補(bǔ)腎益元方對(duì)運(yùn)動(dòng)性低血睪酮大鼠HPG 軸的影響及有效成分測(cè)定

王一蓉， 周志宏， 湯長(zhǎng)發(fā)

（1. 湖南師范大學(xué)體育學(xué)院， 湖南 長(zhǎng)沙 410081； 2. 湖南體育職業(yè)學(xué)院， 湖南 長(zhǎng)沙 410019）

競(jìng)技體育的重要目的是要不斷提高運(yùn)動(dòng)成績(jī)， 如何使運(yùn)動(dòng)員在大負(fù)荷訓(xùn)練期間提高身體機(jī)能水平、 消除疲勞是競(jìng)技體育界最關(guān)心的問(wèn)題， 大量研究表明， 長(zhǎng)時(shí)間高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能引起血睪酮水平下降， 進(jìn)而導(dǎo)致體能下降、 運(yùn)動(dòng)能力降低或產(chǎn)生疲勞， 故如何防治運(yùn)動(dòng)性低血睪酮的發(fā)生一直是運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)界研究的重點(diǎn)領(lǐng)域[1-2］。 中醫(yī)理論認(rèn)為，腎藏精， 主骨生髓， 為先天之本， 是體力產(chǎn)生的原動(dòng)力和源泉， 若腎精不足， 則雄性激素分泌減少， 故補(bǔ)腎能促進(jìn)體內(nèi)雄性激素的分泌（睪酮是體內(nèi)主要的雄性激素）， 從而提高機(jī)體的運(yùn)動(dòng)能力[3］。

補(bǔ)腎益元方由十余種中藥提取物組成， 具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、 補(bǔ)氣活血、 祛風(fēng)通絡(luò)功效， 方中人參大補(bǔ)元?dú)猓瑸榫帲?淫羊藿、 女貞子、 枸杞補(bǔ)肝腎， 壯筋骨， 強(qiáng)腰膝，使“陰助陽(yáng)則生化無(wú)窮”， 為臣藥； 杜仲、 黃芪補(bǔ)腎健脾，大伸筋草、 仙鶴草舒筋活血， 共為佐助藥， 含有人參皂苷，淫羊藿苷， 枸杞多糖等成分。 前期課題組采用該方顆粒、超微化物分別對(duì)小鼠、 大鼠、 運(yùn)動(dòng)員抗疲勞指標(biāo)和免疫相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)， 取得了一定成果[4-5］； 本實(shí)驗(yàn)擬創(chuàng)新該方劑型， 選擇11 味中藥提取物復(fù)方， 通過(guò)大鼠遞增負(fù)荷跑臺(tái)訓(xùn)練方案建立運(yùn)動(dòng)性低血睪酮模型， 并以淫羊藿提取物為陽(yáng)性對(duì)照， 觀察補(bǔ)腎益元中藥提取物復(fù)方對(duì)HPG 軸的影響， 研究其防治大鼠運(yùn)動(dòng)性低血睪酮作用的有效性和分子機(jī)制， 并比較中藥提取物復(fù)方和單味中藥提取物的干預(yù)效果， 測(cè)定方中有效成分， 為臨床開(kāi)發(fā)新型運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)劑提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)雄性SD 大鼠40 只， 2 月齡， 體質(zhì)量（300±10） g， 由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，湖南省動(dòng)檢二站進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)， 動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（湘） 2013-0004， 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類B 級(jí)動(dòng)物飼料飼養(yǎng)， 許可證號(hào)SCXK （湘） 2014-0002， 清潔級(jí)， 在干凈、 通風(fēng)的環(huán)境下飼養(yǎng)， 自由進(jìn)食飲水。

1.2 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）； 匯松PW-812 全自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)、 匯松MB-530 多功能酶標(biāo)分析儀（山東博科科學(xué)儀器有限公司）； 164-5050電泳儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）； DYCZ-40A 轉(zhuǎn)膜儀（北京六一生物科技有限公司）， T-Gradient PCR 儀（德國(guó)Biometra公司）； PikoReal 96 熒光定量RCP 儀（美國(guó)Thermo 公司）。試劑盒均購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.3 藥物 將補(bǔ)腎益元方中11 味中藥提取物（褐色粉末）混勻， 裝入膠囊， 平均粒重0.543 1 g， 由西安天一生物技術(shù)股份有限公司制作并提供。

