PI3K/AKT/mTOR信號通路參與脊髓損傷后神經(jīng)元自噬的研究進(jìn)展

孫瑞欣 ，趙帥帥 ，申宇哲，梁家興 ，楊彥玲△

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）通常會導(dǎo)致永久性的功能損害，其主要表現(xiàn)為炎癥加重、膠質(zhì)瘢痕和神經(jīng)元死亡。脊髓的原發(fā)性機(jī)械損傷會引發(fā)炎性細(xì)胞浸潤和小膠質(zhì)細(xì)胞激活等繼發(fā)性損傷［1］。研究顯示，世界各地的SCI 發(fā)病率為百萬分之三到萬分之二［2］，粗略估計我國每年大約有1萬人發(fā)生SCI［3］。目前，SCI 尚缺乏有效的治療方法。研究表明，抑制SCI 后大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡以及促進(jìn)自噬減少自噬小體的積累均可減少SCI后神經(jīng)元損傷并促進(jìn)運動功能的恢復(fù)［4］。SCI 后產(chǎn)生的炎癥相關(guān)細(xì)胞因子Toll樣受體（toll-like receptors，TLRs）和白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6是磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白（phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B/the mammalian target of rapamycin，PI3K/AKT/mTOR）信號通路的重要上游調(diào)節(jié)因子。PI3K/AKT/mTOR 信號通路是細(xì)胞響應(yīng)胰島素、胰島素樣生長因子1、成纖維細(xì)胞生長因子和表皮生長因子等細(xì)胞外刺激的主要細(xì)胞信號樞紐，參與細(xì)胞的營養(yǎng)吸收、合成代謝等多種過程，在細(xì)胞的存活、增殖、生長、代謝、轉(zhuǎn)移和血管生成等方面起著至關(guān)重要的作用［5］。目前，靶向調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR 信號通路對研究和治療SCI有較好的前景。本文綜述了PI3K/AKT/mTOR 信號通路在神經(jīng)元自噬過程中的作用機(jī)制及其對SCI 的調(diào)控作用，以期為相關(guān)研究提供新思路。

1 自噬

1.1 自噬概述 生物體需要通過不斷合成和降解物質(zhì)來維持自身內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，其中自噬發(fā)揮了重要的作用，它是一種細(xì)胞利用溶酶體將自身物質(zhì)降解，使之得以循環(huán)利用的現(xiàn)象。根據(jù)被降解的細(xì)胞內(nèi)容物運輸?shù)饺苊阁w方式的不同，自噬分為巨自噬、微自噬及分子伴侶介導(dǎo)的自噬（chaperone-mediated autophagy，CMA）［6］。巨自噬是主要的自噬形式，主要包括以下4個步驟：隔離膜或吞噬泡形成，吞入一部分細(xì)胞質(zhì)形成自噬體（雙層膜細(xì)胞器），外層自噬體膜和溶酶體融合，在自噬溶酶體內(nèi)溶酶體酶降解自噬體內(nèi)膜和細(xì)胞器［6-8］。巨自噬流（autophagic flux）是以上4個步驟在細(xì)胞內(nèi)不斷變化的一個動態(tài)過程，其中任何一個環(huán)節(jié)有偏差均會影響細(xì)胞的狀態(tài)，它不僅參與細(xì)胞代謝，還與蛋白代謝和蛋白毒性密切相關(guān)，適當(dāng)?shù)淖允蓵Ｗo(hù)細(xì)胞，防止代謝應(yīng)激和氧化損傷，但自噬過度可能導(dǎo)致代謝應(yīng)激、細(xì)胞成分降解，甚至細(xì)胞死亡［9］。微自噬是由溶酶體膜內(nèi)陷，直接吞噬細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物后進(jìn)行分裂降解的現(xiàn)象。CMA是一種選擇性的自噬，它需要分子伴侶的協(xié)助才能完成跨溶酶體膜的轉(zhuǎn)運。

