豬外周血及骨髓源樹突狀細胞分化方法的建立

趙文影，姜一峰，虞凌雪，趙 款，朱豪杰，高 飛，李國新，張玉嬌，李麗薇，周艷君，劉雪蘭，童光志,3

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，合肥230036；2.中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海200241；3.江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009）

樹突狀細胞（dendritic cell，DC）是目前已知的機體內(nèi)功能最強的抗原遞呈細胞，是將抗原遞呈給B細胞和T細胞從而引發(fā)獲得性免疫應答的主要細胞[1]。DC于19世紀30年代被美國學者分離出來，在抗病毒、腫瘤治療的研究中均得到廣泛應用[2-3]。目前公認的DC類型按來源主要有兩種：髓系和淋巴系，二者在特性和功能上存在一定差別，但是均具有很強的抗原遞呈能力，在獲得性免疫應答建立過程中發(fā)揮重要作用[4]。獲取人源和鼠源DC的方法較為成熟，有商品化的試劑盒可供使用，但目前還沒有商品化的豬源DC分化試劑盒可供使用，各種豬源DC分化方法間也存在較大差別。本研究對豬外周血和骨髓源單核細胞DC分化方法進行比較和研究，建立了成熟的外周血和骨髓單核細胞源DC分化方法，為進一步研究病毒感染后豬體建立獲得性免疫應答的機制奠定了平臺基礎。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器 淋巴細胞分離液（50494LSM?Lymphocyte Separation Medium）購自Biomedicals MP公司，紅細胞裂解液購自Biosharp公司，Recombinant Porcine IL-4和Recombinant Porcine GM-CSF購自R&D公司，CD152（CTLA-4）-muIgR-APC Conjugate 購自ANCELL公司，胎牛血清（FBS）和RPMI 1640 培養(yǎng)基購自GIBCO公司，流式細胞分析儀型號為艾森NovoCyte 452170627408。

1.2 實驗動物 15日齡豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive respiratory syndrome virus，PRRSV）、豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、偽狂犬病毒（Psevdorabies virus，PRV）和豬圓環(huán)病毒Ⅱ型（Porcine circovirus，PCV2）陰性健康試驗豬只購自上海某豬場。

1.3 外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）制備 靜脈采集15日齡豬只抗凝血按照50494 LSM?Lymphocyte Separation Medium說明書進行PBMC的分離。取9 mL抗凝血用PBS進行2倍稀釋；將稀釋后的抗凝血緩慢加入同體積的淋巴細胞分離液中，采用500×g的轉(zhuǎn)速在室溫下離心30 min（快速升速，緩慢降速）；用長槍頭緩慢吸出液體中間層的PBMC；將吸出的PBMC用400×g的轉(zhuǎn)速在4℃下離心5 min；若底部有紅細胞，則按1∶4體積加入紅細胞裂解液，靜置10 min后在4℃溫度下以400×g的轉(zhuǎn)速離心5 min，之后用PBS洗滌3次；最后用含1%雙抗的無血清RPMI-1640重懸細胞計數(shù)并鋪板。

1.4 骨髓源單核細胞的分離 取15日齡的仔豬股骨和脛骨，盡可能的去除附著的肌肉和結(jié)締組織并在75%的酒精中浸泡5 min；用酒精燈輕微煅燒，而后用PBS沖洗干凈；用滅菌的骨鉗剪開股骨和脛骨兩端的骨膜，然后用滅菌的骨髓穿刺針在其兩端穿孔；用含有1%雙抗的不完全RPMI-1640培養(yǎng)基反復沖洗骨髓腔，收集細胞懸液；用500×g的轉(zhuǎn)速離心10 min, 棄掉上清；用紅細胞裂解液裂解5 min后，在4℃下用500×g的轉(zhuǎn)速離心5 min，棄上清；用PBS洗滌2次，用含1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細胞，再用70 nm的無菌細胞篩過濾并計數(shù)。

1.5 外周血源單核細胞的分化 將1.3中制備的PBMC按每孔2×106個細胞數(shù)量鋪于六孔板中，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育12 h，棄去上清，用無血清RPMI-1640清洗滌洗2次，此時貼壁的細胞為較為純凈的豬PBMC。用終濃度為100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素和0.25 mg/mL兩性霉素B的RPMI-1640完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，用不同濃度的GM-CSF和IL-4進行刺激分化，持續(xù)7 d。每隔2.5 d，替換一半包含相同濃度細胞因子的完全RPMI-1640培養(yǎng)基，刺激后第7 d在流式細胞儀上檢測DC細胞表面分子標志。

1.6 骨髓源單核細胞的分化 將1.4中制備的骨髓細胞按1.5中的方法進行DC細胞表面分子標志檢測。

1.7 DC表面分子標志檢測 將5×105個DC取置于1.5 mL EP管內(nèi)進行流式染色，取5 μL CD152抗體加入管內(nèi)，混勻后置于4℃ 避光靜置30 min；PBS洗滌3次；用含1% FBS的杜氏磷酸緩沖液（Dulbecco's phophate buffered saline，DPBS）重懸細胞，在流式細胞儀上進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 外周血來源和骨髓源單核細胞源DC形態(tài) 通過單核細胞貼壁時間以及刺激濃度的選擇，確定當單核細胞貼壁12 h后，能夠獲得最多的分化的DC（結(jié)果未展示）。刺激7 d后外周血單核細胞和骨髓源單核細胞發(fā)生形態(tài)學變化，細胞直徑變大且表面出現(xiàn)突觸（圖1）。