2 方法

2.1 分組及給藥 40 只大鼠隨機(jī)分為空白組、 模型組、淫羊藿提取物組（陽(yáng)性對(duì)照） 及補(bǔ)腎益元方低、 高劑量組， 每組8 只， 分籠飼養(yǎng)。 空白組大鼠常規(guī)喂養(yǎng)， 自由飲食， 每天灌胃4 mL 生理鹽水， 不運(yùn)動(dòng)； 模型組大鼠每天運(yùn)動(dòng)， 并于運(yùn)動(dòng)前1 h 灌胃4 mL 生理鹽水； 淫羊藿提取物組、 補(bǔ)腎益元方組每天運(yùn)動(dòng)， 并于運(yùn)動(dòng)前1 h 灌胃給藥，連續(xù)6 周。 淫羊藿提取物組給藥劑量為0.70 g／kg， 補(bǔ)腎益元方低、 高劑量組給藥劑量分別為0.35、 0.70 g／kg， 生理鹽水溶解藥物后配成4 mL 溶液， 其中低劑量組用量與成人持平[6］。

2.2 有效成分測(cè)定

2.2.1 色譜條件 Agilent TC-C18色譜柱（4.6 mm ×250 mm， 5 μm）； 流動(dòng)相水（A） -乙腈（B）， 梯度洗脫，程序見(jiàn)表1； 檢測(cè)波長(zhǎng)203、 270 nm； 柱溫30 ℃； 體積流量1 mL ／min； 進(jìn)樣量10 μL。

表1 梯度洗脫程序

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取人參皂苷Rg1、 Re、Rb1、 Rc、 Rb2、 Rd 及淫羊藿苷對(duì)照品適量， 加甲醇制成每l mL 分別含0.3、 0.3、 0.3、 0.3、 0.3、 0.3、 0.4 mg 上述成分的溶液， 搖勻， 即得。

2.2.3 供試品溶液制備 精密稱取補(bǔ)腎益元方、 淫羊藿提取物各約0.25 g， 置于錐形瓶中， 精密加入10 mL 甲醇，稱定質(zhì)量， 超聲1 h， 取出， 放冷， 甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻， 濾過(guò)， 取續(xù)濾液， 即得。

2.3 運(yùn)動(dòng)性低血睪酮大鼠模型建立 采用逐級(jí)遞增負(fù)荷跑臺(tái)方案， 以血睪酮較訓(xùn)練前下降15%為判斷依據(jù)[7］。 運(yùn)動(dòng)方案參照Bedford 在1979 年根據(jù)大鼠體質(zhì)量／攝氧量回歸方程所建立的逐漸遞增速度和時(shí)間的訓(xùn)練方式， 周期6 周，每周訓(xùn)練6 d， 坡度保持在0°， 見(jiàn)表2。

表2 大鼠遞增負(fù)荷跑臺(tái)訓(xùn)練方案[（m／min） ×min］

2.4 取材及指標(biāo)檢測(cè) 運(yùn)動(dòng)組大鼠在第6 周最后1 d 進(jìn)行力竭實(shí)驗(yàn)， 力竭運(yùn)動(dòng)后不再給藥， 24 h 后腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉， 打開(kāi)腹腔， 取大動(dòng)脈血管血液6 mL， 其中3 mL在37 ℃下凝固后， 4 ℃、 3 000 r／min 離心10 min， 取血清， -20 ℃冰箱中保存， 用于檢測(cè)血清皮質(zhì)醇、 睪酮水平。 然后， 大鼠斷頭處死， 迅速開(kāi)顱取腦組織， 稱定質(zhì)量后立即于1 mL 煮沸的生理鹽水中煮3 min， 再加入0.5 mL 1 mol／L冰醋酸， 置于勻漿器中勻漿， 0.5 mL 1 mol／L 氫氧化鈉中和， 4 ℃、 3 000 r／min 離心30 min， 取上清液， -20 ℃冰箱中保存， 用于檢測(cè)卵泡刺激素（FSH）、 黃體生成素（LH）、 促性腺激素釋放激素（GnRH） mRNA、 蛋白表達(dá)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 18.0 軟件進(jìn)行處理， 數(shù)據(jù)以） 表示， 組間比較采用單因素方差分析。 P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 皮質(zhì)醇、 睪酮水平 表3 顯示， 各組皮質(zhì)醇水平無(wú)明顯變化（P＞0.05）。 與空白組比較， 模型組睪酮水平及睪酮／皮質(zhì)醇顯著降低（P＜0.01）， 而補(bǔ)腎益元方高劑量組兩者顯著升高（P＜0.05）； 與模型組比較， 淫羊藿提取物組、補(bǔ)腎益元方組睪酮水平顯著升高（P＜0.01）。

