基于超濾離心前處理的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法手性拆分人血漿中的亞葉酸和5-甲基四氫葉酸非對(duì)映異構(gòu)體及其藥代動(dòng)力學(xué)應(yīng)用

徐陳鳳, 惠文凱, 孫莉莉, 高倩倩, 鄒巧根*

(1. 南京工業(yè)大學(xué), 江蘇 南京 211800; 2. 正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司, 江蘇 連云港 222000; 3. 海納醫(yī)藥科技股份有限公司, 江蘇 南京 210009)

亞葉酸(leucovorin, LV)為四氫葉酸在體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物(結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1),是合成核酸的主要輔酶,也是四氫葉酸在體內(nèi)的活性形式之一。亞葉酸能有效對(duì)抗甲氨蝶呤(methotrexate, MTX)引起的毒性反應(yīng),作為大劑量甲氨蝶呤的解救劑[1,2],是最早使用的化學(xué)保護(hù)劑;亞葉酸也能提升氟嘧啶類(lèi)化合物的細(xì)胞毒性,是多種癌癥如胃癌和結(jié)直腸癌[3]聯(lián)合化療藥物中廣泛使用的化療輔助藥物。亞葉酸一般以非對(duì)映異構(gòu)體混合物的形式存在,臨床試驗(yàn)證明,亞葉酸的生物活性物質(zhì)為左旋體,稱(chēng)為左亞葉酸(6S-LV),在體內(nèi)會(huì)經(jīng)肝臟迅速代謝為活性代謝產(chǎn)物6S-5-甲基四氫葉酸[4,5](6S-5-methyltetrahydrofolate, 6S-5-MeTHF),右亞葉酸(6R-LV)則基本無(wú)藥理活性[6]。

圖 1 亞葉酸和5-甲基四氫葉酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 1 Chemical structures of leucovorin (LV) and5-methyltetrahydrofolate (5-MeTHF)* The chiral center.

左亞葉酸的首次分離是在1952年實(shí)現(xiàn)的[7]?，F(xiàn)有測(cè)定亞葉酸及5-甲基四氫葉酸(5-methyltetrahydrofolate, 5-MeTHF,結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1)的分析方法多為液相色譜法[8-10]和LC-MS/MS法[11-13]。Schleyer等[10]開(kāi)發(fā)的液相色譜法能同時(shí)拆分亞葉酸和5-甲基四氫葉酸兩對(duì)非對(duì)映異構(gòu)體,但其流動(dòng)相采用磷酸鹽緩沖體系,不適用于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng),同時(shí)該方法靈敏度低。Liu等[11]開(kāi)發(fā)的LC-MS/MS法,在僅達(dá)到基本基線分離的情況下,需使用兩個(gè)方法才能將亞葉酸和5-甲基四氫葉酸兩對(duì)非對(duì)映異構(gòu)體拆分;同時(shí)該方法前處理步驟繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng),不適用于大批量生物樣本檢測(cè)。早期文獻(xiàn)[12]則采用復(fù)雜的柱切換技術(shù),方法耗時(shí)且靈敏度低。

手性是生物系統(tǒng)的基本特征之一,目前臨床上所用藥物中約40%是手性藥物[14],除天然產(chǎn)物外,約75%的合成手性藥物則是以外消旋體的形式存在[15]。藥物對(duì)映體立體化學(xué)的不同使其與各受體的親和力不同,導(dǎo)致藥理作用的差異極大,如張怡穎等[16]拆分了存在一個(gè)不對(duì)稱(chēng)手性中心的甲基苯丙胺(methamphetamine, METH),其S-(+)-METH和R-(-)-METH對(duì)中樞神經(jīng)作用和毒性機(jī)制均有很大不同。由此可見(jiàn),在進(jìn)行臨床藥物代謝動(dòng)力學(xué)與血藥濃度檢測(cè)時(shí)有必要從對(duì)映體的藥效學(xué)角度來(lái)選擇測(cè)定的目標(biāo)化合物。

