固相萃取-高效液相色譜測(cè)定飼料中新橙皮苷二氫查耳酮和柚皮苷二氫查耳酮

潘 城, 胡朝陽, 任小英, 吳 凌, 黃何何, 江鳳玲, 謝 勇, 邱秀玉

(福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院, 福建 福州 350002)

二氫查耳酮衍生物具有甜度好、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn),在飼料工業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用[1,2]。其作為調(diào)味劑加入飼料中能產(chǎn)生持久的新鮮甜味效應(yīng),與其他甜味劑復(fù)配能起協(xié)同作用,可增進(jìn)仔豬食欲,促進(jìn)生長(zhǎng),改善母豬產(chǎn)后進(jìn)食,縮短產(chǎn)后恢復(fù)時(shí)間。此外,由于其極佳的苦味掩蔽和增香作用,能大大改善飼料本身的風(fēng)味和適口性,掩蓋飼料中添加藥物或甜味劑(如糖精、甜菊糖等)帶來的苦味[3,4]。歐盟法規(guī)(EU)2015/264[5]已批準(zhǔn)新橙皮苷二氫查耳酮(NHDC)可作為調(diào)味劑加入魚、羊、狗、小牛和某些類別的豬飼料中,中國(guó)《飼料添加劑安全使用規(guī)范(2017年修訂版)》[6]允許其作為豬飼料甜味劑使用,上述法規(guī)規(guī)定最高限量均不得超過35 mg/kg。

目前,柚皮苷二氫查耳酮(Naringin DC)的檢測(cè)方法尚未見報(bào)道,新橙皮苷二氫查耳酮的測(cè)定方法主要有高效液相色譜(HPLC)法[7-13]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法[14-21]、毛細(xì)管電泳法[22]、電化學(xué)傳感器法[23]等。HPLC-MS/MS法質(zhì)譜儀器昂貴,檢測(cè)成本較高,難以普及應(yīng)用;毛細(xì)管電泳法重現(xiàn)性較差、檢測(cè)靈敏度較低;電化學(xué)傳感器穩(wěn)定性較差,儀器使用壽命較短,導(dǎo)致檢測(cè)成本提高;HPLC法具有定量準(zhǔn)確可靠、檢測(cè)成本較低、普及范圍廣等優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于飼料行業(yè)檢測(cè)領(lǐng)域。當(dāng)前,二氫查耳酮類物質(zhì)的檢測(cè)方法報(bào)道多見于食品方面,飼料領(lǐng)域研究甚少,歐盟飼料添加劑檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室(EURL-FA)[24]建立了飼料中新橙皮苷二氫查耳酮的測(cè)定方法,提出飼料樣品經(jīng)超聲萃取后直接過濾上機(jī)檢測(cè),定量限為0.8 mg/kg。該方法前處理過程較為簡(jiǎn)單,但檢測(cè)限相對(duì)較高,而飼料基質(zhì)成分復(fù)雜,企業(yè)出于成本考慮在生產(chǎn)過程中添加的二氫查耳酮含量往往低至1 mg/kg左右,因此需要更進(jìn)一步的凈化手段以保證飼料中低含量二氫查耳酮的測(cè)定準(zhǔn)確性。

本文建立了固相萃取結(jié)合HPLC法同時(shí)測(cè)定飼料中新橙皮苷二氫查耳酮和柚皮苷二氫查耳酮。該方法具有良好的抗干擾能力,檢測(cè)靈敏度高,重現(xiàn)性好,適用于飼料中二氫查耳酮的定量檢測(cè),可為飼料生產(chǎn)企業(yè)、飼料監(jiān)管部門和進(jìn)出口檢測(cè)部門提供方法依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀配光電二極管陣列檢測(cè)器(美國(guó)安捷倫科技有限公司); DS-8510超聲波發(fā)生器(上海生析超聲儀器有限公司);分析天平(賽多利斯北京有限公司); Milli Q超純水制備器(美國(guó)密理博有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-5203(上海亞榮生化儀器廠); 60位全自動(dòng)平行濃縮儀(美國(guó)瑞科有限公司);單發(fā)渦旋振蕩器(德國(guó)IKA有限公司); Sigma 4-16KS高速冷凍離心機(jī)(北京博勱行儀器有限公司)。WondaSep?HLB固相萃取柱(60 mg/3 mL,島津(上海)實(shí)驗(yàn)器材有限公司); Clearnert PEP-2固相萃取柱(500 mg/6 mL,天津博納艾杰爾公司); C18固相萃取柱(200 mg/3 mL,福建藍(lán)昊生物科技有限公司); BRP固相萃取柱(60 mg/3 mL,月旭科技(上海)股份有限公司); ProElut NH2固相萃取柱(200 mg/3 mL,北京迪馬科技有限公司)。乙二胺基-N-丙基(PSA)、石墨化碳黑(GCB)、佛洛里硅土填料(安捷倫科技有限公司); Spax GP-C18填料(40～60 μm,12 nm,美國(guó)賽分科技有限公司)。尼龍66有機(jī)濾膜(0.45 μm,天津津騰有限公司);甲醇(色譜純,山東禹王實(shí)業(yè)有限公司);其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

