被動(dòng)凝集法、間接免疫熒光法和膠體金法聯(lián)合檢測(cè)肺炎支原體抗體對(duì)兒童肺炎支原體感染的診斷價(jià)值

王居鵬，朱黎娜，馬明坤，陳慧，郭素香，任麗

肺炎支原體（MP）是引起兒童社區(qū)獲得性肺炎（CAP）的主要病原體［1-2］，10%～46%的兒童CAP 由MP感染引起［3-5］。MP感染每3～7年可出現(xiàn)周期性流行［6-7］。MP缺乏細(xì)胞壁，僅對(duì)氟喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素類藥物敏感［8］。早期診斷是盡早治愈的關(guān)鍵，也可避免抗生素濫用。專家共識(shí)推薦聯(lián)合病原學(xué)與血清學(xué)方法進(jìn)行MP 感染的檢測(cè)［9］。目前許多實(shí)驗(yàn)室不具備開展核酸檢測(cè)或病原體培養(yǎng)等病原學(xué)檢測(cè)的條件。血清學(xué)方法中被動(dòng)凝集法（PA）檢測(cè)MP 總抗體，非特異性反應(yīng)小，少數(shù)患兒可呈持續(xù)高滴度，陽性并不能說明是現(xiàn)癥感染。間接免疫熒光法（IFA）和膠體金法（GICT）定性檢測(cè)MP-IgM 抗體，陽性可提示MP急性感染，但I(xiàn)FA易受人為因素、類風(fēng)濕因子及自身抗體等影響，也易因包被抗原不足出現(xiàn)假陰性。GICT 操作簡(jiǎn)單快速，所需血量少，但患者體內(nèi)抗體含量低時(shí)易造成漏診。實(shí)驗(yàn)室需至少開展2種或以上方法彌補(bǔ)相互不足。許多研究比較了血清學(xué)方法間的優(yōu)缺點(diǎn)［10-12］，但對(duì)血清學(xué)方法聯(lián)合檢測(cè)的研究甚少。本研究旨在比較PA、IFA 和GICT 兩兩聯(lián)合檢測(cè)對(duì)兒童MP 感染的診斷價(jià)值，為選擇更準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的兒童MP感染檢測(cè)方法提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象及分組 納入 2019 年1 月1 日—2021 年 8 月31日于天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院兒科住院的行MP抗體檢測(cè)的患兒617例，其中男298例，女319例，年齡1～15歲，平均（5.6±2.9）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）患兒就診時(shí)以咳嗽、咽痛、發(fā)熱癥狀為主要表現(xiàn)。（2）入院后采用PA、IFA和GICT檢測(cè)MP抗體。（3）臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：存在免疫缺陷、心血管疾病、先天畸形等。MP 感染臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)［13-14］：（1）持續(xù)劇烈咳嗽，干咳為主，發(fā)熱多見，胸部影像學(xué)表現(xiàn)較早期肺部體征更明顯。（2）外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)大多正?；蛏栽龈?，重癥患兒可見白細(xì)胞降低，C 反應(yīng)蛋白（CRP）多增高，血沉多增快。（3）青霉素、頭孢類抗生素治療無效。（4）結(jié)合MP血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果。共345例患兒確診為MP感染（MP感染組），男160例，女 185 例，年齡 1～14 歲，平均（6.3±3.0）歲；272 例為非 MP 感染組，男138 例，女134 例，年齡1～15 歲，平均（4.8±2.7）歲。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會(huì)審批（審批號(hào)2020-026-01）。

1.2 試劑與儀器 MP總抗體檢測(cè)試劑盒購自日本富士瑞必歐株式會(huì)社；9 項(xiàng)呼吸道感染病原體IgM 抗體檢測(cè)試劑盒購自西班牙Vircell 公司；肺炎支原體IgM 抗體檢測(cè)試劑盒（膠體金法）購自北京貝爾生物工程有限公司。熒光顯微鏡BX51 購自日本 Olympus 公司；TL-2000MM-1 型微量振蕩儀購自上海宇力電子有限公司。

