降低miR-21表達對順鉑耐藥A549細胞藥物敏感性的影響

張 茂，孫浩言，張 磊

宜賓市第一人民醫(yī)院藥劑科 四川宜賓 644000

肺癌是臨床中危害最為嚴重的惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和病死率[1-2]。有研究[3]顯示，非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占所有肺癌的85%以上[4]。早期NSCLC多不表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，確診時大多已經(jīng)到癌癥晚期，這也極大地增加了臨床治療難度。目前對NSCLC的治療常采用以鉑類為基礎的化療，但在實際治療過程中常因多種因素造成患者對順鉑(cisplatin，DDP)耐藥，進而導致化療失敗[5]。因此，提高患者對DDP的敏感性是目前臨床治療中急需解決的關鍵問題。微小RNAs(microRNAs,miRNAs)是一類保守的內(nèi)源性非編碼單鏈RNAs，含20～24個核苷酸[6]。有研究[7-8]報道m(xù)iRNAs參與癌癥耐藥性產(chǎn)生過程，如miR-223及miR-192在DDP耐藥的A549細胞(A549/DDP)中明顯高表達，降低miR-223或miR-192的表達可明顯改善A549/DDP細胞對DDP的敏感性。miR-21具有致癌作用，可通過抑制靶基因的表達促進細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，并抑制細胞凋亡[9-10]；有研究[11-12]表明，miR-21異常表達與惡性腫瘤化療藥物耐藥性的產(chǎn)生密切相關。本研究分析了miR-21在DDP敏感和耐藥NSCLC組織中的表達，并觀察降低miR-21的表達對A549/DDP細胞活性和凋亡的影響，探討miR-21在DDP耐藥性產(chǎn)生中的作用，為NSCLC的臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1組織標本來源收集宜賓市第一人民醫(yī)院2016年3月至2017年10月經(jīng)皮肺穿刺法采集的40例NSCLC患者的活檢組織標本，所有患者均未接受過手術治療且均無吸煙史。將新鮮的活檢組織標本置于液氮中保存?zhèn)溆谩?0例患者中DDP敏感和耐藥各20例；敏感患者DDP聯(lián)合化療效果明顯，預后良好；而耐藥患者在化療后6個月內(nèi)癥狀未緩解或出現(xiàn)病情的反復。試驗獲該醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2主要試劑miR-21抑制劑(anti-miR-21)及其陰性對照(anti-miR-NC)購自上海吉瑪制藥技術有限公司。A549及A549/DDP購自美國模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC細胞庫)；新鮮胎牛血清、RPMI 1640、DMEM培養(yǎng)液購自上海玉博生物科技有限公司；MTT購自美國Sigma公司；脂質(zhì)體2000購自美國Invitrogen 公司；Annexin V-FITC/PI雙染凋亡檢測試劑盒購自美國BD Biosciences公司；Caspase-3活性檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；Trizol總RNA提取試劑盒、qRT-PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自廣州復能基因有限公司。

1.3細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染用含體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)A549、A549/DDP細胞。細胞生長到對數(shù)期時，挑取生長狀態(tài)良好的細胞，以1×105個/孔的密度接種于6孔板中。繼續(xù)培養(yǎng)至細胞融合度達70%～80%時，按照脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑說明書操作，分別將anti-miR-21及anti-miR-NC轉(zhuǎn)染入A549/DDP細胞中，48 h后檢測miR-21的表達。

1.4miR-21的qRT-PCR檢測取組織標本，A549、A549/DDP、轉(zhuǎn)染anti-miR-21或anti-miR-NC的A549/DDP細胞，用Trizol試劑盒提取總RNA，按照試劑盒說明書操作反轉(zhuǎn)錄成互補的cDNA，行PCR擴增。PCR反應體系：SYBR Ex Taq (2×) 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O補足至25 μL。反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火35 s，重復40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法進行定量分析。以U6作為內(nèi)參。miR-21上游引物序列：5’-ACACTCCAGGTGGGTAGCTTAT CAG-3’，下游引物序列：5’-CAACTGGTGTCGTG GAGTTCG-3’；U6上游引物序列：5’-TGCGGGT GCTCGCTTCGGCAGC-3’，下游引物序列：5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’。細胞實驗重復3次。

1.5DDP對轉(zhuǎn)染的A549/DDP細胞半數(shù)抑制濃度(IC50)的測定將兩組A549/DDP細胞以5×103個/孔的密度接種于96孔板，孵育24 h后，每孔加入100 μL不同濃度(0、30、60、90、120 mg/L)的DDP培養(yǎng)48 h。然后加入5 g/L 的MTT 20 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h，測定490 nm處的吸光度(A)。生長抑制率=(1-加藥組A/對照組A)×100%。以最小二乘法擬合標準曲線，求得IC50。實驗重復3次。