1.2 神經(jīng)元自噬標(biāo)志物 自噬相關(guān)蛋白（autophagy-related protein，Atg）參與調(diào)節(jié)自噬的誘導(dǎo)、起始、延伸以及自噬體的降解等過程。哺乳動物Beclin1基因與酵母Atg6基因同源，在3-磷酸磷脂酰肌醇單磷酸（phosphatidylinositol 3-phosphate，PI3P）的生成過程中起重要作用，而PI3P 可以募集其他Atg 并結(jié)合到早期隔離膜或吞噬泡上，表明Beclin1在自噬和溶酶體的轉(zhuǎn)運中起重要作用［10］。PI3P 的作用是與Ⅲ類PI3K結(jié)合，參與自噬早期的前雙層膜形成，從而啟動自噬［11］。目前，研究最廣泛的自噬分子標(biāo)志物為Atg8/微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（microtubuleassociated protein1 light chain 3，LC3），在自噬進(jìn)展的過程中起重要作用，當(dāng)自噬被誘導(dǎo)時，胞質(zhì)可溶的LC3-Ⅰ與自噬體膜上的磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）結(jié)合后，在自噬體膜上轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅱ；在自噬溶酶體的形成過程中，LC3-Ⅱ逐漸被降解清除，因此，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ與自噬體的數(shù)量呈正相關(guān)，常被視為自噬形成的標(biāo)志，也可以用來監(jiān)測自噬的進(jìn)程［9,12］。選擇性自噬體膜受體蛋白（sequestosome-1，SQSTM1）也叫p62 蛋白，它在所有組織中均有表達(dá)并且廣泛分布于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體、自噬體和溶酶體中，可識別泛素化的錯誤折疊蛋白和受損的細(xì)胞器，當(dāng)這些泛素化的錯誤折疊蛋白和受損的細(xì)胞器被p62 識別后，通過LC3-Ⅱ的招募，和p62 一起被轉(zhuǎn)運至自噬溶酶體并降解［4，13］。因此，可以通過p62、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ以及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ來判斷自噬溶酶體的活性和自噬通量的強(qiáng)度［12，14］。

2 PI3K/AKT/mTOR信號通路

近年來研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制PI3K/AKT/mTOR 信號通路可以激活神經(jīng)元自噬，促進(jìn)SCI后神經(jīng)元的修復(fù)［15］。PI3K分子可被生長因子激活而磷酸化。目前，根據(jù)結(jié)構(gòu)、功能和底物偏好不同，PI3K可分為3類：Ⅰ類 PI3K 接受酪氨酸激酶（receptor tyrosinekinase，RTK）和G 蛋白偶聯(lián)受體（guanosine-binding protein coupled receptor，GPCR）的信號后，可催化磷脂酰肌醇二磷酸（phosphatidylinositol bisphosphate，PIP2）生成磷脂酰肌醇三磷酸（phosphatidylinositol trisphosphate，PIP3），然后PIP3 進(jìn)一步激活A(yù)KT（又稱蛋白激酶 B；protein kinase B，PKB）［16-17］，PI3K/AKT通路特指Ⅰ類PI3K；Ⅱ類PI3K可能影響葡萄糖轉(zhuǎn)運、細(xì)胞遷移、膜轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)、胰島素信號傳導(dǎo)和受體 內(nèi) 化 ，還 可 磷 酸 化 磷 脂 酰 肌 醇（phosphatidylinositol，PI），但不磷酸化 PIP2；Ⅲ類PI3K目前己知的只有一種，被認(rèn)為可以控制溶酶體成熟、自噬流和胞質(zhì)分裂等多種膜轉(zhuǎn)運功能，激活Ⅲ類PI3K可以促進(jìn)自噬，能使PI磷酸化為PI3P［5，16，18］。

磷酸酶和張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homologue，PTEN）是 PI3K 的拮抗劑，可以將PIP3脫磷酸化變?yōu)镻IP2，抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路的啟動［19］。AKT 是一種細(xì)胞內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其PH結(jié)構(gòu)域為存在于多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和細(xì)胞骨架蛋白中的大約由120個氨基酸組成的功能性區(qū)域，可以與Ⅰ類PI3K 產(chǎn)生的PIP2 和PIP3 相互作用，使AKT 從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到胞膜并被激活，啟動PI3K/AKT/mTOR 通路，進(jìn)而激活mTOR，抑制自噬［18,20］。PI3K/AKT/mTOR途徑是mTOR活化和發(fā)揮功能的主要途徑之一［21-22］。mTOR 通過與 mTOR 復(fù)合物（mTOR Complex，mTORC）1 和 mTORC2 的關(guān)鍵組分如雷帕霉素靶向蛋白調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白（regulatoryassociated protein of mammalian target of rapamycin，Raptor）、雷帕霉素不敏感伴隨物（rapamycininsensitive companion of mTOR，Rictor）、哺乳動物致死性 SEC13 蛋白 8（mammalian lethal SEC13 protein 8，mLST8）和哺乳動物應(yīng)激激活的蛋白激酶反應(yīng)蛋白 1（mammalian stress-activated protein kinase interacting protein，mSIN1）作用，催化 S6 激酶（S6 kinase beta-1，S6K1）、真核細(xì)胞起始因子4E（eIF4E）結(jié)合蛋白1（eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1，4E-BP1）和自噬啟動蛋白1（unc-51-like kinase 1，ULK1）等多個靶標(biāo)的磷酸化，從而調(diào)節(jié)蛋白合成、營養(yǎng)代謝、生長因子信號傳導(dǎo)、細(xì)胞生長和遷移以及自噬調(diào)節(jié)等，其中ULK1 還可以和其互作蛋白Atg13 和Atg101 等形成自噬調(diào)節(jié)復(fù)合物［23-24］。mTORC1 可調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞的生長、增殖、代謝以及應(yīng)激反應(yīng)，mTORC1 中富含AKT的底物，當(dāng)PI3K/AKT被激活時，mTORC1活化，通過磷酸化下游效應(yīng)因子S6K1 和4E-BP1 來促進(jìn)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核苷酸的合成代謝過程，同時，通過ULK1抑制分解代謝程序，使自噬調(diào)節(jié)復(fù)合物失活，從而抑制自噬；mTORC2 可以調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和肌動蛋白細(xì)胞骨架的重新排列，它通過mSIN1 和AKT 形成一個正反饋環(huán)路，即AKT 的部分激活促進(jìn)mTORC2 的激活，而mTORC2 磷酸化并完全激活A(yù)KT，被激活的AKT 可以通過磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（phosphoinositide-dependent protein kinase-1，PDK1）將AKT 的第308 位的蘇氨酸磷酸化，促進(jìn)細(xì)胞存活［23，25-26］。