3.2 FSH、 LH、 GnRH mRNA 表達(dá) 表4 顯示， 與模型組比較， 淫羊藿提取物組、 補(bǔ)腎益元方組FSH、 LH、 GnRH mRNA 表達(dá)顯著升高（P＜0.05， P＜0.01）； 與補(bǔ)腎益元方高劑量組比較， 淫羊藿提取物組、 補(bǔ)腎益元方低劑量組LH mRNA 表達(dá)顯著降低（P＜0.05）， 并且后一組GnRH mRNA表達(dá)也顯著降低（P＜0.05）。＆

表3 各組皮質(zhì)醇、 睪酮水平比較±s， n=8）

表3 各組皮質(zhì)醇、 睪酮水平比較±s， n=8）

注：與空白組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，??P＜0.01

空白組 187.050±48.310 1.758±0.343 108.929±36.000模型組 115.518±13.053## 1.745±0.284 67.830±14.288##淫羊藿提取物組 206.833±5.537?? 1.787±0.328 119.532±25.037??補(bǔ)腎益元方低劑量組 210.600±5.084?? 1.782±0.211 119.380±13.019??補(bǔ)腎益元方高劑量組 220.567±14.714#?? 1.786±0.167 124.257±14.789#??

表4 各組FSH、 LH、 GnRH mRNA 表達(dá)比較 s，n=8）

表4 各組FSH、 LH、 GnRH mRNA 表達(dá)比較 s，n=8）

注：與模型組比較，?P ＜0.05，??P ＜0.01；與補(bǔ)腎益元方高劑量組比較，＆P＜0.05

空白組 1 1 1模型組 0.522±0.145 0.824±0.161 0.347±0.085淫羊藿提取物組 1.021±0.201? 1.356±0.102??＆ 1.079±0.101??補(bǔ)腎益元方低劑量組 0.988±0.114? 1.299±0.105??＆ 0.781±0.061??補(bǔ)腎益元方高劑量組 1.223±0.086?? 1.753±0.084?? 0.991±0.052??

3.3 FSH、 LH、 GnRH 蛋白表達(dá) 表5、 圖1 顯示， 與空白組比較， 模型組FSH、 GnRH 蛋白表達(dá)顯著降低（P ＜0.01）， 淫羊藿提取物組、 補(bǔ)腎益元方高劑量組LH、 GnRH蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01）； 與模型組比較， 淫羊藿提取物組、 補(bǔ)腎益元方組三者表達(dá)顯著升高（P＜0.01）； 與補(bǔ)腎益元方高劑量組比較， 補(bǔ)腎益元方低劑量組GnRH 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。

表5 各組FSH、 LH、 GnRH 蛋白表達(dá)比較s， n=8）

表5 各組FSH、 LH、 GnRH 蛋白表達(dá)比較s， n=8）

注：與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，??P＜0.01；與補(bǔ)腎益元方高劑量組比較，＆P＜0.05

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圖1 各組FSH、 LH、 GnRH 蛋白表達(dá)

3.4 有效成分測(cè)定 圖2 顯示， 色譜峰1 ～2、 8 ～11 為人參皂苷特征峰， 外標(biāo)法測(cè)得每粒復(fù)方中藥中含人參總皂苷43.57 mg； 色譜峰3～7 為淫羊藿提取物特征峰， 其中7 號(hào)峰為淫羊藿苷， 峰面積也最大， 外標(biāo)法測(cè)得每粒復(fù)方中藥中含淫羊藿苷5.03 mg。

4 討論

圖2 各成分HPLC 色譜圖

研究表明， 睪酮能促進(jìn)纖維和骨骼生長(zhǎng)， 從而保持肌肉質(zhì)量、 強(qiáng)度及骨骼密度， 并在一定條件下增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)員運(yùn)動(dòng)能力和競(jìng)技能力[8-9］， 但長(zhǎng)期高負(fù)荷強(qiáng)度訓(xùn)練使機(jī)體受到的刺激增加， 導(dǎo)致下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA 軸） 過(guò)度應(yīng)激， 以致多個(gè)環(huán)節(jié)的功能被抑制， 從而引起運(yùn)動(dòng)性血睪酮降低[10-11］， 造成運(yùn)動(dòng)員身體機(jī)能水平下降， 運(yùn)動(dòng)后恢復(fù)能力下降， 甚至產(chǎn)生傷病。 HPG 軸調(diào)節(jié)是通過(guò)在下丘腦合成促性腺激素釋放激素（GnRH）， 經(jīng)過(guò)毛細(xì)血管進(jìn)入門(mén)脈血管中與受體結(jié)合， 加速卵泡刺激素（FSH）、 黃體生成素（LH） 激素釋放， 最終促進(jìn)睪酮合成和分泌， 由此可知，HPG 軸活躍程度是決定睪酮分泌的最重要部分。

