固相萃取-高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法同時測定食品中9種人工合成甜味劑

唐吉旺, 袁列江, 肖 泳, 王 秀, 王淑霞

(1. 湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院, 湖南 長沙 410007; 2. 中南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 湖南 長沙 410083)

甜味劑是賦予食品甜味的功能性食品添加劑。甜味劑可分為天然和合成兩大類。由于合成甜味劑不能在人體內(nèi)代謝,也不能提供或只能提供很少的卡路里,它們也被稱為非營養(yǎng)性甜味劑。其甜度是蔗糖的幾十倍甚至上萬倍。近年來,非營養(yǎng)性合成甜味劑的消費增加已成為全球趨勢[1]。安賽蜜(acesulfame-K, ACS-K)、糖精鈉(saccharin sodium, SAC)、甜蜜素(cyclamate, CYC)、三氯蔗糖(sucralose, SCL)、阿斯巴甜(aspartame, ASP)、阿力甜(alitame, ALI)、紐甜(neotame, NEO)、甘素(kulcin, DUL)及新橙皮甙二氫查爾酮(neohesperidin dihydrochalcone, NHDC)等人工合成甜味劑在食品工業(yè)中倍受歡迎,主要用于生產(chǎn)無糖低熱食品,甚至在藥品和衛(wèi)生產(chǎn)品中也有使用人造甜味劑的報道[2]。據(jù)報道,攝入高劑量的合成甜味劑可能對健康有害,導(dǎo)致一系列不良反應(yīng),如皮膚病變、頭痛、呼吸困難等[3]。然而,食品生產(chǎn)過程中還普遍存在甜味劑濫用、違禁使用的現(xiàn)象,食品中多種甜味劑復(fù)配使用的情況比較普遍。因此,建立一種具有高通量、高準確度、高靈敏度的甜味劑檢測方法,加強高強度甜味劑的監(jiān)管就顯得尤為重要。

目前,甜味劑的分析方法主要有液相色譜法[4-6]、薄層色譜法[7]、離子色譜法[8]、毛細管電泳法[9]、電化學(xué)方法[10]及光譜分析方法[11]等,主要以液相色譜法為主。由于不同甜味劑的物理化學(xué)性質(zhì)、電化學(xué)性質(zhì)和光譜性質(zhì)存在顯著差異,以上方法在測定多種甜味劑混合物時均存在一定的缺陷,一般只能分析一種甜味劑或簡單的幾種甜味劑混合物。近年來,液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)由于具有檢測通量大、準確、靈敏的特點,被廣泛用于食品領(lǐng)域的檢測,運用該技術(shù)同時分析多種甜味劑已經(jīng)成為一種趨勢[12-20]。然而,已報道的質(zhì)譜檢測方法大多數(shù)針對簡單的食品樣品基質(zhì),如白酒、葡萄酒等,或存在缺乏樣品凈化步驟、凈化方式較為粗劣等問題。在分析基質(zhì)復(fù)雜的樣品時,樣品本身所帶來的基質(zhì)效應(yīng)(ME)給質(zhì)譜分析帶來很大的挑戰(zhàn)。為了降低基質(zhì)效應(yīng)的影響,文獻[21,22]報道比較多的方法是采用基質(zhì)匹配標準曲線法。然而,該法存在較大的缺陷。一是很難找到對應(yīng)的空白基質(zhì)樣品,二是實驗操作也比較麻煩。因此,很有必要采用有效的凈化方式對復(fù)雜基質(zhì)樣品提取溶液進行凈化處理,此外還可以采取內(nèi)標法,進一步降低或消除樣品基質(zhì)效應(yīng),以確保分析結(jié)果的可靠性及準確性。

