不同分散劑對沙咪珠利在比格犬體內(nèi)暴露量影響的研究

張志浩，王春梅，張可煜，張麗芳，王 米，劉迎春，王霄旸，費(fèi)陳忠，薛飛群，樂 濤 ，谷 峰

（1.重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶401331；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用化學(xué)藥物及制劑學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200241）

雞球蟲病是由寄生在雞腸道內(nèi)的多種艾美耳屬單細(xì)胞球蟲引起的常見疾病[1-2]，其中以柔嫩艾美耳球蟲的危害最大，致病性最強(qiáng)。雞球蟲病主要臨床癥狀為血便、精神不振等，該病在10～50日齡的雛雞中發(fā)病率最高，發(fā)病率為50%～70%，死亡率為20%～30%，病情嚴(yán)重時死亡率可高達(dá)80%[3-4]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年全世界因?yàn)榍蛳x病造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)到30億美元[5]，我國每年用于預(yù)防和治療球蟲病的花費(fèi)約為6～18億人民幣[6]。

從1939年萊文（Levine）發(fā)現(xiàn)磺胺類藥物能有效治療雞球蟲病以來，使用化學(xué)合成藥物一直是控制球蟲病的主要手段，但是長時間大劑量的使用化學(xué)藥物，不可避免地球蟲會產(chǎn)生耐藥，甚至是多重耐藥。從20世紀(jì)70年代，新藥的研發(fā)速度已經(jīng)跟不上耐藥性蟲株產(chǎn)生的速度[7]?？蒲泄ぷ髡邍L試開發(fā)疫苗去預(yù)防球蟲病，但是關(guān)于雞對球蟲的免疫應(yīng)答機(jī)制還不清楚，研發(fā)的強(qiáng)毒和弱毒疫苗又存在安全性差、效果不理想等缺陷[4,8]。因此，化學(xué)合成藥物仍是目前預(yù)防和治療雞球蟲病的主要手段，并且迫切需要新的化學(xué)藥物來緩解多重的耐藥現(xiàn)狀。

沙咪珠利（EZL）是由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所獸用抗感染藥物創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)自主研發(fā)的新型三嗪類抗球蟲藥物。在前期的研究中發(fā)現(xiàn)EZL有較好的抗球蟲效果[9]，且毒性較小[10]、安全性高，與地克珠利和妥曲珠利無交叉耐藥性，有非常好的應(yīng)用開發(fā)前景。本文研究了EZL分別采用水、CMCNa、PEG200三種不同的分散劑制備的口灌液在比格犬體內(nèi)對藥物暴露量的影響，為EZL新獸藥證書的申報(bào)和后續(xù)的研究作鋪墊。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 沙咪珠利原料藥，純度＞98%，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸研究醫(yī)所合成，批號20171108；1%沙咪珠利溶液劑，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸研究醫(yī)所研制，批號20160415；沙咪珠利標(biāo)準(zhǔn)品，純度99.73%，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸研究醫(yī)所合成，批號20150630。妥曲珠利亞砜（TSO）標(biāo)準(zhǔn)品，純度99.4%±0.2%，購自WTTEGA Laboratorien公司；乙腈，HPLC級，購自Fisher公司；甲醇，HPLC級，購自Fisher公司；其余試劑均為分析純。

1.1.2 儀器設(shè)備 超高效液相色譜儀串聯(lián)紫外檢測器（ACQUITYTM UPLC system，Waters）、渦旋儀（G560E，Scientific Industries）、數(shù)控超聲波清洗器（KQ-500DE型，昆山超聲儀器有限公司）、高速離心機(jī)（CT15RE，Hitachi Koki Co，Ltd）、氮吹儀（N-Evap nitrogen evaporator，柏林）、電子天平（AE240，Mettler-Toledo）和微孔濾膜（SCAA-104，上海安譜科學(xué)儀器有限公司）等。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動物和樣品采集 比格犬6只，雌雄各半，購自上海新岡實(shí)驗(yàn)動物場，體重8～10 kg。自由采食和飲水，水和食物中不含任何藥物。給藥前比格犬禁食12 h，不禁水。將一定量的沙咪珠利分別用0.5%CMCNa、PEG200和水配制成3 mg/g 的口灌溶液。將比格犬隨機(jī)分成三組，分別灌服以上3種溶液。給藥劑量為3 mg/kg bw，給藥量1 g/kg。給藥后分別在0、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12、24、36 h從前肢靜脈采集1 mL血液，肝素抗凝，3000×g離心10 min分離血漿，冷凍保存于-20 ℃冰箱中。間隔一周后進(jìn)行隨機(jī)交叉實(shí)驗(yàn)采樣一次。