圖1 單核細胞形態(tài)變化Fig.1 Morphology change during stimulation

2.2 外周血單核細胞源DC分化條件的確定 采取不同濃度的GM-CSF和IL-4對貼壁12 h的單核細胞持續(xù)刺激，對刺激后0 d、5 d和7 d后的細胞進行流式檢測，結(jié)果顯示當GM-CSF濃度為80 ng/mL、IL-4濃度為40 ng/mL時，刺激后7 d能夠獲得最大比例的樹突狀細胞（圖2）。

2.3 外周血單核細胞源DC刺激分化結(jié)果 選取15日齡仔豬外周血分離PBMC，貼壁12 h后用終濃度為80 ng/mL的GM-CSF和40 ng/mL的IL-4對PBMC持續(xù)刺激7 d，用抗CD152抗體進行流式細胞術檢測，結(jié)果顯示通過此方法能夠?qū)?1.66%的PBMC細胞刺激分化為CD152+的樹突狀細胞（圖3）。

圖2 不同刺激條件下CD152+細胞比率Fig.2 The ratio of CD152+ cells stimulated with different conditions

圖3 外周血單核細胞源DC表面分子CD152的活化情況Fig.3 Detection of CD152+ cells from PBMCs

2.4 骨髓源DC刺激分化結(jié)果 參考外周血分化DC的方法，利用80 ng/mL的GM-CSF和40 ng/mL的IL-4對骨髓源單核細胞進行刺激，連續(xù)刺激7 d后，用CD152抗體檢測陽性細胞數(shù)。結(jié)果顯示用此方法能夠顯著刺激骨髓源DC的分化，可以獲得約63%的CD152+細胞（圖4）。

3 討論

樹突狀細胞（DC）是免疫系統(tǒng)中最強的抗原遞呈細胞和誘導T細胞和B細胞分化的細胞，是連接先天性和獲得性免疫的關鍵[5]。DC表達一系列的模式識別受體，通過模式識別受體識別入侵宿主的微生物、病毒及內(nèi)源性危險的信號分子，從而觸發(fā)多種免疫反應，在抗病毒、抗腫瘤免疫以及免疫耐受的過程中發(fā)揮重要作用[6-8]。

圖4 骨髓單核細胞源DC表面分子CD152的活化情況Fig. 4 Detection of CD152+ cells from the bone-derived DC

DC是由造血干細胞在不同的細胞因子刺激下分化而來，并觸發(fā)不同類型的效應T細胞和B細胞的分化[9-10]。DC的分化成熟是一個復雜的過程，這個過程不僅與DC亞群的特性有關，還與其所在的內(nèi)環(huán)境有關。傳統(tǒng)的DC細胞主要分為3個亞群：pDC、cDC1和cDC2[11]。另外，造血干細胞也可分化為單核細胞源的DC細胞（MoDC），且由于單核細胞具有較多與髓樣cDC2共有的表面標記分子，MoDC很難與髓樣cDC2區(qū)分[12-14]。在體外培養(yǎng)MoDC的過程中，人們發(fā)現(xiàn)IL-4和GM-CSF是誘導單核細胞向DC分化的主要細胞因子[15]。IL-4是抑制單核細胞向巨噬細胞和粒細胞分化的細胞因子，從而引導單核細胞向DC方向分化，GM-CSF是促進DC存活及分化的最有效的細胞因子[16-20]。DCs形態(tài)不規(guī)則，表面許多膜狀或樹突狀突起，細胞表面有特征性標志分子，如CD80、CD86，CD152，CD83[21-22]。目前豬源的DC特征性標記分子還不明確，人們現(xiàn)在最常用的標記分子是CD86、CD80、CD152、CD83等[22-23]。在本研究前期實驗中，我們選取了一些人源和鼠源的CD86、CD83和CD152抗體，在分化成熟后進行流式檢測，發(fā)現(xiàn)只有人源的CD152抗體能檢測到DC的分化情況，這與其他一些實驗者的數(shù)據(jù)不一致[24-25]，我們推測可能是由于豬的品種以及選擇的流式抗體來源不同造成的。在本實驗中我們對外周血來源和骨髓來源單核細胞分化DC的條件進行了摸索探究，以期找到能更好的分化DC的方法。在實驗初期，采用外周血來源的單核細胞對刺激濃度及刺激時間進行摸索同時觀察細胞的形態(tài)，細胞形態(tài)隨刺激時間的延長逐漸變大，表面有樹突狀突起，且在前期成團，后期呈單一分布并半懸浮于培養(yǎng)基中生長。對豬只日齡和刺激濃度的比較發(fā)現(xiàn)，15日齡豬只的PBMC在經(jīng)過7 d連續(xù)刺激且刺激物GM-CSF的濃度為80 ng/mL和IL-4的濃度為40 ng/mL時獲得較大比例的DC，這與Park[23]的實驗結(jié)果不一致，我們推測可能與豬的品種有關。隨后我們參照外周血來源單核細胞分化DC的方法，建立了骨髓源單核細胞分化DC方法。對這兩種方法進行比較發(fā)現(xiàn)骨髓源單核細胞分化DC的方法獲得的DC較為純凈（未展示），陽性細胞數(shù)量達到63%以上且更適合用于后續(xù)實驗的進行，而外周血來源單核細胞分化DC的方法不確定因素太多，實驗結(jié)果的重復性稍差。

本實驗通過對兩種DC分化方法的摸索與比較，建立了外周血來源DC和骨髓源DC分化方法，為進一步研究病毒感染后豬體建立獲得性免疫應答的機制奠定了平臺基礎。