女金丸HPLC指紋圖譜建立及聚類分析和主成分分析Δ

林林，于鳳蕊，徐麗華，林永強(qiáng)

（山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，濟(jì)南250101）

女金丸是在明《景岳全書(shū)》第六十一卷女金丹方基礎(chǔ)上加減而成，由當(dāng)歸、白芍、黨參、牡丹皮、黃芩等23味中藥組成。其中，當(dāng)歸養(yǎng)血調(diào)經(jīng)，黨參補(bǔ)脾益氣，為君藥；白芍、熟地、阿膠養(yǎng)血和血，為臣藥；川芎入血而理氣，為佐藥；甘草益氣調(diào)藥，為使藥。另外，白術(shù)、茯苓健脾化濕；香附、陳皮疏肝理氣；肉桂、鹿角霜補(bǔ)火助陽(yáng)；益母草、丹皮、沒(méi)藥、延胡索活血涼血，化瘀止痛；藁本、白芷祛風(fēng)止痛；黃芩、白薇清虛熱；赤石脂收斂固澀，可止離經(jīng)之血；砂仁化濕行氣；全方配伍，具有調(diào)經(jīng)養(yǎng)血、理氣活血、止痛之功效。該方為臨床常用婦科用藥，收載于國(guó)家基本藥物目錄，其現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)收載于2015年版《中國(guó)藥典》（一部），但僅采用單一藥味的顯微及薄層色譜鑒別以及橙皮苷的含量測(cè)定來(lái)控制產(chǎn)品的質(zhì)量[1］，無(wú)法全面反映產(chǎn)品的質(zhì)量。鑒于此，筆者通過(guò)檢測(cè)10批女金丸樣品，建立其高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并結(jié)合聚類分析、主成分分析對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，旨在為女金丸的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

2695型HPLC儀，包括2996型二極管陣列檢測(cè)器、Empower 3色譜工作站（美國(guó)Waters公司）；AE240型十萬(wàn)分之一電子天平[梅特勒-托利多儀器（中國(guó)）有限公司］；Milli-QAcademic型超純水器（美國(guó)Millipore公司）；SX-120DT型超聲波清洗機(jī)（上海圣訓(xùn)儀器有限公司）；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；FW100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

女金丸10批，包括山東宏濟(jì)堂制藥集團(tuán)股份有限公司（委托加工參比樣品，批號(hào):2017ZZ1，編號(hào):S1）、包頭中藥有限責(zé)任公司（批號(hào):A15117，編號(hào):S2）、北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠（批號(hào):3013360，編號(hào):S3）、哈藥集團(tuán)世一堂制藥廠（批號(hào):1503105，編號(hào):S4）、昆明中藥廠有限公司（批號(hào):510161，編號(hào):S5）、內(nèi)蒙古天奇中蒙制藥股份有限公司（批號(hào):11140515，編號(hào):S6）、山西華康藥業(yè)股份有限公司（批號(hào):20150601，編號(hào):S7）、山西振東開(kāi)元制藥有限公司（批號(hào):20170401，編號(hào):S8）、同藥集團(tuán)大同制藥有限公司（批號(hào):20150816，編號(hào):S9）、藥都制藥集團(tuán)股份有限公司（批號(hào):150101，編號(hào):S10），規(guī)格均為9 g/丸，橙皮苷含量不得低于8.0 mg。芍藥苷對(duì)照品（批號(hào):110736-201741，純度:95.7%）、甘草苷對(duì)照品（批號(hào):111610-201106，純度:93.7%）、阿魏酸對(duì)照品（批號(hào):110773-201614，純度:99.0%）、橙皮苷對(duì)照品（批號(hào):110721-201115，純度:95.3%）、黃芩苷對(duì)照品（批號(hào):110715-201117，純度:91.7%）、漢黃芩苷對(duì)照品（批號(hào):112002-201702，純度:98.5%）、黃芩素對(duì)照品（批號(hào):111595-200905，純度:98.5%）、丹皮酚對(duì)照品（批號(hào):110708-201407，純度:99.9%）、桂皮醛對(duì)照品（批號(hào):110710-201720，純度:98.7%）、甘草酸銨對(duì)照品（批號(hào):110731-201418，純度:93.1%）、漢黃芩素對(duì)照品（批號(hào):111514-201304，純度:100%）均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；蕓香柚皮苷對(duì)照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào):MUST-17030408，純度:99.2%）；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色 譜 柱 :Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相:乙腈（A）-0.2%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～25 min，10%A→35%A；25～37 min，35%A→59%A；37～40 min，59%A→75%A）；采用波長(zhǎng)切換技術(shù)（0～20 min:230 nm，測(cè)定芍藥苷、甘草苷、阿魏酸、蕓香柚皮苷、橙皮苷；20～40 min:270 nm，測(cè)定黃芩苷、漢黃芩苷、桂皮醛、黃芩素、丹皮酚、甘草酸銨、漢黃芩素）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量:10 μL。理論板數(shù)以黃芩苷峰計(jì)不低于3 000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 分別精密稱取芍藥苷、甘草苷、阿魏酸、蕓香柚皮苷、橙皮苷、黃芩苷、漢黃芩苷、桂皮醛、黃芩素、丹皮酚、甘草酸銨和漢黃芩素對(duì)照品適量，分別置于25 mL量瓶中，加90%甲醇制得質(zhì)量濃度分別為106.2、23.7、25.9、64.1、292.5、333.9、83.4、25.8、77.2、82.4、72.4、53.9 μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取女金丸樣品9 g，精密稱定，精密加入硅藻土4.5 g，混勻，研細(xì)，再精密稱取上述混合物3 g，置于100 mL量瓶中，精密加入90%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用90%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 將女金丸供試品溶液（編號(hào):S1）連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各主要峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果，以黃芩苷為參照峰，21個(gè)特征峰相對(duì)峰面積RSD值為0.12%～1.64%，相對(duì)保留時(shí)間的RSD值為0.14%～0.62%，表明本方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一女金丸供試品溶液（編號(hào):S1），分別于室溫下放置0、3、6、9、15、18、24 h進(jìn)樣分析，記錄各主要峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果，以黃芩苷為參照峰，21個(gè)特征峰相對(duì)峰面積RSD值為0.47%～1.74%，相對(duì)保留時(shí)間的RSD值為0.21%～0.74%，表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批女金丸樣品（編號(hào):S1），按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份，進(jìn)樣分析，記錄各主要峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果，以黃芩苷為參照峰，21個(gè)特征峰相對(duì)峰面積RSD值為0.51%～1.49%，相對(duì)保留時(shí)間的RSD值為0.17%～0.68%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4 指紋圖譜的建立