本研究建立了基于超濾離心前處理且能夠同時(shí)定量拆分人血漿中亞葉酸和5-甲基四氫葉酸兩對(duì)非對(duì)映異構(gòu)體的LC-MS/MS法。該方法快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高,已成功應(yīng)用于人體藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究,同時(shí)能為后期進(jìn)行左亞葉酸制劑生物等效性研究提供技術(shù)支持。

表 1 工作溶液的質(zhì)量濃度

STD: standard sample; LLOQ: lower limit of quantification; LQC: low quantification; MQC: middle quantification; HQC: high quantification.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

安捷倫1100液相色譜儀(美國(guó)Agilent Technologies公司)串聯(lián)API 4000 Q Trap質(zhì)譜(加拿大AB Sciex公司),配備數(shù)據(jù)采集軟件Analyst 1.6.3。

亞葉酸對(duì)照品(鈣鹽,純度85.6%,批號(hào)100252-101204)和甲氨蝶呤對(duì)照品(純度99.8%,批號(hào)100138-201606)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;5-甲基四氫葉酸對(duì)照品(鈣鹽,純度99.0%,批號(hào)F0M040,美國(guó)USP Certificate);甲醇、三氟乙酸銨、乙酸、巰基乙醇、乙酸銨和抗壞血酸(均為色譜級(jí),阿拉丁公司)。受試制劑(T1):注射用左亞葉酸鈉(50 mg,批號(hào)160421201-1,南京海納醫(yī)藥科技股份有限公司);參比制劑(R1):注射用亞葉酸鈉(100 mg,批號(hào)21415002-3,武漢人福藥業(yè)有限責(zé)任公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液與標(biāo)準(zhǔn)加樣血漿的配制

精密稱(chēng)取適量亞葉酸、5-甲基四氫葉酸、甲氨蝶呤對(duì)照品,經(jīng)質(zhì)量校正系數(shù)校正后,將其溶于50%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲醇-水(含500 mg/L巰基乙醇和抗壞血酸)中,得到最終質(zhì)量濃度分別為200、200、100 mg/L的儲(chǔ)備液,分裝后置于-80 ℃冰箱保存。以50%甲醇-水(含500 mg/L巰基乙醇和抗壞血酸)為溶劑稀釋亞葉酸和5-甲基四氫葉酸儲(chǔ)備液,獲得8個(gè)水平的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品系列工作溶液(STD1～STD8)和5個(gè)水平的質(zhì)控樣品系列工作溶液(定量下限質(zhì)控樣品簡(jiǎn)寫(xiě)為L(zhǎng)LOQ,低濃度質(zhì)控樣品簡(jiǎn)寫(xiě)為L(zhǎng)QC,中濃度質(zhì)控樣品簡(jiǎn)寫(xiě)為MQC,高濃度質(zhì)控樣品簡(jiǎn)寫(xiě)為HQC,定量上限質(zhì)控樣品簡(jiǎn)寫(xiě)為ULOQ),工作溶液具體質(zhì)量濃度見(jiàn)表1。所有工作液均置于-20 ℃冰箱保存。取20 μL相應(yīng)工作溶液加入380 μL空白血漿,配制成相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)加樣血漿。

1.3 樣品前處理

精密移取200 μL血漿,加入50 μL內(nèi)標(biāo)工作液(含500 μg/L甲氨蝶呤)、500 μL甲醇,渦旋3 min,于4 ℃以12 000 r/min的速度離心10 min,取450 μL上清至孔徑為3 kDa的0.5 mL超濾離心管中,于4 ℃以12 000 r/min的速度離心20 min,收集濾液待分析。