本文研究建立了固相萃取凈化-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,結(jié)合內(nèi)標法定量,同時測定含乳飲料、糕點及調(diào)味品等復(fù)雜食品基質(zhì)中9種高強度甜味劑。復(fù)雜基質(zhì)樣品經(jīng)固相萃取凈化處理后,基本上排除了基質(zhì)效應(yīng)的影響,提升了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測結(jié)果的穩(wěn)健性及可靠性。該方法簡單、快捷、準確可靠,在確保檢測結(jié)果質(zhì)量的同時,也在很大程度上提高了檢測效率。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Altus A-30h超高效液相色譜儀(珀金埃爾默公司); QTRAP 5500質(zhì)譜儀,配電噴霧離子(ESI)源(美國SCIEX公司); Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司); PEP固相萃取柱(規(guī)格為200 mg、6 mL)(天津博納艾杰爾科技有限公司);超聲儀(上海易凈超聲波儀器有限公司);試管振蕩器(美國Tbboy); Allegra 64R離心機(美國貝克曼公司)。

甲醇(HPLC級,德國默克公司);三乙胺(分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司);甲酸(色譜純,上海安譜科學(xué)儀器有限公司);甲酸銨(色譜純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司);安賽蜜(99.0%, CAS號:33665-90-6)、糖精鈉(99.9%, CAS號:128-44-9)、甜蜜素(98.9%, CAS號:139-05-9)、三氯蔗糖(99.0%, CAS號:56038-13-2)、阿斯巴甜(97.2%, CAS號:22839-47-0)、阿力甜(98.0%, CAS號:80863-62-3)、紐甜(99.4%, CAS號:165450-17-9)、甘素(98.0%, CAS號:150-69-6)、新橙皮甙二氫查爾酮(98.2%, CAS號:20702-77-6)及內(nèi)標華法林鈉(warfarin sodium) (98.0%, CAS: 129-06-6)等均購于上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.2 緩沖提取溶液的配制

將0.8 mL甲酸加入1 L水中,然后在攪拌的狀態(tài)下用約為2.5 mL三乙胺調(diào)pH值至4.5,配制成三乙胺緩沖溶液。

1.3 標準溶液的配制

分別稱取10.0 mg安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、阿力甜、紐甜、甘素及新橙皮甙二氫查爾酮標準品,用水溶解并定容至10.0 mL,配制成質(zhì)量濃度均為1.0 g/L的單標儲備液,于4 ℃冰箱中保存。

稱取華法林鈉10.0 mg于10 mL容量瓶中,用水定容至刻度,配制成1.0 g/L內(nèi)標儲備液;用移液器分別準確移取100 μL單標儲備液于10 mL容量瓶中,用甲醇-水(4∶6, v/v)稀釋并定容至刻度,配制成質(zhì)量濃度為10.0 mg/L的混合標準中間液;用同樣的方法配制質(zhì)量濃度為10.0 mg/L的內(nèi)標中間溶液,然后繼續(xù)用甲醇-水(4∶6, v/v)稀釋成質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的內(nèi)標使用液;最后,移取不同體積的混合標準中間液,用甲醇-水(4∶6, v/v)配制成一系列不同質(zhì)量濃度的混合標準工作液,內(nèi)標的質(zhì)量濃度均為10 μg/L,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4 樣品處理

1.4.1樣品提取

稱取2 g(精確至0.001 g)經(jīng)粉碎均勻的固體樣品(糕點、蜜餞、果凍等)或混勻的液體樣品(含乳飲料、液體調(diào)味品等)于50 mL具蓋塑料離心管中,加入30 mL三乙胺緩沖溶液,渦旋振蕩5 min;如果是固體樣品還需超聲提取10 min,以便充分提取目標物。然后用三乙胺緩沖溶液定容至50 mL,混合均勻,備用。如果樣品中甜味劑含量過高,可進一步稀釋,使樣品溶液中甜味劑濃度在標準曲線范圍內(nèi)。

