石豆蘭無菌材料的建立及離體培養(yǎng)初探

黃崇成， 苗永美， 方 達(dá)， 王宇豪， 童 元

(安徽科技學(xué)院 生命與健康科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽 233100)

石豆蘭屬(Bublophyllum) 植物全世界約有1 000種，主要分布于亞洲、非洲和美洲熱帶地區(qū)。我國有98種3變種，主要產(chǎn)于長江流域及其以南各省區(qū)，尤以云南南部為多。該屬植物具根狀莖和假鱗莖，假鱗莖密生或疏生于根狀莖上，卵圓至圓筒狀，葉生于假鱗莖頂端。有些種的株型優(yōu)美，花色幽雅、果實(shí)玲瓏可愛，具有一定的觀賞價(jià)值；有些具藥用價(jià)值，常作民間用藥的有15種，全草或假鱗莖皆可入藥[1]，具清熱、滋陰、消腫、抗癌、抗焦慮等功效[2,3]。蘭科植物價(jià)值高，野生資源受到保護(hù)，怎樣通過組織培養(yǎng)加快繁殖力度為人工栽培提供大量組培苗，或者通過細(xì)胞培養(yǎng)提取藥用成分都是很重要的研究課題[3]。

植物生活在自然界中其表面會帶有各樣微生物，甚至其組織內(nèi)也生有大量菌，尤其蘭科植物特殊生境、生長緩慢、具藥用功能等特點(diǎn)都會使得植物內(nèi)外菌物較為豐富，這給無菌材料建立帶來巨大困難。在開展石豆蘭離體繁殖體系建立時(shí)發(fā)現(xiàn)石豆蘭橫走莖、假鱗莖表面菌較多，內(nèi)生菌也極為豐富[4]。因此，本試驗(yàn)開展內(nèi)外菌物消毒處理方法研究及探索激素濃度，建立起離體繁殖體系并獲取大量無菌材料，為下一步原球莖誘導(dǎo)、增殖、懸浮培養(yǎng)、誘變等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

所用石豆蘭(Bulbophyllumsp.)材料采自福建南屏鴛鴦獼猴自然保護(hù)區(qū)。制霉菌素和萘啶酮酸用乙醚滅菌處理，紗布封口，揮干后，加入無菌水配成50 mg/mL的懸液。

1.2 方法

1.2.1 外植體外生菌的處理 取橫走莖最前端新生出的小嫩芽和假鱗莖兩種外植體，清水沖洗表面，加入0.1% HgCl2后分成兩組，一組做超聲(40 kHz，下同)處理，另一組不做超聲處理，處理5、10、15、20 min，共8個(gè)處理，無菌水漂洗5次，吸干。芽切除少許基部，假鱗莖約切成0.5 cm3的小塊，接種到M1：MS+6-BA 0.25 mg/L+NAA 0.05 mg/L的培養(yǎng)基上，每處理接種10瓶，每瓶3個(gè)芽和3個(gè)切塊。7 d統(tǒng)計(jì)污染和成活情況，污染率=污染外植體數(shù)/總外植體數(shù)×100%，成活率=成活外植體數(shù)/總外植體數(shù)×100%。

1.2.2 外植體內(nèi)生菌的處理 1.2.1試驗(yàn)結(jié)果表明假鱗莖在M1培養(yǎng)基上死亡率高，難以再分化出器官。因此，后面試驗(yàn)只選用小嫩芽做培養(yǎng)材料，表面消毒處理后接種于添加制菌霉素和萘啶酮酸的M1培養(yǎng)基中，添加濃度見表2。每處理10瓶，每瓶6個(gè)材料，每個(gè)月轉(zhuǎn)接1次，培養(yǎng)90 d后計(jì)算污染率和成活率。

1.2.3 不同激素配比對外植體的生長的影響 取未污染的小嫩芽接種于M1培養(yǎng)基上，此時(shí)逐漸降低培養(yǎng)基中抗菌素濃度，經(jīng)過長時(shí)間多次繼代后，基部逐漸長出粗壯的根，嫩芽生長，基部變粗形成橢圓形即假鱗莖，上面著生二葉，根莖處分化出小芽。為了探討激素配比對芽分化的影響，根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)，選用6-BA和NAA兩種激素，采用正交設(shè)計(jì)，具體表3。將單鱗芽帶根切下選取大小差不多一致的帶根鱗芽作為接種單元，每處理5瓶，每瓶4個(gè)鱗莖，60 d后統(tǒng)計(jì)新長出的芽，按培養(yǎng)后芽數(shù)/接種時(shí)芽數(shù)計(jì)算增殖倍數(shù)。