1.1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 稱取20 mg EZL對照品溶于甲醇中，超聲30 min使藥物完全溶解，配置成1000 μg/mL的EZL儲備液，用甲醇稀釋成一系列的EZL標(biāo)準(zhǔn)液，4℃冰箱保存。稱取10 mg的TSO標(biāo)準(zhǔn)品溶于10 mL的甲醇中，配置1000 μg/mL的TSO標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇稀釋成200 μg/mL，4℃冰箱保存。

1.1.5 樣品處理 實(shí)驗(yàn)前將待測樣品從冰箱中取出，放置至室溫，取200 μL血漿樣品至1.5 mL尖頭離心管中，加入10 μL內(nèi)標(biāo)液后渦旋混勻，再加入1 mL乙酸乙酯，渦旋30 s后將離心管放至高速離心機(jī)，10000×g離心10 min，將上層有機(jī)相轉(zhuǎn)移2 mL平頭離心管中，氮?dú)獯蹈?，過固相萃取小柱，甲醇提取液，氮?dú)獯蹈桑尤?00 μL流動相復(fù)溶殘?jiān)?，渦旋30 s后過0.22 μm濾膜，進(jìn)樣測定。

1.1.6 色譜條件 本實(shí)驗(yàn)選取ACQUITY UPLC BEH C18（Waters，2.1*50 mm，1.7 μm）色譜柱，保護(hù)住是Van Guard BEH C18（1.7 μm），內(nèi)標(biāo)是TSO，檢測波長設(shè)定為251 nm，樣品溫度25℃，柱溫30℃，A相為乙腈，B相為水，流速為0.2 mL/min，梯度洗脫條件如表1。

表1 UPLC梯度洗脫方法Table 1 UPLC gradient elution method

1.2 方法

1.2.1 專屬性 在設(shè)定的分析條件下分析方法對待測物質(zhì)和干擾物質(zhì)的區(qū)分能力，比較空白血漿和空白血漿加藥的色譜圖，觀察比較在待測藥物和內(nèi)標(biāo)的峰保留時間有無干擾峰。

1.2.2 檢測限和定量限 取空白血漿，加入逐級稀釋的EZL標(biāo)準(zhǔn)液10 μL，按照樣品處理方法處理樣品，把信噪比（S/N）＞3血藥濃度作為檢測限，信噪比（S/N）＞10血藥濃度作為定量限。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取200 μL血漿滴加10 μL內(nèi)標(biāo)溶液和10 μl EZL標(biāo)準(zhǔn)液，按照1.1.6樣品處理方法處理樣品，制備濃度為0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液。取10 μL進(jìn)樣分析，以EZL濃度為橫坐標(biāo)，EZL與內(nèi)標(biāo)TSO濃度比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。

圖1 檢測比格犬血漿內(nèi)EZL標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Linear correlation of standard curve of EZL in beagle plasma

1.2.4 準(zhǔn)確度和精密度 實(shí)驗(yàn)選取0.1、1、5 μg/mL 3個濃度進(jìn)行考察，取200 μL空白血漿加入對應(yīng)的標(biāo)液，按照上述的樣品處理方法進(jìn)行處理，連續(xù)測樣3 d，計(jì)算相對回收率和批內(nèi)、批間變異系數(shù)。

1.2.5 樣品穩(wěn)定性 實(shí)驗(yàn)考察了樣品室溫存放8 h和反復(fù)凍融3次的穩(wěn)定性，選取0.5、5 μg/mL 2個濃度進(jìn)行測定，每個濃度做5個平行，計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 本實(shí)驗(yàn)的藥代動力學(xué)參數(shù)是經(jīng)DAS 3.0處理獲得，統(tǒng)計(jì)值以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(mean±SD)，EXCEL2016處理獲取藥時曲線及變異系數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 方法專屬性 空白樣品和空白加藥樣品經(jīng)前處理后進(jìn)樣，色譜圖如圖2所示。比較可知，在色譜圖上EZL和TSO的出峰位置均無干擾峰，分離度良好，方法專屬性良好，滿足檢測的需要。

圖2 方法專屬性圖譜Fig.2 Chromatograms of method specificity

2.2 檢測限和定量限 取空白血漿添加倍比稀釋的EZL標(biāo)準(zhǔn)液，樣品經(jīng)處理后，進(jìn)樣計(jì)算求得當(dāng)EZL的濃度為0.05 μg時，信噪比（S/N）＞3；當(dāng)EZL的濃度為0.1 μg時，信噪比（S/N）＞10，由此該方法的檢測限和定量限分別為0.05、0.1 μg/mL。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線 由圖1可知，在藥物濃度0.1～10 μg/mL時，EZL和TSO峰面積的比值與EZL濃度線性關(guān)系良好，計(jì)算求得回歸方程式是y = 6.4953x + 0.0048，（R2=0.9999），完全滿足檢測需要。