標(biāo)準(zhǔn)品:新橙皮苷二氫查耳酮(純度98.0%)、柚皮苷二氫查耳酮(純度98.0%)均購于天津阿爾塔科技有限公司。

1.2 溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制:準(zhǔn)確稱取新橙皮苷二氫查耳酮和柚皮苷二氫查耳酮標(biāo)準(zhǔn)品(純度均為98.0%)各0.100 0 g,用甲醇溶解并定容至100 mL,配制得質(zhì)量濃度均為980 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制:將新橙皮苷二氫查耳酮和柚皮苷二氫查耳酮的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液采用逐級(jí)稀釋法用50%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲醇溶液配制濃度為0.2、0.5、1.0、5.0、9.8和49.0 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。所有標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液置于0～4 ℃下保存。

1.3 樣品預(yù)處理

稱取10.00 g飼料樣品于100 mL具塞錐形瓶中,加入70 mL甲醇溶液,置于超聲波振蕩器中超聲萃取30 min,轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度線并混勻。取40 mL溶液,以10 000 r/min的速度離心3 min,取10 mL上清液于50 mL雞心瓶中,在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上于40 ℃下旋至近干,用2 mL 50%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲醇溶液分兩次渦旋溶解后轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中,加入8 mL純水,以10 000 r/min的速度離心3 min,待凈化。先后用3 mL甲醇和3 mL純水淋洗HLB小柱,將上述溶液轉(zhuǎn)移至HLB小柱,保持流出液流速為每分鐘1～2滴,待上柱液全部流出后,用5 mL 10%甲醇溶液淋洗,棄去淋洗液,用5 mL 60%甲醇溶液洗脫,將洗脫液氮吹至0.5 mL,加入50%甲醇溶液定容至1.0 mL,混勻,以尼龍66有機(jī)濾膜過濾,濾液供分析用。

圖 2 采用不同色譜柱和不同流動(dòng)相時(shí)兩種二氫查耳酮的色譜圖Fig. 2 Chromatograms of the two dihydrochalcones using different chromatographic columns and mobile phases a. Waters Symmetry?C18 column with methanol/water as the mobile phases; b. CNW?Athena C18-WP column with methanol/water as the mobile phases; c. Welch ultimate?XB-C18column with methanol/water as the mobile phases; d. Welch ultimate?XB-C18 column with acetonitrile/water as the mobile phases. Peak Nos.: 1. Naringin DC; 2. NHDC.

1.4 高效液相色譜條件

色譜柱:Welch ultimate?XB-C18柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm);柱溫:35 ℃;流動(dòng)相:A相為甲醇,B相為純水;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:25 μL;檢測(cè)波長(zhǎng):282 nm。梯度洗脫程序:0～15.0 min, 43%A; 15.0～15.5 min, 43%A～90%A; 15.5～20.0 min, 90%A; 20.0～20.5 min, 90%A～43%A; 20.5～25.0 min, 43%A。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇和優(yōu)化

2.1.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

為了考察檢測(cè)波長(zhǎng)對(duì)目標(biāo)化合物檢測(cè)靈敏度的影響,利用DAD檢測(cè)器在210～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行掃描,得到兩種二氫查耳酮的紫外-可見光譜圖(見圖1)。為消除溶液中有紫外吸收的雜質(zhì)在低波長(zhǎng)處的干擾,最終選擇282 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖 1 兩種二氫查耳酮的紫外-可見光譜圖Fig. 1 UV-Vis spectra of the two dihydrochalconesNHDC: neohesperidin dihydrochalcone; Naringin DC: naringin dihydrochalcone.

