不同亞群CD8+T細胞表型、功能分子及分化相關(guān)基因的表達

田永貴，張 震，尹 婕，申春一，張 毅

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物細胞治療中心 鄭州 450052 2)河南省腫瘤免疫與生物治療重點實驗室 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 鄭州 450001 4)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤中心 鄭州 450052

惡性腫瘤嚴重威脅人類生命健康，雖然傳統(tǒng)治療方法取得了一定的療效，但仍存在局限性，患者預(yù)后仍較差。以過繼性細胞免疫治療為代表的免疫療法為腫瘤患者帶來了新的希望。過繼性細胞免疫治療是將患者體內(nèi)的免疫活性細胞經(jīng)體外擴增和功能鑒定后，回輸給患者，其重要特征是免疫記憶性，但是輸注的T細胞大部分處于終末分化狀態(tài)，在腫瘤微環(huán)境中易凋亡且抗腫瘤效應(yīng)差，影響療效[1]。CD8+T細胞是機體抗腫瘤的主要效應(yīng)細胞，活化的CD8+T細胞可釋放顆粒酶、穿孔素、TNF-α、IFN-γ等細胞因子。CD8+T細胞分為初始T細胞(Tn)、中心記憶性T細胞(Tcm)、效應(yīng)記憶性T細胞(Tem)和效應(yīng)性T細胞(Teff)[2-3]。記憶性T細胞(Tcm和Tem)是具有自我更新能力的多能細胞，可維持機體免疫記憶功能，并參與再次免疫應(yīng)答[4-5]。其中Tcm是長壽的記憶性T細胞，有很強的增殖潛力和細胞因子生成能力，抗腫瘤能力優(yōu)于Tem 細胞[6-7]。T細胞在體外培養(yǎng)過程中，隨著激活性標(biāo)志物(如CD69、CD28)的表達上調(diào)，耗竭性標(biāo)志物PD-1的表達也會上調(diào)，并影響T細胞的分化和功能[8]。如何在體外獲得大量記憶性T細胞是目前研究的熱點。該研究通過檢測不同亞群CD8+T細胞分化相關(guān)基因的表達，確定記憶性T細胞分化相關(guān)基因的表達譜，為體外誘導(dǎo)記憶性T細胞的形成提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要材料及試劑無菌條件下采集健康受試者外周血，4 ℃保存(不超過6 h)，外周血的采集獲得本人知情同意。人外周血淋巴細胞分離液購自天津市灝洋生物制品科技有限公司，細胞免疫磁珠分選材料(CD8 免疫磁珠、MACS 緩沖液和LS柱)均購自德國Miltenyi Biotec公司，RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國HyClone公司，Trizol和SYBR Green染料購自TaKaRa公司，CD3、CD8、CD45RA、CCR7、CD69、CD28、PD-1、IFN-γ和IL-2流式抗體購自BD公司。

1.2外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)的分離將10 mL健康受試者外周血轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，加入PBS至35 mL。另取一個50 mL離心管，加入15 mL淋巴細胞分離液，將稀釋的血液緩慢倒入該離心管中，2 500 r/min離心25 min。無菌吸管吸取淋巴細胞白膜層至另一個無菌離心管中，加入適量PBS，1 500 r/min離心10 min，棄上清便可得PBMCs。

1.3CD8+T細胞的分選及培養(yǎng)在PBMCs中加入適量4 ℃MACS 緩沖液，1 500 r/min離心10 min，棄上清；加入適量4 ℃緩沖液重懸細胞，并加入適量CD8免疫磁珠混勻，4 ℃避光孵育15～20 min，期間混勻2次；加入3 mL 4 ℃緩沖液，1 500 r/min離心10 min，棄上清，加入 500 μL 4 ℃緩沖液重懸細胞；將LS柱固定在磁場中，加入緩沖液潤洗1次，然后緩慢加入細胞懸液，待柱內(nèi)無液體后，再使用適量緩沖液潤洗柱子3次。加入5 mL緩沖液后，將柱子移出磁場，然后迅速使用活塞將細胞壓出至新離心管中，得到的細胞為CD8+T細胞。分離的CD8+T細胞用含體積分數(shù)10%胎牛血清和青/鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)。