疲勞訓(xùn)練后， 運(yùn)動(dòng)員出現(xiàn)的癥狀大多類似中醫(yī)的腎陽(yáng)、腎氣虛弱， 故補(bǔ)腎氣、 溫腎陽(yáng)中藥在抗運(yùn)動(dòng)性疲勞致血睪酮降低的治療中占據(jù)主導(dǎo)地位[12］， 其中淫羊藿能增加性腺或附屬性腺器官的臟器系數(shù)， 提高血睪酮水平， 對(duì)HPG 軸具有促進(jìn)作用[13］， 其主要有效成分為淫羊藿苷。 因此， 本實(shí)驗(yàn)選擇補(bǔ)腎益元方， 以方中臣藥淫羊藿提取物為陽(yáng)性對(duì)照， 經(jīng)過(guò)6 周遞增負(fù)荷跑臺(tái)大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后發(fā)現(xiàn)， 與空白組比較， 模型組大鼠HPG 軸FSH、 LH、 GnRH 激素mRNA、 蛋白表達(dá)較低， 血清T 水平也明顯下降（P＜0.01），并且LH mRNA、 蛋白表達(dá)略微下降， 但不明顯， 這與黃文聰[14］提到的長(zhǎng)期訓(xùn)練運(yùn)動(dòng)量變化對(duì)LH 水平并無(wú)大影響，但長(zhǎng)期耐力訓(xùn)練會(huì)引起其生物活性下降的觀點(diǎn)基本一致；給予中藥提取物復(fù)方后， 大鼠HPG 軸中FSH 激素mRNA、蛋白表達(dá)較模型組升高， 但淫羊藿提取物及補(bǔ)腎益元低、高劑量組之間無(wú)明顯變化； 給藥組LH mRNA、 蛋白表達(dá)也有所升高， 補(bǔ)腎益元方高劑量組更明顯； 補(bǔ)腎益元高劑量組、 淫羊藿提取物組GnRH mRNA 表達(dá)與空白組基本相當(dāng)，均明顯高于補(bǔ)腎益元方低劑量組， 而在蛋白表達(dá)方面補(bǔ)腎益元低劑量組與空白組比較接近， 而補(bǔ)腎益元高劑量、 淫羊藿提取物組顯著升高， 但2 組之間無(wú)明顯差異； 但淫羊藿提取物組血清睪酮水平低于補(bǔ)腎益元低、 高劑量組， 可能與激素的脈沖式釋放有關(guān)。 張福生等[15］報(bào)道， 中藥可通過(guò)提高GnRH 基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)水平來(lái)提高GnRH 單位水平，也能通過(guò)調(diào)節(jié)FSH 來(lái)刺激睪酮分泌， 并且有些中藥本身具有性激素作用， 也可直接作用于性腺， 從而促進(jìn)睪酮分泌；本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， 給藥組均能通過(guò)調(diào)控HPG 軸來(lái)顯著提高運(yùn)動(dòng)低血睪酮大鼠睪酮水平， 其中補(bǔ)腎益元方高劑量組更明顯。蔡德培等[16］指出， 補(bǔ)腎中藥可通過(guò)提高機(jī)體下丘腦-垂體促性腺功能， 從而提高機(jī)體機(jī)能狀態(tài)； 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， 補(bǔ)腎益元方對(duì)HPG 軸具有多環(huán)節(jié)、 多靶點(diǎn)促進(jìn)作用， 對(duì)長(zhǎng)期大負(fù)荷強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練引起的運(yùn)動(dòng)性低血睪酮具有良好的調(diào)節(jié)作用， 有利于提高機(jī)體適應(yīng)能力。

綜上所述， 補(bǔ)腎益元方能明顯改善運(yùn)動(dòng)性低血睪酮大鼠FSH、 LH、 GnRH mRNA、 蛋白表達(dá)， 從而調(diào)控HPG 軸，可為中藥抗運(yùn)動(dòng)性低血睪酮提供理論依據(jù)。 由于補(bǔ)腎益元方高劑量組療效優(yōu)于淫羊藿提取物組、 補(bǔ)腎益元方低劑量組， 故建議在長(zhǎng)期高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練前， 運(yùn)動(dòng)員可使用與補(bǔ)腎益元方高劑量組（0.70 g／kg） 等效的成人劑量， 即1 次4 粒， 每天3 次， 以提高機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力。