1.3 檢測(cè)方法 收集患兒PA 檢測(cè)MP 總抗體檢測(cè)結(jié)果，IFA、GICT檢測(cè)MP-IgM的檢測(cè)結(jié)果（均為患兒入院后治療前采樣）。PA：采用MP 總抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)患兒MP 總抗體，按說明書進(jìn)行操作并判讀陰陽性結(jié)果及抗體滴度，滴度＜1∶40 為陰性，滴度≥1∶40 判斷為陽性。IFA：采用9 項(xiàng)呼吸道感染病原體IgM 抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)患兒MP-IgM 抗體，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，標(biāo)本中1%～15%細(xì)胞的細(xì)胞核、胞漿或胞膜出現(xiàn)蘋果綠色熒光，判定為陽性。GICT：采用肺炎支原體IgM 抗體檢測(cè)試劑盒（膠體金法）檢測(cè)患兒MP-IgM抗體，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作并判讀陰陽性結(jié)果，若質(zhì)控線和檢測(cè)線均出現(xiàn)，判定陽性；若只出現(xiàn)質(zhì)控線，不出現(xiàn)檢測(cè)線，判定陰性；若質(zhì)控線、檢測(cè)線均不出現(xiàn)或只出現(xiàn)檢測(cè)線，表明測(cè)試無效，應(yīng)重新對(duì)標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。當(dāng)2種檢測(cè)方法聯(lián)合進(jìn)行結(jié)果判斷時(shí)，1種方法陽性即為結(jié)果陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，2 組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。采用Kappa值進(jìn)行一致性檢驗(yàn)，Kappa值0～0.2 為一致性差；0.21～0.40 為一致性弱；0.41～0.60 為中度一致；0.61～0.80 為一致性較好；0.81～1.00 為一致性極好［15］。繪制受試者工作特征（ROC）曲線，計(jì)算曲線下面積（AUC）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2 組一般資料比較 MP 感染組患兒的年齡大于非MP 感染組，2 組性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MP感染組 PA 檢測(cè) MP 總抗體、IFA 和 GICT 檢測(cè) MPIgM 抗體的陽性率較非MP 感染組高（P＜0.01），見表1。PA 檢測(cè)MP 總抗體的陽性檢出率為74.39%（459/617），高于IFA 和GICT 檢測(cè)MP-IgM 抗體的陽性檢出率［分別為45.54%（281/617）和31.28%（193/617）］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=238.123，P＜0.01）。

Tab.1 Comparison of general data and MP results between the two groups of children表1 2組患兒一般資料及MP檢測(cè)結(jié)果比較

2.2 3種方法單獨(dú)及兩兩聯(lián)合檢測(cè)判斷結(jié)果 單獨(dú)檢測(cè)時(shí)，PA、IFA與臨床診斷一致性弱（Kappa值分別為0.37、0.33，P＜0.05），GICT 與臨床確診的一致性差（Kappa 值=0.17，P＜0.05）。PA 聯(lián)合 GICT、IFA 聯(lián)合GICT 均與臨床診斷一致性弱（Kappa 值分別為0.34、0.36，P＜0.05），PA聯(lián)合IFA與臨床診斷中度一致（Kappa 值=0.41，P＜0.05）。PA 和 IFA 聯(lián)合檢測(cè)時(shí)，2 例 2 種方法均陰性的 MP 感染患兒，GICT 結(jié)果為陽性。見表2。

Tab.2 Analysis of MP antibody results by three methods pairwise combination表2 3種方法兩兩聯(lián)合檢測(cè)判斷MP抗體結(jié)果分析（例）

2.3 ROC 曲線分析聯(lián)合檢測(cè)對(duì)MP 感染的診斷價(jià)值 3 種方法單獨(dú)檢測(cè)和兩兩聯(lián)合檢測(cè)中，PA 聯(lián)合IFA的AUC、敏感度、總符合率、陰性預(yù)測(cè)值最高，陰性似然比最低。GICT單獨(dú)檢測(cè)特異度最高。IFA單獨(dú)檢測(cè)陽性預(yù)測(cè)值和陽性似然比最高。見圖1、表3。

Fig.1 ROC curve analysis of the diagnostic value of the three methods alone and their pairwise combination for MP infection圖1 3種方法單獨(dú)檢測(cè)及兩兩聯(lián)合檢測(cè)診斷MP感染的ROC曲線

Tab.3 ROC analysis of the diagnostic value of the three methods for the diagnosis of MP infection表3 ROC分析3種方法單獨(dú)檢測(cè)及兩兩聯(lián)合檢測(cè)對(duì)MP感染診斷的診斷價(jià)值

2.4 PA聯(lián)合IFA檢測(cè)患兒MP抗體情況 當(dāng)IFA檢測(cè)MP-IgM抗體陽性時(shí)，MP感染組49例（23.44%）患兒 MP 總抗體滴度＜1∶160，非 MP 感染組 34 例（47.22%）MP 總抗體滴度≥1∶160。非MP 感染組MP總抗體滴度1∶40～1∶80、1∶160 患兒比例高于MP 感染組，總抗體滴度在1∶640和1∶1 280患兒比例低于MP 感染組（P＜0.05）。當(dāng)IFA 檢測(cè)MP-IgM 抗體陰性時(shí)，MP 感染組125 例（91.91%）患兒MP 總抗體滴度≥1∶160，非MP感染組147例（73.50%）患兒總抗體滴度＜1∶160。非MP感染組總抗體陰性和總抗體滴度1∶40～1∶80患兒比例高于MP感染組，滴度1∶640、1∶1 280 患兒比例低于MP 感染組（P＜0.01）。見表4、5。

