豬JMJD3基因真核表達及其對炎性因子表達調(diào)控的研究

楊 義，陸 艷，張彥兵，魏建超，劉 珂，邵東華，李蓓蓓，馬志永，孫延鳴，邱亞峰

（1.石河子大學動物科技學院，石河子 832003；2.中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

JMJD3又稱KDM6B，是含JMJC結(jié)構(gòu)域的組蛋白去甲基化酶家族成員之一[1]。自從2006年，鑒定出第一個含JMJC結(jié)構(gòu)域的組蛋白去甲基化酶，并命名為JHDM1A又稱KDM2A。目前，該家族已鑒定多個成員，如JHDM1A、JHDM1B、JMJD1A、JMJD2A、JMJD2B、JMJD2C、JMJD3、JMJD6、JARID1A、JARID1B、JARID1C、JARID1D、 UTX和UTY等[2-11]。該家族去甲基化酶活性的催化機制已比較清楚，JMJC結(jié)構(gòu)域在Fe2+、α-酮戊二酸和O2的參與下，催化組蛋白賴氨酸殘基上甲基化氨基生成羥基化中間體，同時產(chǎn)生1分子琥珀酸鹽和1分子CO2，隨后該中間體生成不穩(wěn)定的半氨醛，并進一步分解為去甲基化賴氨酸和甲醛[12]。

雖然JMJD3是H3K27特異的去甲基化酶，但是，JMJD3可以通過去甲基化酶依賴或非依賴的途徑介導基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，進而參與發(fā)育、癌癥以及免疫反應等多種生命活動。值得一提的是，JMJD3參與免疫反應調(diào)控，主要通過去甲基化酶依賴或非依賴的途徑介導炎性因子的表達調(diào)控。其中，JMJD3去甲基化酶依賴的途徑，即改變H3K27的甲基化的水平從而影響炎性因子的表達，這種JMJD3的調(diào)控作用可通過其特異性的抑制劑GSK-J4進行抑制[13]。此外，有研究顯示JMJD3可以作為STAT1和STAT3的靶分子介導LPS誘導的炎性反應，該作用是不依賴其去甲基化酶活性的[14]。

在獸醫(yī)臨床上，病原微生物感染往往伴隨有劇烈的炎性反應，JMJD3是否在其中起著重要的作用還未見報道。本研究聚焦于豬JMJD3分子，通過構(gòu)建豬JMJD3基因真核表達載體，并通過瞬時轉(zhuǎn)染研究其在細胞內(nèi)的表達情況。隨后，利用建立的過表達模型探討豬JMJD3對炎性因子的表達調(diào)控作用。本研究結(jié)果為將來研究JMJD3對炎性因子的表達調(diào)控作用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 載體、細胞及主要試劑 真核表達載體p3x Flag-CMV-14、293T細胞、豬髖動脈內(nèi)皮細胞由本實驗室保存；DNA Marker、大腸桿菌DH5α 購自北京天根生物公司；氨芐青霉素鈉購自摩貝（上海）生物科技有限公司；鼠抗Flag一抗購自Sigma-Aldrich公司、辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗鼠二抗購自Abcam公司；蛋白預染Marker、Lipofectamine 2000和羊抗小鼠熒光二抗購自Thermo公司；大提質(zhì)粒試劑盒購自QIAGEN公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司；TRIzol、PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）、TB GreenTMPremix ExTaqTMII（Tli RNaseH Plus）和限制性內(nèi)切酶購自寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司（TaKaRa中國）。

1.2 真核表達載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)染及表達鑒定

1.2.1 真核表達載體的構(gòu)建 含有JMJD3基因（GenBank登錄號：MK250967）的質(zhì)粒pUC57-JMJD3，由本實驗室構(gòu)建。本研究以重組克隆質(zhì)粒為模板進行PCR擴增（引物序列見表1）。反應條件：98℃變性10 s，68℃延伸6 min，30個循環(huán)，4℃ 保存。通過瓊脂糖凝膠電泳將目的DNA片段進行純化回收，將回收的PCR產(chǎn)物與p3xFlag-CMV-14真核表達載體分別用NotI 和XbaI 進行雙酶切，酶切產(chǎn)物純化后16℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)中，涂布于含有Amp的LB瓊脂平板，37℃ 培養(yǎng)12～16 h，挑取單克隆接種于含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，5～8 h后通過菌液PCR鑒定，提取質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，將鑒定陽性的重組質(zhì)粒送上海英駿生物技術有限公司進行測序。