2.4.1 指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià) 取10批女金丸樣品（S1～S10），按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，將得到的色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012年版）》，以S1為參考圖譜，時(shí)間窗寬度設(shè)為0.3 min，自動(dòng)匹配10批指紋圖譜（采用多點(diǎn)校正），建立女金丸HPLC指紋圖譜的共有模式（平均值法）。根據(jù)匹配結(jié)果確定21個(gè)共有峰，并生成對(duì)照指紋圖譜，計(jì)算出各批次樣品的指紋圖譜相似度均大于0.95。在所有共有峰中，11號(hào)峰位置居中，分離度及對(duì)稱性均良好，確定為參照峰（S）。相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積和相似度測(cè)定結(jié)果分別見(jiàn)表1～表3。S1～S10指紋圖譜疊加圖譜、對(duì)照指紋圖譜以及對(duì)照品圖譜分別見(jiàn)圖1～圖3。

2.4.2 指紋圖譜中共有峰指認(rèn) 通過(guò)與對(duì)照品圖譜（圖3）比對(duì)可以指認(rèn)其中的12個(gè)色譜峰，分別是芍藥苷（2號(hào)峰）、甘草苷（4號(hào)峰）、阿魏酸（5號(hào)峰）、蕓香柚皮苷（6號(hào)峰）、橙皮苷（7號(hào)峰）、黃芩苷（11號(hào)峰）、漢黃芩苷（14號(hào)峰）、桂皮醛（15號(hào)峰）、黃芩素（16號(hào)峰）、丹皮酚（17號(hào)峰）、甘草酸銨（18號(hào)峰）和漢黃芩素（19號(hào)峰）。

表1 10批樣品HPLC圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間Tab 1 Relative retention time of common peaks for 10 batches of Nüjin pills

表2 10批樣品HPLC圖譜共有峰的相對(duì)峰面積Tab 2 Relative peak areas of common peaks for 10 batches of Nüjin pills

2.5 聚類分析

以10批樣品的21個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積為原始數(shù)據(jù)，采用SPSS 22.0軟件，以系統(tǒng)聚類法結(jié)合歐氏距離（d）為測(cè)度進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，d＝25時(shí)，10批樣品可聚為2類，S3為一類，其余聚為一類；d＝5時(shí)，后一類又可聚為3類，即S2、S4、S6、S10聚為一類，S5、S9聚為一類，S1、S7、S8聚為一類。