1.4 LC-MS/MS條件

色譜柱:手性HSA柱(150 mm×4 mm, 5 μm,英國(guó)Chrom Tech Inc);柱溫:25 ℃;自動(dòng)進(jìn)樣器溫度:4 ℃;流動(dòng)相A: 10 mmol/L乙酸銨(用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至8.0);流動(dòng)相B:乙腈;進(jìn)樣量:20 μL。梯度洗脫程序:0～0.5 min, 100%A; 0.5～2.5 min, 100%A～85%A; 2.5～10.0 min, 85%A; 10.0～12.0 min, 85%A～100%A; 12.0～14.0 min, 100%A。

正離子電噴霧離子(ESI)源;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式;離子化電壓為5 000 V;離子源溫度為600 ℃;氣簾氣(CUR)流速為25 L/h;錐孔氣(GS1)流速為45 L/min;去溶劑氣(GS2)流速為40 L/min。去簇電壓(DP)、入口電壓(EP)、碰撞能量(CE)、碰撞池出口電壓(CXP)及其他條件見(jiàn)表2。

1.5 臨床試驗(yàn)方案

本試驗(yàn)經(jīng)皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批,合理可行。篩選6位健康志愿受試者,試驗(yàn)前簽署知情同意書(shū)。

研究采用單中心、兩制劑、兩周期、交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)。每周期試驗(yàn)的第1天早晨,所有受試者在復(fù)查生命體征后,埋置靜脈留置導(dǎo)管,并于給藥前0.5和0 h采集空白血樣。受試者在2 h內(nèi)分別靜脈滴注125 mg/m26R,S-LV或62.5 mg/m26S-LV,于給藥后0.25、0.5、1.0、1.5、2.0(給藥結(jié)束)、2.25、2.5、2.75、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、12、24、36、48 h由前臂靜脈采血4 mL,記錄實(shí)際采血時(shí)間。所采集的血樣置于5 mL一次性負(fù)壓枸櫞酸鈉抗凝采血管中,于4 ℃以12 000 r/min的速度離心10 min,分離出的血漿樣本中加入含有50 mg/L的抗壞血酸和50 mg/L巰基乙醇甲醇溶液,置于已標(biāo)記好的Axygen試管中,于-80 ℃的低溫冰箱中保存待測(cè)。

表 2 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

DP: declustering potential; EP: entrance potential; CE: collision energy; CXP: collision cell exit potential; IS: internal standard.

2 結(jié)果與討論

2.1 血漿樣品前處理優(yōu)化

在生物樣品分析研究中樣品前處理步驟關(guān)系到測(cè)定靈敏度和研究結(jié)果的可靠性。本研究采用簡(jiǎn)便快速的蛋白質(zhì)沉淀和液液萃取法進(jìn)行樣品前處理。但發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)沉淀存在嚴(yán)重的基質(zhì)效應(yīng),而液液萃取則提取回收率低,無(wú)法滿(mǎn)足試驗(yàn)所需靈敏度。因此,傳統(tǒng)的前處理方法并不能達(dá)到令人滿(mǎn)意的結(jié)果。Liu等[11]報(bào)道了一種蛋白質(zhì)沉淀-固相萃取預(yù)處理方法,該方法無(wú)基質(zhì)效應(yīng),且提取回收率較高,但該方法前處理步驟繁瑣且耗時(shí)長(zhǎng),需花費(fèi)近5 h來(lái)完成整個(gè)前處理過(guò)程,檢測(cè)效率較低,不適用于大批量血漿樣本的檢測(cè)。

超濾技術(shù)是介于微濾和納濾之間的一種膜分離技術(shù),平均孔徑為3～100 nm,具有凈化、分離、濃縮溶液等功能,其截留機(jī)理主要包括膜的篩分作用和靜電作用,常應(yīng)用于蛋白質(zhì)濃縮[17]和測(cè)定血漿蛋白質(zhì)結(jié)合率。近年來(lái),超濾離心結(jié)合蛋白質(zhì)沉淀[18]和添加解離劑[19]已成功應(yīng)用于樣品前處理和臨床研究中的在線監(jiān)測(cè)。在本研究中由于6R-LV和6S-LV的血漿蛋白質(zhì)結(jié)合率不同,因此難以確定既滿(mǎn)足使結(jié)合藥物完全釋放又無(wú)蛋白質(zhì)沉淀現(xiàn)象出現(xiàn)的解離劑體積。故最終選用超濾離心結(jié)合蛋白質(zhì)沉淀作為樣品前處理方法。