表1 PCR擴增所用引物Table 1 The primers in this study

1.2.2 真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞 提前12 h將293T細胞鋪到六孔板中，當細胞長到70%～80%聚合時，利用Lipofectamine 2000將p3xFlag-CMV-14載體和Flag-JMJD3 質(zhì)粒分別瞬時轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24 h后收取細胞樣品，用于后續(xù)實驗。

1.2.3 Western blot檢測 配制8%聚丙烯酰胺凝膠進行SDS-PAGE，濕轉(zhuǎn)160 min轉(zhuǎn)印至NC膜，5%脫脂乳室溫搖床封閉1 h，棄去封閉液，TBST漂洗后加入稀釋好的鼠抗Flag抗體（1∶3000），4℃搖床孵育過夜，回收抗體后加TBST置室溫搖床漂洗10 min重復3次，加入HRP標記的羊抗鼠二抗（1∶5000），室溫搖床孵育1 h，棄去抗體加TBST置室溫搖床漂洗10 min重復3次，暗室中進行顯影。

1.2.4 間接免疫熒光檢測（indirect immunoinfluorescence assay，IFA） 提前12 h將細胞鋪到六孔板中，按照相同的方法轉(zhuǎn)染PIEC，24 h后棄去上清，PBS漂洗一遍，用4%多聚甲醛于4℃固定30 min，PBS漂洗3遍后，1% NP40通透15 min，再用PBS漂洗3次，用含2%羊血清的封閉液室溫封閉30 min，室溫孵育鼠抗Flag一抗（1∶400）1 h，加PBS室溫搖床漂洗5 min，重復3次，室溫避光孵育羊抗鼠488二抗1 h，加PBS室溫搖床漂洗5 min，重復3次。然后DAPI染色10 min，加PBS室溫搖床漂洗5 min，重復3次，最后用封片劑封片，熒光顯微鏡觀察拍照。

1.3 豬JMJD3介導的炎性調(diào)控作用分析 提前12 h將PIEC鋪至24孔板，按照相同方法轉(zhuǎn)染PIEC，24 h后PBS 洗1遍，棄去PBS后每孔加入1 mL TRIzol ，收取RNA樣品，反轉(zhuǎn)錄后進行實時熒光定量PCR分析[15]。引物見表2。

表2 實時熒光定量PCR引物Table 2 Primers for real-time qPCR

2 結(jié)果

2.1 豬JMJD3真核表達載體的構(gòu)建 以pUC57-JMJD3克隆質(zhì)粒為模板，利用PCR擴增JMJD3基因，擴增產(chǎn)物經(jīng)0.8% 凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示在約5000 bp處有一特異性條帶，與預期一致（圖1A）。將PCR產(chǎn)物經(jīng)NotI和XbaI雙酶切后克隆到p3xFlag-CMV-14真核表達載體中，獲得的重組質(zhì)粒Flag-JMJD3利用NotI和XhoI進行雙酶切鑒定，可見兩條大小分別為7700 bp及3500 bp左右的片段，與預期結(jié)果一致（圖1B）。此外，對陽性質(zhì)粒進行測序驗證，結(jié)果顯示豬JMJD3基因成功插入p3xFlag-CMV-14真核表達載體中。

圖1 豬JMJD3真核表達載體的構(gòu)建Fig.1 Construction of eukaryotic expression vector of porcine JMJD3

2.2 Western blot 分析rJMJD3表達 將重組表達質(zhì)粒Flag-JMJD3與 Flag-vector分別轉(zhuǎn)染293T細胞，24 h后收取細胞總蛋白進行Western blot分析，利用抗Flag 標簽抗體鑒定Flag-JMJD3的表達。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Flag-JMJD3 組在約200 kDa 處出現(xiàn)特異性的條帶（圖2），F(xiàn)lag-vector組沒有出現(xiàn)條帶。以上結(jié)果說明Flag-JMJD3質(zhì)粒可在293T細胞系中成功表達，表達的蛋白命名為rJMJD3。