以上培養(yǎng)基中需添加0.5 g/L 活性炭、100 g/L土豆汁、3 0 g/L蔗糖、6 g/L瓊脂粉，pH=6.5。光照時(shí)間為12 h/d，光照強(qiáng)度為40 μmol /(m2·s)，溫度25±2 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方式的消毒效果比較

表1 不同處理方式對外植體的殺菌效果

由表1可知，假鱗莖的污染率高，說明假鱗莖內(nèi)外菌較多，而成活率比芽低，大部分逐漸發(fā)黃發(fā)白死亡，未死亡的只是維持綠色未見分化說明假鱗莖分化要求較高。單獨(dú)使用HgCl2消毒時(shí)，2種外植體的污染率都隨處理時(shí)間的延長逐漸降低，而成活率先升高后降低，有一些材料雖未出現(xiàn)污染，但長時(shí)間的HgCl2處理會對2種外植體造成傷害從而導(dǎo)致成活率下降；當(dāng)然也有些材料出現(xiàn)輕微的污染但仍然存活。根據(jù)污染率和成活率綜合來看，在單獨(dú)使用HgCl2時(shí)，處理時(shí)間10 min效果最好。

HgCl2結(jié)合超聲處理比單獨(dú)使用HgCl2會降低污染率，芽污染率降低幅度在10%～20%之間，假鱗莖污染率降低幅度在13.33%～26.67%之間；只有超聲5～10 min處理能提高2種外植體的成活率，長時(shí)間超聲會降低成活率，可能因長時(shí)間超聲處理會對植物造成傷害。由此看出，HgCl2結(jié)合超聲處理能降低污染率，提高成活率，處理10 min時(shí)效果最好，芽和假鱗莖的污染率都降低了20%，成活率分別提高了10%和3.33%。

2.2 不同抗生素組合對石豆蘭內(nèi)生菌的抑制效果比較

表2 不同抗生素組合對內(nèi)生菌的抑制效果比較

藥用植物往往含內(nèi)生菌，采取HgCl2結(jié)合超聲處理對表面菌起到較好的殺傷作用，而對內(nèi)部菌殺傷力較弱，本研究發(fā)現(xiàn)隨著長時(shí)間繼代培養(yǎng)，材料切口處逐步長出多種菌物，生長緩慢，符合內(nèi)生菌的生長特征，建立無菌材料時(shí)針對內(nèi)生菌采取的做法是加入抗生素。由表2可知，僅采取HgCl2結(jié)合超聲處理在短時(shí)間內(nèi)呈現(xiàn)較低的污染率，90 d后內(nèi)生菌逐漸長出，污染率達(dá)83.33%；當(dāng)培養(yǎng)基中加入制菌霉素和萘啶酮酸后，污染率降低。根據(jù)污染率和成活率兩個(gè)指標(biāo)綜合考慮，確定最佳抗菌素組合為7號處理即制菌霉素75 mg/L和萘啶酮酸50 mg/L抑制效果最好，90 d時(shí)污染率為20.00%，無菌材料成活率為60%，芽出現(xiàn)了萌發(fā)和明顯的生長。

2.3 不同激素濃度和配比對鱗芽增殖的影響

表3 不同激素濃度和配比對鱗芽增殖的影響

表4 增殖培養(yǎng)中因素多重比較

注：同列數(shù)值間不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著。

圖1 石豆蘭增殖

從圖1看出，芽主要從鱗芽基部長出并逐步生長，有些從鱗芽頂部分化出，分化情況受激素調(diào)控。多重比較結(jié)果(表4)說明6-BA和NAA對于石豆蘭鱗芽的增殖影響顯著，增殖倍數(shù)隨著6-BA濃度升高先增大后降低，2水平即0.4 mg/L時(shí)最大，顯著高于其它兩個(gè)水平；隨NAA濃度的增加，增殖倍數(shù)逐漸增大，3水平即0.2 mg/L時(shí)最大并顯著高于1和2水平，但是1和2水平之間差異不顯著。根據(jù)多重比較得出石豆蘭離體繁殖的最佳的激素配比為6-BA 0.40 mg/L和NAA 0.2 mg/L，此激素配比即6號培養(yǎng)基上鱗芽經(jīng)過60 d的增殖培養(yǎng)，增殖了2.90倍。

3 結(jié)論與討論

本研究所用的石豆蘭屬植物其外植體消毒非常困難，因?yàn)樵谧匀粭l件下外植體外部和內(nèi)部都帶有較多的細(xì)菌，霉菌，尤其是蘭科植物，常年生活在空氣濕度大的環(huán)境中，加上生長周期較長的特點(diǎn)，外植體內(nèi)外菌物非常豐富，給離體培養(yǎng)建立無菌材料時(shí)帶來巨大困難。