2.1.2色譜柱和流動(dòng)相的選擇

比較了Waters Symmetry?C18柱(150 mm×3.9 mm, 5 μm)、CNW?Athena C18-WP柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm)和Welch ultimate?XB-C18柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm)這3種分析柱以及不同流動(dòng)相體系對(duì)兩種二氫查耳酮的分離效果。結(jié)果表明,當(dāng)流動(dòng)相體系為甲醇/水時(shí),目標(biāo)物在Waters Symmetry?C18柱上無法達(dá)到有效分離(見圖2a);在CNW?Athena C18-WP柱上達(dá)到基線分離,但出峰時(shí)間較晚、峰形展寬,容易受雜質(zhì)峰干擾,影響定量檢測(cè)(見圖2b);而在Welch ultimate?XB-C18柱上可得到較理想的分離效果,兩種二氫查耳酮色譜峰的分離度好、靈敏度高,且出峰時(shí)間適宜(見圖2c);當(dāng)流動(dòng)相體系為乙腈/水時(shí),其在Welch ultimate?XB-C18柱出峰太快且無法分離(見圖2d)。因此選用Welch ultimate?XB-C18柱作為分析柱,以甲醇/水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫檢測(cè)。

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1提取條件的優(yōu)化

比較了純水、50%甲醇溶液和純甲醇溶液的超聲萃取效果。經(jīng)加標(biāo)回收試驗(yàn)考察,超聲提取30 min,在50%甲醇溶液和純甲醇提取體系下,兩種二氫查耳酮的加標(biāo)回收率均可達(dá)95%以上,而純水作為提取體系下的加標(biāo)回收率均低于40%。飼料中往往含有飼料蛋白質(zhì),使用純甲醇溶液提取能夠較好地沉淀飼料蛋白質(zhì),同時(shí)便于進(jìn)行后續(xù)的濃縮步驟,因此選擇純甲醇溶液作為提取溶劑。

2.2.2濃縮條件的優(yōu)化

考察了濃縮過程對(duì)于兩種二氫查耳酮加標(biāo)回收率的影響。向10 mL離心后的空白基質(zhì)樣品提取液中加入1 mL 0.980 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上于40 ℃下旋至近干,用1 mL 50%甲醇溶液溶解,過濾后上機(jī)檢測(cè)。結(jié)果表明,經(jīng)過濃縮,柚皮苷二氫查耳酮和新橙皮苷二氫查耳酮獲得理想的回收率,平均回收率分別為101%和104%。

2.2.3凈化條件的優(yōu)化

QuEChERS法[25,26]和固相萃取法[27,28]已被廣泛應(yīng)用于飼料的前處理凈化?？疾炝薌CB、C18粉、PSA、佛洛里硅土等4種吸附劑對(duì)兩種二氫查耳酮回收率的影響及其凈化效果,其回收率分別為39%～48%、85%～97%、81%～97%和79%～90%。GCB的凈化效果良好但回收率低,C18、PSA和弗羅里硅土3種吸附劑的回收率較高但凈化效果不明顯,因此QuEChERS法不適用于本試驗(yàn)中飼料樣品的前處理。

圖 3 兩種二氫查耳酮在不同固相萃取柱上的平均回收率(n=3)Fig. 3 Mean recoveries of the two dihydrochalcones ondifferent solid phase extraction columns (n=3)

考察了兩種二氫查耳酮在NH2、PEP-2、BRP、C18、HLB等5種固相萃取柱上的回收率,結(jié)果見圖3。由圖可知,NH2和PEP-2柱對(duì)兩種二氫查耳酮的保留效果較差,平均回收率分別為0.4%和17.0%; HLB、C18和BRP柱的平均回收率為92%～98%,兩種二氫查耳酮在HLB柱上的回收率最高,平均回收率均達(dá)98%。以HLB為凈化小柱,進(jìn)一步比較了洗脫液甲醇濃度分別為30%、40%、50%、60%、80%和100%的洗脫效果。結(jié)果表明,隨著洗脫液甲醇濃度的增加,兩種二氫查耳酮的回收率增大,50%甲醇溶液洗脫的回收率在78%左右,當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)增加到60%及以上時(shí),回收率均在98%以上,同時(shí)能達(dá)到較理想的凈化效果,繼續(xù)增加甲醇體積分?jǐn)?shù)會(huì)帶進(jìn)更多雜質(zhì)干擾,因此選擇60%甲醇作為洗脫液。同時(shí)進(jìn)一步優(yōu)化了洗脫體積,洗脫液為3 mL時(shí)回收率在90%左右,5 mL時(shí)回收率在98%左右。因此選擇5 mL的60%甲醇溶液進(jìn)行洗脫。