1.4.2樣品凈化

首先固相萃取柱分別用6 mL甲醇和6 mL水活化,然后準確移取以上提取溶液2.0 mL于固相萃取柱上。待樣品溶液滴完后,加入3 mL三乙胺緩沖溶液淋洗柱子,將柱子抽干,最后用4 mL甲醇洗脫,洗脫液用10 mL刻度試管接收起來,準確加入100 μL內(nèi)標使用液,用水定容至10 mL刻度,混勻,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測。

1.5 儀器條件

1.5.1色譜條件

色譜柱:Phenomenex Knietex?F5(100 mm×2.1 mm, 2.6 μm);流動相A為:5 mmol/L甲酸銨溶液,含0.1%(v/v)甲酸;流動相B為甲醇;梯度洗脫程序見表1;流速為0.4 mL/min;柱溫為30 ℃;進樣量為10 μL。

表 1 流動相梯度洗脫程序

Mobile phase A: 5 mmol/L ammonium formate containing 0.1% (v/v) formic acid; mobile phase B: methanol.

1.5.2質(zhì)譜條件

離子源:ESI;根據(jù)被測化合物在正、負離子掃描模式下響應(yīng)靈敏度的大小,選擇正離子掃描方式或負離子掃描方式;采用MRM模式。質(zhì)譜采用正、負離子掃描時,噴霧電壓分別為5.5 kV和4.5 kV;離子源溫度為500 ℃;氣簾氣壓力:0.24 MPa;噴霧氣(Gas 1)和輔助加熱氣(Gas 2)流速均為55 μL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

首先采用針泵流動注射連續(xù)進樣的方式進行質(zhì)譜全掃描檢測,得出被測化合物一級質(zhì)譜圖,找出每個化合物對應(yīng)的母離子。然后進行二級質(zhì)譜掃描,得到相應(yīng)的子離子。每個化合物找出兩對特征離子,分別進行碰撞能量及去簇電壓優(yōu)化,最后得到了安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、阿力甜、紐甜、甘素及新橙皮甙二氫查爾酮9種甜味劑及內(nèi)標華法林鈉的最優(yōu)質(zhì)譜參數(shù),如表2所示。安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、阿力甜、紐甜、新橙皮甙二氫查爾酮及內(nèi)標華法林鈉在負離子模式下有很好的響應(yīng),故采用負離子[M-H]-作為這些化合物的母離子;甘素在正離子模式下有較強的[M+H]+離子峰,但沒有[M-H]-離子峰,故采用正離子模式掃描。質(zhì)譜具有正負離子切換監(jiān)測功能,可在同一針樣品運行中同時進行正負離子掃描。

表 2 9種人工合成甜味劑及內(nèi)標(IS)的多反應(yīng)監(jiān)測參數(shù)

* Quantification ion.

圖 1 MRM模式下9種人工合成甜味劑及內(nèi)標的總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion chromatogram of the nine artificial sweeteners and the internal standard under MRM mode Artificial sweeteners: 100 μg/L; IS: 10 μg/L. Peak identifications: 1. acesulfme-K; 2. cyclamate; 3. saccharin sodium; 4. suralose; 5. aspartame; 6. dulcin; 7. alitame; 8. neohesperidin dihydrochalcone; 9. neotame; 10. IS.

2.2 色譜條件的優(yōu)化

色譜柱的選擇:選用規(guī)格相同的Venusi?AS-T C18、Hypersil GOLD及Phenomenex Knietex?F5等幾款色譜柱進行測試。結(jié)果表明,9種甜味劑及內(nèi)標在Phenomenex Knietex?F5柱上具有較好的峰形、響應(yīng)及分離度。