建立無菌起始材料時(shí)主要考慮的因素有外植體類型和消毒方法。選取外植體時(shí)要考慮材料來源、細(xì)胞全能性和消毒難易程度等，通過前期預(yù)實(shí)驗(yàn)[4]，表明蘭科植物葉片再生能力非常弱，培養(yǎng)中逐漸黃化死亡；橫走莖已木質(zhì)化，細(xì)胞全能性較低，也不適合選用[5-7]。本研究選取嫩芽和假鱗莖為外植體，發(fā)現(xiàn)假鱗莖內(nèi)生菌多，尤其是生長周期更長的假鱗莖其內(nèi)生菌更為豐富，經(jīng)過切割后內(nèi)生菌容易長出；此外鱗莖切塊易黃化，僅少數(shù)維持綠色但沒有分化，只有接入新形成的小球莖在未污染的情況下出現(xiàn)了生長?；谏鲜鲈?，通過假鱗莖難以建立無菌材料，本研究采用橫走莖前端新長出的嫩芽為外植體建立無菌材料。

植物外植體常采用化學(xué)方法消毒，主要考慮消毒劑的種類、濃度、時(shí)間，三個(gè)因素具有很強(qiáng)的相關(guān)性，使用力度越大，殺菌越徹底；若把握不好力度，外植體也會受到藥劑傷害死亡。怎樣在保證殺死菌物的同時(shí)不能對外植體造成傷害，保證較高的成活率，是建立無菌材料時(shí)考慮的重要因素?；瘜W(xué)藥劑常采用的是HgCl2和NaClO。NaClO因具漂白作用，不適合綠體材料；HgCl2因效果好常被選用[8]。有研究報(bào)道超聲波輔助化學(xué)法能降低組培苗的污染率、提高成活率，大大降低HgCl2濃度和處理時(shí)間[9]。本研究表明HgCl2結(jié)合超聲比單獨(dú)使用HgCl2效果好，獲得較低的污染率和最高的成活率。內(nèi)生菌豐富的外植體僅采用一般的化學(xué)、物理表面消毒法難以殺死內(nèi)部微生物，一般采取消毒液中[10]或培養(yǎng)基中添加殺菌劑來抑制內(nèi)生菌[11]，用到的殺菌劑有多菌靈、鏈霉素、慶大霉素、頭孢噻肟、青霉素等[12]。基于每種抗生物的殺菌譜限制，常采用多種抗生物聯(lián)合使用，還需考慮使用濃度和時(shí)間。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)石豆蘭內(nèi)部含細(xì)菌和真菌，因此選用制菌霉素和萘啶酮酸兩種，經(jīng)過濃度篩選確定75 mg/L制菌霉素和50 mg/L萘啶酮酸組合最好，90 d時(shí)統(tǒng)計(jì)污染率僅為20%，成活率為60%。

激素是植物器官分化的重要調(diào)控因子。本研究選用了6-BA和NAA 2種激素，兩種激素配比下，石豆蘭鱗莖切塊難以分化出原球莖或芽。本研究以帶根的整個(gè)假鱗莖為培養(yǎng)單元，芽主要從鱗莖的根基部分化出，也有少量芽從葉片中間或鱗莖表面分化出來。芽的分化會顯著受激素調(diào)控影響，6-BA 0.40 mg/L 和NAA 0.2 mg/L配比下，芽的增殖效果最好，為2.90倍。研究中發(fā)現(xiàn)石豆蘭植物分化容易，但生長緩慢，增殖周期較長，與近緣屬植物石斛的增殖類似[13-14]。關(guān)于石豆蘭屬植物的組織培養(yǎng)報(bào)道非常少，不同種植物所需的激素不同，李洪林等[6]在進(jìn)行廣東石豆蘭組培時(shí)，增殖培養(yǎng)所用激素配比6-BA 2.5 mg/L和NAA 0.05 mg/L，增殖系數(shù)達(dá)4～5倍。

綜上所述，0.1%HgCl2結(jié)合超聲處理10 min較有效地殺死石豆蘭外植體表面微生物，培養(yǎng)基中添加75 mg/L制菌霉素和50 mg/L萘啶酮酸能有效抑制石豆蘭內(nèi)生菌，建立了以鱗芽為起始材料的無菌材料。鱗芽在6-BA 0.40 mg/L和NAA 0.2 mg/L激素配比條件下增殖效果最好。