1.4CD8+T細胞亞群的分選在CD8+T細胞中加入CD3-PE-Cy7、CD8-APC-Cy7、CD45RA-PerCP、CCR7-FITC流式抗體，4 ℃避光孵育15 min，利用流式分選儀(BD FACSAria Ⅱ)分選CD8+T細胞亞群Tn(CD45RA+CCR7+)、Tcm(CD45RA-CCR7+)、Tem(CD45RA-CCR7-)和Teff(CD45RA+CCR7-)。記錄各亞群的比例。

1.5CD8+T細胞亞群表型及功能分子的檢測取1×106個CD8+T細胞，加入適量表面抗體(CD3-PE-Cy7、CD8-APC-Cy7、CD45RA-PerCP、CCR7-APC、CD69-FITC、 CD28-PE、PD-1-FITC)，4 ℃避光孵育15 min；加入1 mL PBS，1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入 200 μL PBS，上流式細胞儀(BD FACS-Canto Ⅱ)檢測CD8+T細胞的亞群和表型。

將CD8+T細胞鋪于24孔板中，分別加入PMA(50 mg/L)、離子霉素(750 mg/L)、阻斷劑(BFA)，刺激6 h后收集細胞于1.5 mL離心管中，用PBS清洗2遍，加入適量表面抗體CD3-PE-Cy7、CD8-APC-Cy7、CD45RA-PerCP、CCR7-FITC，4 ℃避光孵育15 min；加入400 μL固定劑，4 ℃避光孵育30 min；加入400 μL破膜劑，4 ℃避光孵育1 h；加入適量功能分子抗體IFN-γ-FITC、IL-2-PE，4 ℃避光孵育15 min；加入1 mL PBS，1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入 200 μL PBS，上流式細胞儀(BD FACS-CantoⅡ)檢測CD8+T細胞功能分子的表達。

1.6CD8+T細胞分化相關(guān)基因的富集分析采用基因注釋分析工具Metascape進行分析。打開Metascape的主頁(http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)，提交分化相關(guān)基因列表，選擇物種H.sapiens，點擊Express Analysis進行分析，生成富集通路柱狀圖。

1.7CD8+T細胞亞群中轉(zhuǎn)錄因子、凋亡、干性等相關(guān)基因表達的qRT-PCR檢測將分選的CD8+T細胞亞群離心，獲取沉淀，每管加入1 mL Trizol重懸，提取RNA，并用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA；以2 μL cDNA為模板，加入10 μL SYBR Green染料、8 μL 1 μmol/L的上下游引物(引物及序列見表1)混合物。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，40個循環(huán)；72 ℃ 10 min延伸。結(jié)果以2-ΔΔCt表示。采用GraphPad Prism 7對qRT-PCR結(jié)果進行分析并生成熱圖。

續(xù)表1

1.8統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進行分析。采用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較CD8+T細胞不同亞群間表型、功能分子及其分化相關(guān)基因表達的差異。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1CD8+T細胞亞群的比例4個亞群的比例分別為Tn(43.07±16.09)%，Tcm(9.08±3.67)%，Tem(23.59±11.20)%，Teff(24.27±16.08)%。

2.2CD8+T細胞亞群的表型分析結(jié)果見表2。Tcm中CD69和CD28表達高于Tem和Teff(P<0.001)，而PD-1表達則低于Tem和Teff(P<0.05)。

表2 CD8+T細胞亞群表型分子的表達 %

*：與Tcm組相比，P<0.05

2.3CD8+T細胞亞群的功能分析結(jié)果見表3。與Tem和Teff相比，Tcm中IFN-γ、IL-2的表達水平明顯增高(P<0.05)。

表3 CD8+T細胞亞群的功能分子的表達 %

*：與Tcm組相比，P<0.05

2.4CD8+T細胞分化相關(guān)基因的富集分析見圖1。CD8+T細胞分化相關(guān)基因主要富集在分化、凋亡、自我更新、STAT3通路等。

圖1CD8+T細胞相關(guān)基因的富集通路柱狀圖

2.5CD8+T細胞亞群中相關(guān)基因mRNA的表達結(jié)果見圖2。與Tem和Teff相比，Tcm中趨化因子受體(CCR7、CXCR4)、STAT3通路相關(guān)基因(IL-21、STAT3)、自我更新的干性基因(C-myc、Lin28)、抗凋亡基因(Bcl-2)的表達水平增高(P<0.05)，見表4、5。