流動相的優(yōu)化:對比了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%(v/v)甲酸水、乙腈-0.1%(v/v)甲酸水、甲醇-5 mmol/L甲酸銨(含0.1%(v/v)甲酸)、乙腈-5 mmol/L甲酸銨(含0.1%(v/v)甲酸)、甲醇-5 mmol/L乙酸銨(含0.1%(v/v)乙酸)及乙腈-5 mmol/L乙酸銨(含0.1%(v/v)乙酸)等不同流動相體系下的色譜圖強度、峰形及分離效果。結(jié)果表明,在甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%(v/v)甲酸水及乙腈-0.1%(v/v)甲酸水流動相體系中,極性較強的安賽蜜、糖精鈉及甜蜜素峰形較寬、分離度較差;在相同的梯度洗脫條件下,加入銨鹽緩沖溶液后,安賽蜜、糖精鈉及甜蜜素的峰形明顯改善,同時所有甜味劑的分離度得到提高;在甲醇-5 mmol/L甲酸銨(含0.1%(v/v)甲酸為)流動相的梯度洗脫程序下,所得到的色譜圖峰形最好、響應(yīng)強度較高,同時分離效果最好;在乙酸銨體系中,各種甜味劑的響應(yīng)強度沒有在甲酸銨體系中的高,這可能由于乙酸根離子強度過高使背景噪聲過高,降低了信噪比。本研究為了避免較高濃度的緩沖鹽體系對質(zhì)譜的影響,在滿足要求的情況下選用5 mmol/L甲酸銨緩沖鹽體系。因此,最終確定甲醇-5 mmol/L甲酸銨(含0.1%(v/v)甲酸)為流動相。在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下,9種人工合成甜味劑及內(nèi)標的總離子流色譜圖見圖1(9種甜味劑的質(zhì)量濃度均為100 μg/L,內(nèi)標的質(zhì)量濃度為10 μg/L)。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)的評估

許多食品基質(zhì)比較復(fù)雜,含有各種有機物(脂類、碳水化合物、蛋白質(zhì)、維生素、染料、防腐劑等)和無機成分(礦物質(zhì))。所有這些物質(zhì)都能干擾目標物的檢測,引起信號抑制或增強,嚴重影響高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析結(jié)果的準確性和精密度。為了考察本方法在去除基質(zhì)效應(yīng)方面的效果,按照Matuszewski等[23]報道的方法對其進行基質(zhì)效應(yīng)評估。首先選擇不同基質(zhì)且不含甜味劑的空白樣品,按照1.3節(jié)樣品處理步驟進行處理,然后在經(jīng)固相萃取柱凈化的樣品溶液中加入9種甜味劑混合標準溶液,配制成混合樣品基質(zhì)標準溶液。此外,用甲醇-水(4∶6, v/v)配制同樣質(zhì)量濃度的混合標準溶液。最后用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析以上兩種標準溶液,并按照式(1)計算ME:

ME=B/A×100%

(1)

表 4 9種甜味劑的回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)(r2)、檢出限及定量限

y: the ratio of peak areas of the analyte to the internal standard;x: the ratio of mass concentrations of the analyte to the internal standard.

其中,ME表示基質(zhì)效應(yīng)的大小,大于100%時為基質(zhì)增強效應(yīng),小于100%時為基質(zhì)抑制效應(yīng);A、B分別為待測標物在樣品溶液和純?nèi)軇┲械姆迕娣e。9種人工合成甜味劑在糕點、甜面醬及含乳飲料3種樣品基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)測定結(jié)果見表3。結(jié)果表明,甜面醬的基質(zhì)效應(yīng)(ME值在90.1%～106.3%之間)比糕點及含乳飲料的基質(zhì)效應(yīng)(ME值在92.6%～103.1%之間)更強;其中安賽蜜、甜蜜素、阿力甜及紐甜在3種基質(zhì)中表現(xiàn)出基質(zhì)增強效應(yīng),糖精鈉、阿斯巴甜、三氯蔗糖、新橙皮甙二氫查爾酮及甘素在3種基質(zhì)中均表現(xiàn)出基質(zhì)抑制效應(yīng)。但是所有的基質(zhì)效應(yīng)都比較弱(ME值在90%～110%之間),說明PEP固相萃取柱凈化效果良好,有效地去除了樣品基質(zhì)效應(yīng)的干擾。PEP固相萃取柱(填料和使用效果相當于Oasis HLB固相萃取柱)內(nèi)裝有親水親脂平衡填料,含有特定比例的親水基和疏水基,對不同極性的酸性、中性和堿性化合物均有良好的回收率,特別適合復(fù)雜樣品基質(zhì)的處理。本方法還采用華法林鈉作為內(nèi)標,進一步降低了樣品基質(zhì)效應(yīng)的影響,提高了方法的準確度和精密度。