Tab.4 Comparison of the titer of total MP antibody between the two groups when MP-IgM antibody was positive表4 2組MP-IgM抗體陽性時(shí)MP總抗體滴度比較 ［例（%）］

Tab.5 Comparison of the titer of total MP antibody between the two groups when MP-IgM antibody was negative表5 2組MP-IgM抗體陰性時(shí)MP總抗體滴度比較 ［例（%）］

3 討論

MP 感染難以通過臨床癥狀和體征與其他病原體感染鑒別，依靠胸片、CT 等影像學(xué)檢查也不能對(duì)早期MP感染做出準(zhǔn)確判斷［16］。由于該病易因誤診和漏診而致病情惡化，嚴(yán)重時(shí)可危及患兒生命［17-18］，因此MP 的早期實(shí)驗(yàn)室診斷對(duì)兒童MP 感染的診治具有重要意義。目前尚缺乏能夠可靠檢測(cè)MP 感染的單一方法［19］。專家共識(shí)推薦不同等級(jí)的病原學(xué)方法和血清學(xué)方法聯(lián)合檢測(cè)MP，依次推薦分子生物學(xué)RNA 檢測(cè)和PA 抗體滴度測(cè)定，分子生物學(xué)DNA 檢測(cè)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）抗體分型檢測(cè)，培養(yǎng)法或直接檢測(cè)法和IFA、GICT 及非特異性血清學(xué)檢測(cè)方法［9］。MP 的分離培養(yǎng)生長(zhǎng)緩慢、條件苛刻［18］，且容易被污染出現(xiàn)假陽性［20-21］，且MP 分子生物學(xué)檢測(cè)方法復(fù)雜，對(duì)實(shí)驗(yàn)室要求高，難以廣泛開展，而血清學(xué)試驗(yàn)操作簡(jiǎn)便快速，常被用于臨床診斷 MP［22-23］。

MP 感染后，體內(nèi)可產(chǎn)生特異性的IgM、IgA 和IgG抗體。IgM抗體一般在感染后4～5 d出現(xiàn)，3～4周達(dá)到高峰，2～3個(gè)月降至最低，可作為近期感染的診斷標(biāo)志［22，24-25］，但部分患兒在急性感染早期和再感染時(shí)血液中IgM抗體水平過低，無法檢測(cè)到。IgA抗體在 MP 感染早期迅速上升，7～14 d 達(dá)峰值，對(duì)兒童和成人 MP 均有診斷價(jià)值［26］。IgG 于感染后 14 d 升高，峰值一般在感染后5 周，恢復(fù)期的MP 感染患兒IgG水平高于急性期［27］。本研究PA檢測(cè)MP總抗體的陽性檢出率（74.39%），與杭州地區(qū)患兒的MP 總抗體檢出率（73.68%）［12］相近，GICT 檢測(cè)MP-IgM 抗體的陽性檢出率（31.28%）高于杭州地區(qū)（26.72%）。IFA 檢測(cè)MP-IgM 抗體的陽性檢出率（45.54%）高于北京地區(qū)（15.19%）和合肥地區(qū)（29.70%）［28-29］。本研究中 PA 的敏感度為 0.899，與李少麗等［21］對(duì)確診CAP的患兒進(jìn)行PA檢測(cè)的研究結(jié)果相近，但特異度低于該研究，可能與本研究納入的患兒以咳嗽、發(fā)熱、咽痛為標(biāo)準(zhǔn)，許多患兒可能處于感染早期，體內(nèi)抗體含量較低有關(guān)。急性期和恢復(fù)期（間隔2周）雙份血清MP總抗體水平呈4倍及以上變化時(shí)，可確診為MP感染［26，30］，但臨床上往往難以獲得恢復(fù)期的血清，因此采用PA 不能以MP 抗體單次陽性結(jié)果來確診MP感染。IFA敏感度為0.601，特異度為0.735，略低于國內(nèi)其他相關(guān)研究［31-32］，可能與個(gè)體、地域差異等因素有關(guān)，也可能與本研究的兒童處于感染初期，體內(nèi)IgM含量偏低有關(guān)。劉衛(wèi)萍等［33］發(fā)現(xiàn)，病程對(duì)IFA的陽性檢出率有影響，在MP感染后的3～4周IgM抗體達(dá)峰值時(shí)，IFA的陽性檢出率最高，結(jié)果最為準(zhǔn)確。

