫草中萘醌類成分的報道[4-5]。而泰山紫草藥材作為泰山的名藥之一，同樣具有很高的研究價值。本實(shí)驗通過建立高效液相法，同時對泰安產(chǎn)地的紫草藥材中5種萘醌類成分的含量進(jìn)行測定，從而為紫草藥材資源的開發(fā)提供依據(jù)，同時為泰山紫草藥材藥用價值的研究提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 高效液相色譜儀，Symmetry C18 色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，電子天平(上海奧豪斯儀器有限公司)，KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，0.45 μm微孔濾膜。

1.2 試藥

5種對照品均購自上海源葉生物技術(shù)有限公司，純度均≥98%，左旋紫草素(批號Z-017-150525)、乙酰紫草素(批號R21J7F16576)、去氧紫草素(批號Z11D6H7417)、異丁酰紫草素(批號T21J7Z9356)、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧(批號 P03A6F2066)。泰山紫草(泰安市四大名藥開發(fā)有限公司)，乙腈、甲醇為色譜純(美國天地)，純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Symmetry C18 (4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相：乙腈-水(70∶30)；檢測波長：516 nm；柱溫：30℃；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1對照品的制備 分別稱取左旋紫草素、乙酰紫草素、去氧紫草素、異丁酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧各對照品適量，用甲醇溶解并制成質(zhì)量濃度分別為2.2、8.8、2.0、8.5、3.0 mg·mL-1的對照品貯備液。再精密移取各對照品1 mL于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋到刻度，搖勻，即得混合對照品溶液，各對照品質(zhì)量濃度依次為0.22、0.88、0.20、0.85、0.30 mg·mL-1。

2.2.2供試品的制備 稱取泰山紫草粉末約1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入流動相40 mL，稱定重量，超聲處理(250 W，33 kHz)40 min，放冷，稱重，用流動相補(bǔ)足減失的重量，搖勻，提取液過0.45 μm濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液，20 μL進(jìn)樣。

2.3 專屬性考察

取空白溶液、混合對照品溶液、供試品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可見，空白溶液色譜在對照品色譜相應(yīng)位置處無吸收峰，表明在該試驗條件下專屬性較好。

圖1 專屬性考察

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.2.1”項下混合對照品貯備液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于10 mL量瓶中，溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣，記錄各成分峰面積。以對照品質(zhì)量濃度(x，μg/mL)對峰面積積分值(y)進(jìn)行線性回歸，得到各化合物的回歸方程和線性范圍，結(jié)果見表1。

2.5 精密度試驗

吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液，按照上述色譜條件進(jìn)樣，記錄各峰面積，重復(fù)6次，計算左旋紫草素、乙酰紫草素、去氧紫草素、異丁酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧的峰面積RSD(n=6)分別為 1.28%、2.06%、1.80%、1.93%、2.39%，結(jié)果表明儀器精密度符合要求。

2.6 重復(fù)性試驗

稱取同一批次的泰山紫草粉末(約1 g)6份，照“2.2.2”項下方法制備成供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，分別計算樣品溶液中左旋紫草素、乙酰紫草素、去氧紫草素、異丁酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧峰面積的RSD(n=6)分別為1.52%、0.98%、1.31%、2.65%、1.62%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

照“2.2.2”項下方法制備泰山紫草供試品溶液，分別于 0、2、4、6、8、10、12 h 進(jìn)行測定，結(jié)果計算得左旋紫草素、乙酰紫草素、去氧紫草素、異丁酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧峰面積RSD(n=6)分別為1.22%、0.82%、0.59%、1.29%、2.08%，均小于3.0%。表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量的泰山紫草粉末約 0.5 g，6份，精密稱定。分別精密加入左旋紫草素對照品(220 μg·mL-1)0.3 mL、乙酰紫草素對照品(880 μg·mL-1)0.6 mL、去氧紫草素對照品(200 μg·mL-1)0.3 mL、異丁酰紫草素對照品(850 μg·mL-1)0.5 mL，β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧對照品(300 μg·mL-1)0.2 mL，按“2.2.2”項下方法制備加樣回收供試溶液，進(jìn)樣測定，測定含量，結(jié)果見表2。

表1 5種萘醌類成分的線性回歸方程

表2 加樣回收試驗結(jié)果

2.9 樣品含量測定

取泰山紫草粉末3份，按“2.2.2”項下供試品溶液制備方法制成供試液溶液，照“2.1”項下色譜條件測定，記錄各成分峰面積，計算泰山紫草中左旋紫草素、乙酰紫草素、去氧紫草素、異丁酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧的平均含量分別為0.12、1.03、0.10、0.92、0.15 mg·g-1。

3 討 論

3.1 提取工藝選擇

查閱大量的資料可知一些紫草的提取方法，有超聲法、浸漬法、滲漉法、加熱回流法等。而紫草中的萘醌類化合物對溫度、酸堿度、氧等一些因素比較敏感[3]，這為紫草的提取工藝提出了較為嚴(yán)格的條件。查閱文獻(xiàn)可知超聲提取方法無需加熱、加壓，在常溫下即可以進(jìn)行實(shí)驗。綜合考慮多方面因素，最終選擇的是超聲法提取。

3.2 色譜條件的確定

流動相為乙腈∶水=60∶40時，萘醌類成分不出峰；乙腈∶水=80∶20時，萘醌類成分均出峰，但有些萘醌類成分不能完全分開；乙腈∶水=70∶30時，萘醌類成分均出峰，且分離效果較好，基線穩(wěn)定，因此，流動相選擇乙腈∶水=70∶30。選擇測定波長時，萘醌類成分在516 nm下分離良好且無干擾，故測定波長確定為516 nm。