圖 4 豬飼料和魚飼料經(jīng)HLB固相萃取柱凈化的結(jié)果Fig. 4 Results of pig and fish feeds cleaned up usingan HLB solid phase extraction column

同時(shí)考察了HLB小柱對(duì)豬和魚飼料的凈化效果(見圖4和圖5)。結(jié)果表明,樣品經(jīng)HLB小柱凈化后,豬和魚飼料基質(zhì)干擾效應(yīng)明顯降低,因此選用HLB小柱作為凈化柱。

圖 5 豬飼料和魚飼料加標(biāo)樣品經(jīng)HLB固相萃取柱凈化的結(jié)果Fig. 5 Results of spiked pig and fish feeds cleaned upusing an HLB solid phase extraction column Peak Nos.: 1. Naringin DC (1.0 mg/kg); 2. NHDC (1.0 mg/kg).

2.3 線性方程、線性關(guān)系、檢出限及定量限

配制兩種二氫查耳酮質(zhì)量濃度為0.196到49.0 mg/L之間的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,以峰面積對(duì)質(zhì)量濃度(單位mg/L)進(jìn)行線性回歸,線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限見表1。結(jié)果表明,新橙皮苷二氫查耳酮和柚皮苷二氫查耳酮在0.2～49.0 mg/L內(nèi)具有很好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)r均>0.999,定量限分別為0.02和0.01 mg/kg,方法定量限完全能滿足飼料中二氫查耳酮的檢測(cè)要求。

2.4 方法回收率和精密度

在優(yōu)化后的檢測(cè)條件下,取飼料樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率測(cè)試,加標(biāo)水平分別為0.1、1.0、4.7和9.8 mg/kg,每個(gè)水平重復(fù)分析3次,結(jié)果見表2。從表2中可知,該方法的加標(biāo)回收率范圍為86.2%～105.0%, RSDs為1.0%～6.3%。結(jié)果表明,該方法適用于飼料中兩種二氫查耳酮的日常分析檢測(cè)。

2.5 穩(wěn)定性

取0.2、1.0和9.8 mg/L 3個(gè)質(zhì)量濃度的二氫查耳酮標(biāo)準(zhǔn)溶液,于室溫下放置2、4、6、8、12 h和2～6 d,考察二氫查耳酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的日內(nèi)和日間穩(wěn)定性。結(jié)果表明,低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的二氫查耳酮標(biāo)準(zhǔn)溶液日內(nèi)精密度分別為2.7%～4.1%、0.7%～2.0%和0.1%～0.6%,日間精密度分別為3.2%～6.0%、3.1%～5.3%和0.9%～1.7%。由此可見,兩種二氫查耳酮日內(nèi)和日間穩(wěn)定性均較好,有利于實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

應(yīng)用本方法分別對(duì)共計(jì)20件不同批次的飼料樣品進(jìn)行測(cè)定,有一件檢測(cè)出新橙皮苷二氫查耳酮,含量為0.42 mg/kg。

表 1 兩種二氫查耳酮的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限及定量限

Y: peak area;X: mass concentration, mg/L.

表 2 飼料中兩種二氫查耳酮的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)

3 結(jié)論

本文采用固相萃取結(jié)合高效液相色譜法對(duì)飼料中二氫查耳酮含量進(jìn)行分析檢測(cè)。該方法采用甲醇超聲萃取,經(jīng)HLB小柱固相萃取凈化,較大程度降低了飼料復(fù)雜基質(zhì)的干擾。方法靈敏度高,重現(xiàn)性好,適用于飼料中二氫查耳酮的定量檢測(cè),可為飼料生產(chǎn)企業(yè)、飼料監(jiān)督部門及進(jìn)出口檢測(cè)部門提供技術(shù)支持。