超濾離心濾膜的孔徑大小和離心時(shí)間可影響亞葉酸和5-甲基四氫葉酸非對(duì)映異構(gòu)體的提取回收率。本研究在保持其他參數(shù)恒定的情況下測(cè)試了3種不同孔徑(3、10和50 kDa)超濾離心管的提取情況。結(jié)果顯示3 kDa孔徑超濾離心管最適宜。因?yàn)?0和50 kDa孔徑超濾離心管具有嚴(yán)重的基質(zhì)效應(yīng);而3 kDa孔徑超濾離心管非特異性吸附效應(yīng)更強(qiáng),但其靈敏度仍滿(mǎn)足要求。

離心時(shí)間經(jīng)過(guò)考察確定為20 min,更長(zhǎng)的離心時(shí)間并不會(huì)增加待測(cè)物的回收率。

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

方法學(xué)驗(yàn)證內(nèi)容與接受標(biāo)準(zhǔn)參考美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局[20]最新指導(dǎo)原則。

2.2.1專(zhuān)屬性

為消除空白血漿中內(nèi)源性亞葉酸和5-甲基四氫葉酸的干擾,將空白血漿按如下方法[10]處理:向空白血漿中加入適量甲酸,使內(nèi)源性葉酸降解,然后用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.4。

取6批不同來(lái)源的空白血漿,按1.3節(jié)方法(其中內(nèi)標(biāo)工作液用含500 mg/L巰基乙醇和抗壞血酸的50%甲醇-水代替)處理后進(jìn)樣。取空白血漿配制定量下限(LLOQ)質(zhì)量濃度(含25 μg/L 6R-LV、25 μg/L 6S-LV、12.5 μg/L 6R-5-MeTHF、12.5 μg/L 6S-5-MeTHF)的血漿樣品及健康受試者靜脈注射125 mg/m26R,S-LV、62.5 mg/m26S-LV 2.5 h后的血漿樣品,按1.3節(jié)方法處理后進(jìn)樣,色譜圖見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示,亞葉酸非對(duì)映異構(gòu)體和5-甲基四氫葉酸非對(duì)映異構(gòu)體均完全分離,血漿內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測(cè)定,同時(shí)待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)的測(cè)定互不干擾。

2.2.2線性試驗(yàn)

按1.2節(jié)方法配制相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品工作溶液,取20 μL工作溶液,加入380 μL空白血漿,稀釋成標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,按1.3節(jié)方法處理進(jìn)樣。以待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值Y為縱坐標(biāo)、待測(cè)物血樣質(zhì)量濃度X(單位μg/L)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得到待測(cè)物6R-LV、6S-LV、6R-5-MeTHF和6S-5-MeTHF的回歸方程分別為Y=3.53×10-4X+1.01×10-3、Y=3.7×10-4X+1.47×10-3、Y=1.78×10-3X+2.51×10-3和Y=1.71×10-3X+1.09×10-3;相關(guān)系數(shù)r分別為0.999 0、0.999 1、0.998 9和0.998 2。結(jié)果顯示各待測(cè)物線性關(guān)系良好。

2.2.3準(zhǔn)確度、精密度與穩(wěn)定性

按1.2節(jié)方法,配制相應(yīng)濃度的質(zhì)控樣品工作溶液。取75 μL相應(yīng)工作溶液,加入1 425 μL空白血漿,稀釋成質(zhì)控樣品。按1.3節(jié)方法處理后進(jìn)樣。每個(gè)濃度有6份重復(fù)質(zhì)控樣品。連續(xù)測(cè)定3批,至少分兩天完成。準(zhǔn)確度精密度結(jié)果見(jiàn)表3。