1.6兩組轉(zhuǎn)染的A549/DDP細胞增殖活性的檢測將兩組A549/DDP細胞以5×103個/孔的密度接種于96孔板中，分別于培養(yǎng)0、24、48、72 h后，加入5 g/L的MTT 20 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h，利用酶標儀測定490 nm處的A值。實驗重復3次。

1.7兩組轉(zhuǎn)染的A549/DDP細胞凋亡的檢測將兩組A549/DDP細胞以3×105個/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)48 h后，行Annexin V-FITC/PI雙染，避光放置10 min，上流式細胞儀測定凋亡率。實驗重復3次。

1.8兩組轉(zhuǎn)染的A549/DDP細胞中Caspase-3活性的檢測將兩組A549/DDP細胞接種于6孔板中培養(yǎng)48 h，按Caspase-3活性檢測試劑盒說明書操作，測定405 nm處的A值。實驗重復3次。

1.9統(tǒng)計學處理采用SPSS 20.0進行分析，應用兩獨立樣本的t檢驗比較DDP敏感和耐藥患者癌組織中，A549和A549/DDP細胞中miR-21表達的差異，以及兩組轉(zhuǎn)染的A549/DDP細胞IC50(DDP)增殖活性、凋亡率和Caspase-3活性的差異。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1DDP敏感和耐藥患者癌組織中miR-21表達的比較miR-21在DDP耐藥患者癌組織中的相對表達量(4.56±0.49)高于DDP敏感患者(1.03±0.39)(t=25.208，P<0.001)。

2.2A549和A549/DDP細胞中miR-21表達的比較miR-21在A549/DDP中的表達水平(3.45±0.36)高于A549細胞(1.02±0.27)(t=24.150，P<0.01)。

2.3兩組轉(zhuǎn)染的A549/DDP細胞IC50、增殖活性、凋亡率和Caspase-3活性的比較見表1。由表1可知，與anti-miR-NC轉(zhuǎn)染的A549/DDP細胞比較，DDP對anti-miR-21轉(zhuǎn)染的A549/DDP的IC50降低，細胞增殖活性降低，凋亡率和Caspase-3活性升高。

表1 兩組轉(zhuǎn)染的A549/DDP細胞IC50、增殖活性、凋亡率和Caspase-3活性的比較(n=3)

3 討論

miRNAs是一類保守的單鏈非編碼RNAs，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，可通過誘導靶基因的降解調(diào)控靶基因參與的信號通路，進而影響癌細胞的增殖、侵襲和凋亡等過程[13]。不同腫瘤組織中miRNAs的表達有顯著差異，這些具有腫瘤特異性的miRNA可作為腫瘤早期診斷及個性化治療的新型生物學分子標志物[14]。有研究[15-16]證實miRNA的異常表達與肺癌的發(fā)生及化療藥物耐藥密切相關，而化療藥物耐藥是臨床治療失敗的主要原因。因此，研究miRNAs對肺癌耐藥性的影響及可能機制，能夠為改善腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，提高治療效果提供依據(jù)。

miR-21是一種具有癌基因作用的功能性miRNA。miR-21可通過靶向抑制腫瘤抑制蛋白PDCD4促進乳腺癌的發(fā)生發(fā)展[17]；miR-21可通過靶向抑制人第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源基因(PTEN)、人類錯配修復基因2(hMSH2)，促進NSCLC細胞的增殖、遷移、侵襲，并抑制其凋亡[18-19]。除此之外，miR-21還可通過調(diào)控抗腫瘤藥物的耐藥性影響療效。在耐受性乳腺癌異種移植體中注射miR-21反義寡核苷酸抑制miR-21的表達可改善乳腺癌對曲妥珠單抗的敏感性[20]。降低miR-21表達可抑制低氧誘導因子1(HIF-1)的表達，提高卵巢癌細胞對紫杉醇的敏感性[20]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-21在DDP耐藥的NSCLC組織和A549/DDP細胞中的表達明顯高于敏感組織和A549細胞；抑制A549/DDP細胞miR-21的表達可降低DDP對細胞的IC50，抑制細胞增殖并促進細胞凋亡，提高耐藥細胞對DDP的敏感性。

綜上所述，miR-21有可能成為改善NSCLC患者DDP治療的療效及預后的新型的作用靶點。