表 3 9種人工合成甜味劑在不同基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1方法的線性范圍、檢出限及定量限

采用內(nèi)標法進行定量,以甜味劑系列標準溶液的峰面積與內(nèi)標華法林鈉的峰面積比值y為縱坐標,其質(zhì)量濃度的比值x為橫坐標,繪制內(nèi)標法標準曲線,并進行線性擬合,計算線性回歸方程。如表4所示,9種甜味劑在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999。在空白基質(zhì)中分別添加甜味劑目標組分,以MRM定量離子的3倍信噪比(S/N=3)確定檢出限、S/N=10確定定量限。如表4所示,9種甜味劑的檢出限和定量限分別在2～30 μg/L和6～100 μg/L之間。

2.4.2方法的準確度和精密度

為了考察方法在復(fù)雜基質(zhì)樣品中的適用性,選擇糕點、甜面醬及含乳飲料等基質(zhì)較為復(fù)雜的空白樣品(固體、半固體或液體),進行3個水平的添加回收試驗,每個水平重復(fù)測定6次,以評價該方法的準確度和精密度。所得到的平均回收率及相對標準偏差(RSD)如表5所示。在糕點、甜面醬及含乳飲料3種不同基質(zhì)中,9種人工合成甜味劑的平均回收率在86.3%～106.3%之間,RSD在1.2%～5.9%之間,均符合食品理化標準《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》(GB/T 27404-2008)要求。

表 5 食品中9種人工合成甜味劑的添加回收率及相對標準偏差(n=6)

2.5 實際樣品的測定

運用本文建立的方法對不同類型的市售食品(糕點、含乳飲料、調(diào)味品等)中的人工合成甜味劑進行測定。為了與國家標準進行方法比對,其中的三氯蔗糖和甜蜜素還另外分別按照食品安全國家標準《食品中三氯蔗糖的測定》(GB/T 22255-2008)和《食品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測定》(GB 5009.97-2016)進行測定。糕點中主要有安賽蜜檢出,含量一般在0.3 g/kg以內(nèi),其他甜味劑很少檢出。在含乳飲料中,三氯蔗糖、阿斯巴甜、紐甜、安賽蜜及甜蜜素檢出率比較高,大多數(shù)含乳飲料中含有其中的兩種或三種甜味劑,含量一般在0.004～0.1 g/kg之間。其中一個含乳飲料按照三氯蔗糖的國家標準方法和本方法檢測,結(jié)果分別為0.063 g/kg和0.067 g/kg;按照甜蜜素的國家標準方法和本方法的檢測,結(jié)果分別為0.12 g/kg和0.13 g/kg;相比之下,測定結(jié)果的絕對差值均未超過算術(shù)平均值的10%。在調(diào)味品(如醬油)中,主要有三氯蔗糖、甜蜜素及糖精鈉檢出,但檢出率不是很高,一般低于5%,含量一般低于0.02 g/kg。

3 結(jié)論

本文以三乙胺緩沖溶液為提取溶劑對食品中9種人工合成高強度甜味劑進行提取,采用親水親脂平衡填料的固相萃取柱對樣品提取溶液進行凈化,結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)及內(nèi)標法進行測定,實現(xiàn)了準確、高效及高通量檢測復(fù)雜食品基質(zhì)中多種人工合成甜味劑的目的。運用于實際樣品的檢測,取得了令人滿意的效果,為食品中甜味劑的篩查和檢測提供了良好的技術(shù)方法。