表 3 亞葉酸和5-甲基四氫葉酸在不同加標(biāo)水平下的準(zhǔn)確度和精密度(n=6)

表 4亞葉酸和5-甲基四氫葉酸在不同加標(biāo)水平下的基質(zhì)效應(yīng)和回收率(n=6)

Table 3Matrix effects and recoveries of LV and 5-MeTHFunder different spiked levels (n=6)

同上制備低、高濃度質(zhì)控樣品(LQC、HQC)若干份,其中6份按1.3節(jié)方法處理后立即進(jìn)樣,然后將該樣品置于4 ℃進(jìn)樣器,放置52 h后再進(jìn)樣測(cè)定。另取6份反復(fù)凍融3次,6份避光于室溫放置4 h, 6份于-80 ℃下保存30 d,然后將這18份血漿樣品按1.3節(jié)方法處理后進(jìn)樣測(cè)定,將樣品的測(cè)得濃度與理論濃度相比較;同時(shí)考察儲(chǔ)備液于-80 ℃下保存30 d、工作液于室溫放置4 h和-20 ℃下保存3 d的檢測(cè)結(jié)果,結(jié)果表明其偏差均在±15%范圍內(nèi)?？梢?jiàn),在以上條件下亞葉酸與5-甲基四氫葉酸的穩(wěn)定性均良好。

2.2.4提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)

按2.2.3節(jié)方法配制低、中、高濃度質(zhì)控樣品(LQC、MQC、HQC),對(duì)基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率進(jìn)行考察。血漿中待測(cè)物的提取回收率和經(jīng)內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果見(jiàn)表4。內(nèi)標(biāo)甲氨蝶呤提取回收率為(78.9±0.04)%。結(jié)果表明,在本試驗(yàn)條件下,待測(cè)物的回收率均良好,血漿基質(zhì)效應(yīng)對(duì)測(cè)定無(wú)影響。

2.2.5稀釋準(zhǔn)確性驗(yàn)證

按1.2節(jié)方法配制含400 mg/L 6R-LV、400 mg/L 6S-LV、240 mg/L 6R-5-MeTHF和240 mg/L 6S-5-MeTHF的工作溶液,取20 μL該工作溶液,加入380 μL空白血漿,配制成含20 mg/L 6R-LV、20 mg/L 6S-LV、6 mg/L 6R-5-MeTHF、6 mg/L 6S-5-MeTHF的稀釋質(zhì)控樣品(DQC)。取50 μL DQC,加入150 μL空白血漿,得到進(jìn)一步稀釋后的DQC,平行制備6份,按1.3節(jié)方法處理后進(jìn)樣。結(jié)果顯示,所有經(jīng)稀釋后的DQC檢測(cè)結(jié)果的平均值相對(duì)于理論值的偏差在±15.0%以?xún)?nèi),所有DQC檢測(cè)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.63%,表明該方法稀釋準(zhǔn)確性良好。

2.3 藥代動(dòng)力學(xué)研究

采用本方法測(cè)定6名健康受試者靜脈滴注125 mg/m26R,S-LV和62.5 mg/m26S-LV后的血藥濃度,以時(shí)間(單位為h)為橫坐標(biāo)、測(cè)定的血藥質(zhì)量濃度(單位為μg/L)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,活性成分6S-LV和6S-5-MeTHF的平均血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖3; DAS 3.2.8軟件計(jì)算的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表5。

圖 3 受試者靜脈注射62.5 mg/m26S-LV和125 mg/m26R,S-LV后活性成分6S-LV和6S-5-MeTHF平均血藥濃度-時(shí)間曲線(n=6)Fig. 3 Mean drug mass concentration-time profiles of 6S-LV and 6S-5-MeTHF in human plasma afterintravenous administration of 62.5 mg/m26S-LV and 125 mg/m26R,S-LV (n=6)

表 5 主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(n=6)

Cmax: maximum observed concentration; AUC0-t: area under the curve from the time of dosing (dosing-time) to the last measurable concentration;Tmax: time of Cmax;t1/2: terminal half-life; CL: apparent total body clearance;V: apparent volume of distribution.