表3 10批樣品相似度Tab 3 Similarity of 10 batches of Nüjin pills

圖1 10批樣品的HPLC疊加指紋圖譜Fig 1 HPLC superimposed fingerprint of 10 batches of Nüjin pills

圖2 女金丸的HPLC對(duì)照指紋圖譜Fig 2 HPLC control fingerprint of Nüjin pills

2.6 主成分分析

以各共有峰的相對(duì)峰面積為指標(biāo)，將10批女金丸21個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行主成分分析，計(jì)算其特征值和方差貢獻(xiàn)率，以特征值＞1為標(biāo)準(zhǔn)，得到前3個(gè)主成分因子的特征值分別為10.642、1.984、1.061，是影響女金丸質(zhì)量評(píng)價(jià)的主要因子；3個(gè)主成分因子的累積方差貢獻(xiàn)率為90.642%，結(jié)果見(jiàn)表4。選擇提取該3個(gè)主成分因子對(duì)10批女金丸樣品進(jìn)行評(píng)分，以方差貢獻(xiàn)率為分配系數(shù)，線性組合2個(gè)主成分因子，計(jì)算各批樣品的主成分因子得分及綜合得分，并對(duì)綜合得分進(jìn)行排序，結(jié)果見(jiàn)表5（綜越高表明對(duì)女金丸樣品中有效成分的統(tǒng)計(jì)質(zhì)量越好[2-3］）。由表5可知，綜合得分由高到低依次為S3、S5、S10、S9、S4、S8、S2、S6、S1、S7。

圖3 對(duì)照品HPLC圖譜Fig 3 HPLC chromatogram of substance control

圖4 10批樣品聚類分析樹(shù)狀圖Fig 4 Dendrogram of cluster analysis for 10 batches of Nüjin pills

表4 3個(gè)主成分因子的特征值和方差貢獻(xiàn)率Tab 4 Eigenvalue and variance contribution rate of 3 main component factors

表5 10批樣品主成分因子得分及排序Tab 5 Factor scores and sorting of principal components for 10 batches of samples

3 討論

中藥指紋圖譜是一種多指標(biāo)質(zhì)量控制模式，可通過(guò)表征中藥復(fù)雜成分及其內(nèi)在質(zhì)量的關(guān)系來(lái)較全面地反映所含化學(xué)成分的種類和數(shù)量，從而反映藥品的質(zhì)量，在中藥制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)中應(yīng)用廣泛[4-7］。

本研究在制備女金丸HPLC供試品溶液時(shí)，曾分別采用超聲、加熱回流兩種方式，并對(duì)50%甲醇、70%甲醇、90%甲醇、甲醇等提取溶劑進(jìn)行篩選[8-12］。結(jié)果顯示，不同提取方法所得供試品溶液的色譜行為接近，但是部分色譜峰響應(yīng)值存在較為明顯的差異，綜合21個(gè)共有峰的響應(yīng)情況，最終選擇90%甲醇加熱回流1 h進(jìn)行提取。本研究前期分別考察甲醇-水、乙腈-水系統(tǒng)的分離效果，結(jié)果相較于甲醇-水系統(tǒng)，乙腈-水系統(tǒng)梯度洗脫過(guò)程中基線更為平穩(wěn)，分離效果較好。此外，為了改善峰形、提高分離度，本研究前期還考察了在水相中分別添加0.1%、0.2%、0.4%甲酸的效果，結(jié)果在各種酸度條件下色譜行為無(wú)明顯差異，最終選擇乙腈-0.2%甲酸溶液為流動(dòng)相。在測(cè)定波長(zhǎng)的選擇中，采用二極管陣列檢測(cè)器在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)在270 nm波長(zhǎng)處，各色譜峰響應(yīng)較好，因此選擇270 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

本研究所建立的女金丸HPLC指紋圖譜，可反映女金丸的整體性和特異性信息。在21個(gè)共有峰中，通過(guò)與對(duì)照品HPLC圖譜比對(duì)指認(rèn)出了12個(gè)成分。10批樣品的相似度評(píng)價(jià)結(jié)果表明，各批藥材樣品間質(zhì)量存在差異。各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD差異小，但相對(duì)峰面積的RSD相差較大，提示不同廠家的女金丸樣品的成分雖一致，但含量存在差異，提示不同企業(yè)的投料藥材質(zhì)量存在差異。

綜上所述，所建立的HPLC指紋圖譜及聚類分析和主成分分析結(jié)果可為女金丸的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供參考。