2.4 準(zhǔn)確度和精密度 如表2所示，空白血漿3個添加濃度0.1、1、5 μg/mL檢測結(jié)果顯示，添加濃度回收率為91.4%～110%，批內(nèi)、批間變異系數(shù)均在10%以內(nèi)。檢測結(jié)果表明，該方法重復(fù)性好，變異系數(shù)和回收率均在可接受范圍內(nèi)，均滿足檢測需要。

表格2 比格犬血漿中EZL含量檢測的準(zhǔn)確度和精密度Table 2 Accuracy and precision results of EZL in beagle plasma

2.5 樣品穩(wěn)定性 如表3、4所示，空白血漿2個添加濃度0.5、5 μg/mL，在室溫下放置8 h、反復(fù)凍融3次后的檢測結(jié)果。結(jié)果表明：樣品室溫放置8 h、反復(fù)凍融3次后經(jīng)處理相對回收率均基本不變，說明藥物在血漿內(nèi)比較穩(wěn)定，短期室溫放置與凍融不會對分析結(jié)果造成影響。

表3 比格犬血漿添加樣品室溫放置8 h穩(wěn)定性結(jié)果Table 3 Stability of beagle plasma spiked samples in 8 h at roon temperature

表4 比格犬血漿添加樣品反復(fù)凍融3次穩(wěn)定性結(jié)果Table 4 Stability of beagle plasma spiked after freezingthawing three times

2.6 藥時數(shù)據(jù)及藥時曲線 由圖3、表5可知3種分散劑下藥物的達(dá)峰時間均在1 h左右，0.5%CMCNa分散劑下藥物的Cmax最大，但是在比格犬體內(nèi)的保留相對較短，在24 h已經(jīng)低于定量限。在PEG200和水2種分散劑下的藥物在比格犬體內(nèi)保留時間較長，可達(dá)24 h。

2.7 不同分散劑對藥物在體內(nèi)暴露量的影響 運(yùn)用t檢驗(yàn)將主要藥動學(xué)參數(shù)進(jìn)行差異性分析，發(fā)現(xiàn)水、0.5%CMCNa和PEG200對沙咪珠利在實(shí)驗(yàn)動物比格犬體內(nèi)的暴露量差異不具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），結(jié)果見表6。

表5 不同分散劑對沙咪珠利分散經(jīng)口服后在不同時間點(diǎn)時比格犬血漿中沙咪珠利濃度Table 5 The concentration-time data of EZL in beagle plasma after oral administration diverse dispersants

3 討論

暴露量是指藥物經(jīng)一定的給藥途徑進(jìn)入動物體內(nèi)后血漿組織的藥物濃度，其大小通常用AUC來恒量。暴露量研究是藥物研發(fā)中不可缺少的環(huán)節(jié)，早期臨床研究可以為后期試驗(yàn)提供劑量選擇，故其設(shè)計(jì)不同于確證性試驗(yàn)，更應(yīng)具有前瞻性，并根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康亩ㄖ蒲芯客ǔ２捎没谀Ｐ偷姆治龇椒?，以期為研究的更多開展提供理論參考。美國早在2003年就發(fā)布了有關(guān)暴露反應(yīng)關(guān)系，設(shè)計(jì)數(shù)據(jù)分析及管理應(yīng)用的指南，認(rèn)為信息在任何藥物安全性和有效性的評價中都處于中心地位[11]。本次動物實(shí)驗(yàn)，分別用水稀釋沙咪珠利溶液劑、0.5%CMCNa和PEG200將沙咪珠利原料藥配制成口灌液，經(jīng)單次對比格犬灌服后，通過DAS3.0軟件對血漿藥物濃度-時間數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，獲得沙咪珠利的藥物動力學(xué)參數(shù)。經(jīng)t檢驗(yàn)可知，主要藥動學(xué)參數(shù)AUC(0-t)、Cmax差異不具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見表6）。表明分散劑水、CMCNa和PEG200對沙咪珠利在實(shí)驗(yàn)動物比格犬體內(nèi)暴露量的影響差異不具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 不同分散劑對沙咪珠利分散經(jīng)口服后比格犬血漿中沙咪珠利的藥時曲線Fig.3 The concentration-time curve of EZL in beagle dog plasma after oral administration diverse dispersants

表6 不同分散劑下藥物動力學(xué)參數(shù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(mean±SD, n=4)Table 6 Statistical analysis of pharmacokinetic parameters of diverse dispersants