表 6 6S-LV和6S-5-MeTHF藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)等效性評(píng)價(jià)(n=6)

AUC0-∞: area under the curve from dosing time extrapolated to infinity, based on the last predicted concentration;T1/R1: the relevant parameter of 62.5 mg/m26S-leucovorin dosage divided by 125 mg/m26R,S-leucovorin; CV: coefficient of variation.

結(jié)果顯示,受試者給予125 mg/m26R,S-LV和62.5 mg/m26S-LV后,均未在體內(nèi)檢測(cè)到6R-5-MeTHF,表明6R-5-MeTHF不會(huì)在體內(nèi)生成;同時(shí),受試者給予62.5 mg/m26S-LV后,未在體內(nèi)檢測(cè)到6R-LV,表明體內(nèi)未發(fā)生藥物手性轉(zhuǎn)置。以相同劑量6S-LV計(jì),受試者給予單一左旋體或外消旋體后,對(duì)體內(nèi)有效成分6S-LV和6S-5-MeTHF主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(血漿峰濃度Cmax、從時(shí)間點(diǎn)0到最后可定量時(shí)間點(diǎn)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)時(shí)間曲線下面積AUC0-t、從時(shí)間點(diǎn)0到無(wú)限的藥物代謝動(dòng)力學(xué)時(shí)間曲線下面積AUC0-∞)劑量校正后再進(jìn)行自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換,然后對(duì)其進(jìn)行方差分析,并進(jìn)一步采用雙向單側(cè)T檢驗(yàn)和(1-2α)%(檢驗(yàn)水準(zhǔn),α=0.05)置信區(qū)間法進(jìn)行受試者給予125 mg/m26R,S-LV和62.5 mg/m26S-LV后體內(nèi)活性成分藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的等效性評(píng)價(jià),具體結(jié)果見(jiàn)表6。同時(shí)對(duì)體內(nèi)有效成分6S-LV和6S-5-MeTHF的達(dá)峰時(shí)間(Tmax)采用非參數(shù)(Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn))檢驗(yàn)法進(jìn)行檢驗(yàn),P>0.05。以上結(jié)果證明,受試者給予125 mg/m26R,S-LV和62.5 mg/m26S-LV后,體內(nèi)有效成分6S-LV和6S-5-MeTHF的主要藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)均無(wú)顯著差異,藥物代謝動(dòng)力學(xué)特征一致,吸收的速度和程度一致。

3 結(jié)論

本文建立了基于超濾離心前處理且能夠同時(shí)定量拆分人血漿中亞葉酸和5-甲基四氫葉酸兩對(duì)非對(duì)映異構(gòu)體的HPLC-MS/MS法。相較于之前的研究,該方法在消除基質(zhì)效應(yīng)的前提下,比固相萃取前處理操作簡(jiǎn)單且耗時(shí)短,極大地提高了生物樣品檢測(cè)的效率,同時(shí)還具有靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)。已成功應(yīng)用于人體藥代動(dòng)力學(xué)研究,并能夠?yàn)楹笃谶M(jìn)行左亞葉酸制劑人體生物等效性研究提供技術(shù)支持。

本文成功將超濾離心技術(shù)運(yùn)用于生物樣品前處理,揭示了其在生物樣品前處理運(yùn)用中的前景。超濾離心應(yīng)用于生物樣品前處理仍存在一些需要改進(jìn)和繼續(xù)研究的內(nèi)容,而其中非特異性吸附導(dǎo)致的回收率低則是首要難關(guān),因?yàn)檫@將限制超濾離心在高靈敏度檢測(cè)中的應(yīng)用,這些現(xiàn)存問(wèn)題將在后續(xù)研究中深入討論。