圖2 CD8+T細胞亞群中分化相關(guān)基因的表達熱圖

*：與Tcm組相比，P<0.05

表5 CD8+T細胞各亞群中自我更新及抗凋亡相關(guān)基因的表達

*：與Tcm組相比，P<0.05

3 討論

記憶性T細胞在維持機體免疫記憶及抗腫瘤效應(yīng)中發(fā)揮重要作用。CD8+T細胞各亞群具有不同的基因表達譜和抗腫瘤能力。Tcm高表達與記憶相關(guān)的基因，具有自我更新能力以及向腫瘤部位趨化的能力。Tem高表達效應(yīng)相關(guān)的基因，但是增殖能力和自我更新能力較Tcm差。Tcm抗腫瘤能力優(yōu)于Tem，將Tcm應(yīng)用到腫瘤免疫治療中，可提高患者的治療效果。記憶性T細胞的分化受到多種因素的調(diào)控，如轉(zhuǎn)錄因子、代謝檢查點、免疫檢查點和信號通路分子等[9]。鑒定不同T細胞亞群的差異基因表達，尋找與記憶性T細胞分化相關(guān)的基因，可為體外誘導(dǎo)培養(yǎng)記憶性T細胞提供新策略。

CD8+T細胞表達的共刺激分子(如CD69和CD28)與其對應(yīng)的配體結(jié)合，引起CD8+T細胞的活化[10]；CD69活化刺激IL-2和IFN-γ的分泌，進一步促進CD8+T細胞的細胞毒性功能[11]。共抑制信號由共抑制分子與其配體(如PD-1與其配體PD-L1/PD-L2)之間的相互作用觸發(fā)；這種相互作用導(dǎo)致CD8+T細胞產(chǎn)生的效應(yīng)細胞因子下調(diào)[12]。本研究結(jié)果顯示，Tn和Tcm中共刺激分子CD69、CD28表達高于Tem、Teff，而PD-1表達則低于Tem和Teff。說明Tcm有優(yōu)于Tem、Teff的活化及增殖潛力，當(dāng)再次暴露于抗原時，Tcm能迅速活化、擴增，并產(chǎn)生大量細胞因子(IFN-γ、IL-2)，從而促進腫瘤細胞死亡。

本研究檢測了CD8+T細胞各亞群的差異基因，并采用基因富集分析發(fā)現(xiàn)這些基因主要富集在分化、凋亡、自我更新、STAT3通路等。趨化因子可以由樹突狀細胞產(chǎn)生，對CD8+T細胞的遷移和功能具有共刺激或共抑制的影響[13]。本研究結(jié)果顯示趨化因子受體CCR7、CXCR4在Tcm中表達上調(diào)。CCR7是重要的淋巴結(jié)歸巢標(biāo)記，Tcm細胞表達這種淋巴結(jié)歸巢受體分子，有利于它們在淋巴組織中的轉(zhuǎn)移和保留[5-6]。CD8+T細胞通過TCR和CXCR4的刺激，增加激活性標(biāo)志物CD69、CD25和CD154的表達，從而促進T細胞生長及IL-2、IFN-γ、IL-4的產(chǎn)生。本研究結(jié)果還顯示STAT3通路相關(guān)基因在Tcm中表達水平增高。STAT3通路的IL-21信號可以使CD8+T細胞免于過度的炎癥刺激，阻礙效應(yīng)性CD8+T細胞的分化和衰竭，促進記憶性T細胞的形成[14]。干性相關(guān)基因(如C-myc、Lin28)在記憶性T細胞中表達上調(diào)，可以促進記憶性T細胞的維持和自我更新。Bcl-2在T細胞中的表達不僅能夠抑制T細胞的凋亡，同時也參與調(diào)控T細胞與記憶性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(如 FoxO1 和 Eomes)以及糖代謝相關(guān)基因(如HK2和Glut)的表達。

腫瘤浸潤的CD8+T細胞發(fā)揮了重要的抗腫瘤作用，然而，由于腫瘤微環(huán)境的免疫抑制作用，CD8+T細胞的功能受到抑制，使得多種有效的腫瘤免疫療法療效受到影響[15]。因此，通過調(diào)節(jié)與T細胞分化相關(guān)的基因及其通路，可以促進記憶性CD8+T細胞的形成。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，分化、抗凋亡、自我更新及STAT3通路等相關(guān)基因在Tcm細胞中表達水平較高。本研究探明了記憶性T細胞基因表達的特點，為體外誘導(dǎo)記憶性T細胞的形成提供了新思路。