圖2 Western blot 鑒定rJMJD3表達Fig.2 Analysis of Flag-JMJD3 expression by Western blot

2.3 IFA分析rJMJD3表達及細胞定位 為進一步檢測Flag-JMJD3的表達及細胞定位，將重組表達質(zhì)粒Flag-JMJD3和Flag-vector瞬時轉(zhuǎn)染入PIEC，并利用IFA對轉(zhuǎn)染的樣品進行分析。結(jié)果顯示：僅轉(zhuǎn)染Flag-JMJD3的細胞顯示特異的綠色熒光，并且定位于細胞核中（圖3）。因此，IFA結(jié)果進一步驗證了rJMJD3在細胞中的表達，并且揭示表達的rJMJD3主要定位于細胞核。

圖3 IFA分析結(jié)果(x400）Fig.3 Analysis of rJMJD3 expression by IFA

2.4 JMJD3 對炎性因子表達調(diào)控分析 為了探討豬JMJD3對炎性因子的表達調(diào)控作用，將重組表達質(zhì)粒Flag-JMJD3和Flag-vector瞬時轉(zhuǎn)染PIEC，24 h后收獲樣品。首先，采用Western blot檢測Flag-JMJD3表達JMJD3情況，結(jié)果顯示能有效表達rJMJD3（圖4A）。隨后，采用RT-qPCR對炎性細胞因子IL12-p35、IL-18等表達情況進行檢測，結(jié)果顯示：相對于空載體組對照組，rJMJD3的表達可以顯著促進IL12-p35和IL-18的表達（圖4B、4C）。因此，以上結(jié)果表明豬JMJD3參與炎性因子的表達調(diào)控。

3 討論

本研究通過真核表達鑒定了豬JMJD3的表達特征，包括：1）在真核細胞中，豬JMJD3的分子質(zhì)量約200 kDa；2）表達的JMJD3主要定位于細胞核中。另外，我們的研究還揭示了過表達豬JMJD3可促進炎性因子IL-12p35和IL-18的表達，并說明豬JMJD3在炎性細胞因子表達調(diào)控中起重要的作用。

在人和小鼠上，JMJD3已鑒定為H3K27的特異的去甲基化酶[1,11]。因此，不難理解過表達的豬JMJD3主要定位于細胞核中，這一結(jié)果與人和小鼠的結(jié)果一致。但豬JMJD3是否為H3K27的去甲基化酶需要進一步的研究，另外，豬JMJD3是否可以介導其他組蛋白如H3K4、H3K9、H3K36等去甲基化也還不清楚，需要進一步研究。

染色體表觀遺傳修飾控制基因的表達或沉默，其中，H3K27m3作為一種重要的基因沉默或轉(zhuǎn)錄抑制的形式[16]，控制基因的表達，從而參與發(fā)育、炎性反應、癌癥等生命活動。在炎性反應調(diào)控中，JMJD3作為H3K27m3特異的去甲基化酶，可以降低H3K27的甲基化水平，進而降低基因轉(zhuǎn)錄的抑制，從而誘導相關基因的表達[17]。比如H3K27m3可以靶向于IL-12的啟動子，繼而抑制IL-12基因的轉(zhuǎn)錄，而JMJD3的表達可介導H3K27的去甲基化，從而促進IL-12的表達[18]。

我們的研究結(jié)果顯示過表達豬JMJD3也可以促進IL-12p35的表達（圖4C），同時，JMJD3過表達還可以促進IL-18的表達。這些結(jié)果說明JMJD3可以介導炎性因子的表達調(diào)控。然而，目前對JMJD3過表達促進這些細胞因子表達機制還不清楚，即是通過去甲基化酶依賴的途徑還是非依賴的途徑需要進一步的研究。總之，本研究明確了豬JMJD3在真核細胞中的表達特征，并初步揭示了JMJD3在炎性因子表達調(diào)控中起重要作用。這些結(jié)果對將來揭示豬JMJD3在炎性疾病中的作用奠定基礎。

圖4 過表達rJMJD3 對炎性因子表達的影響Fig.4 Influence of rJMJD3 overexpression on the expression of inflammatory factors