本研究中，3種方法單獨(dú)使用時(shí)，與臨床診斷結(jié)果的一致性均不強(qiáng)。因此，有必要選擇2 種方法結(jié)果進(jìn)行聯(lián)合判斷，盡可能提高與臨床診斷一致性。PA 和IFA 聯(lián)合檢測(cè)判斷結(jié)果與臨床診斷一致性最強(qiáng)，同時(shí)AUC、總符合率、陰性預(yù)測(cè)值均高于單獨(dú)檢測(cè)和其他兩兩聯(lián)合檢測(cè)，敏感度達(dá)0.994，陰性似然比最低。因此，PA 和IFA 聯(lián)合檢測(cè)有助于提高M(jìn)P感染診斷的敏感度及與臨床診斷的符合率，排除非MP 感染患兒。GICT 的特異度最高，但敏感度和陰性預(yù)測(cè)值均較其他2 種方法低，雖存在較高的漏診率，但因其檢測(cè)方便、快捷、取血量少，適合用于門急診定性篩查。本研究中PA和IFA聯(lián)合檢測(cè)時(shí)，2例2種方法均陰性的MP 感染患兒，GICT 結(jié)果為陽性。因此，采用GICT 時(shí)，對(duì)于檢測(cè)帶出現(xiàn)若隱若現(xiàn)的檢測(cè)線時(shí)，也應(yīng)果斷報(bào)告陽性；如檢測(cè)結(jié)果陰性時(shí)，臨床高度懷疑MP感染的患兒，需再進(jìn)一步采取其他檢測(cè)方法，結(jié)合臨床癥狀和影像學(xué)表現(xiàn)來判斷是否為MP感染，以免漏診。

PA 和IFA 聯(lián)合檢測(cè)判斷結(jié)果的敏感度高，但特異度較單獨(dú)使用PA或IFA進(jìn)行檢測(cè)時(shí)低。IFA陽性預(yù)測(cè)值和陽性似然比為3種方法單獨(dú)檢測(cè)或兩兩聯(lián)合檢測(cè)中最高的。因此，臨床判讀這2 種方法的結(jié)果時(shí)，可先觀察IFA 檢測(cè)MP-IgM 抗體的結(jié)果。當(dāng)MP-IgM 抗體陽性時(shí)，MP 感染組有23.44%的患兒MP總抗體＜1∶160，可能與患兒處于感染早期，機(jī)體迅速產(chǎn)生IgM，而IgG 尚未產(chǎn)生，未能達(dá)到試劑方法學(xué)判斷標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)；也可能與檢測(cè)方法的敏感度有關(guān)。目前共識(shí)認(rèn)為 PA 檢測(cè) MP 總抗體滴度≥1∶160 提示有近期或現(xiàn)癥感染［5］。研究顯示，有44.44%確診MP感染的成人早期的MP總抗體滴度未達(dá)該診斷標(biāo)準(zhǔn)，但有影像學(xué)表現(xiàn)和臨床癥狀，最終根據(jù)病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果被確診為MP 感染［16］。葛夢(mèng)蕾等［34］研究顯示，90.3%MP 總抗體＜1∶160 的 MP 肺炎患兒 MP-RNA檢測(cè)陽性。因此，對(duì)于MP-IgM 抗體陽性的患兒，若只考慮MP 總抗體滴度≥1∶160 的患兒有感染的可能，容易引起漏診。非MP感染組47.22%的患兒MP總抗體滴度≥1∶160，這部分患兒MP 總抗體中可能為IgG 抗體，為既往感染。因此，對(duì)于MP-IgM 抗體陽性的患兒，判讀MP總抗體滴度結(jié)果在診斷MP感染中的意義，需結(jié)合臨床癥狀和影像學(xué)表現(xiàn)，MP 總抗體滴度在1∶40～1∶80 或者陰性仍存在MP 感染的可能，需引起臨床醫(yī)師的注意，防止漏診和誤診。當(dāng)MP-IgM抗體陰性時(shí)，MP感染組有91.91%的患兒MP總抗體滴度≥1∶160，提示若臨床上只檢測(cè)MP-IgM，會(huì)造成部分感染者的漏診，血清特異性MP-IgM 陰性不能排除急性感染［35］；而非MP感染組患兒MP總抗體滴度＜1∶160 比例（73.50%）遠(yuǎn)高于MP 感染組（8.09%）。因此對(duì)于MP-IgM抗體陰性的患兒，需著重注意總抗體滴度≥1∶160的患兒MP感染的可能。

綜上所述，PA、IFA 和 GICT3 種方法檢測(cè) MP 抗體均存在一定的優(yōu)缺點(diǎn)。PA 和IFA 聯(lián)合檢測(cè)可為臨床提供更客觀、更準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果。