3 PI3K/AKT/mTOR 信號通路與自噬在SCI 修復(fù)中的作用

PI3K/AKT/mTOR 信號通路是一個經(jīng)典的自噬激活途徑。研究顯示，褪黑素（melatonin，MT）通過抑制PI3K/AKT/mTOR 信號通路，在急性SCI 后第7天降低了凋亡激活蛋白（活性Caspase-3 和活性Caspase-9）的表達(dá)和凋亡神經(jīng)元的數(shù)量，而增加了自噬激活蛋白（LC3 和Beclin-1）的表達(dá)和神經(jīng)元的數(shù)量，在大鼠SCI 后第7 天開始改善運動功能障礙［27］。然而，過度的自噬可能會導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)自噬過度時，可通過激活PI3K/AKT/mTOR 通路來抑制過度自噬，從而促進(jìn)神經(jīng)元的存活［28］。

3.1 對自噬流的調(diào)節(jié) 由于繼發(fā)性損傷是SCI后加重的主要因素，自噬在繼發(fā)性損傷過程中的作用也各不相同，但越來越多的證據(jù)表明自噬在SCI 中的作用大多是有益的［29］。由于自噬功能的實現(xiàn)取決于自噬流，在大多數(shù)SCI 中的自噬流受到抑制的情況下，自噬有可能導(dǎo)致神經(jīng)元死亡并加劇炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和微循環(huán)障礙［30］。Li 等［31］研究發(fā)現(xiàn)，SCI 模型大鼠在經(jīng)過姜黃素治療后，膠質(zhì)瘢痕形成和炎癥反應(yīng)減輕，脊髓髓鞘形成改善，并且姜黃素可以促進(jìn)SCI 后自噬流的誘導(dǎo)，抑制AKT/mTOR 信號通路的激活，這表明姜黃素可以通過抑制AKT/mTOR 途徑來誘導(dǎo)自噬，促進(jìn)自噬流量恢復(fù)，從而促進(jìn)SCI后的運動功能恢復(fù)，減少神經(jīng)元凋亡。有研究對SCI 模型兔行減壓手術(shù)后發(fā)現(xiàn)，兔的運動功能有恢復(fù)趨勢，并且逆轉(zhuǎn)了SCI 引起的p-PI3K、p-AKT 和p-mTOR蛋白的上調(diào)，AKT/mTOR通過調(diào)節(jié)自噬流，促進(jìn)了自噬體膜上LC3 Ⅱ的生成，并在自噬溶酶體形成后促進(jìn)了LC3-Ⅱ和p62 降解，從而恢復(fù)了自噬流以減輕神經(jīng)元凋亡，促進(jìn)了SCI后的恢復(fù)［32］。

3.2 調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 目前，對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的研究也是一大重點，SCI后導(dǎo)致的持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激超過未折疊蛋白反應(yīng)的補(bǔ)償，往往會對神經(jīng)元產(chǎn)生不利影響。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬之間存在著一定的關(guān)系。Wang等［33］用神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞建立SCI 模型，發(fā)現(xiàn)4-苯基丁酸（4-Phenylbutyric acid，4-PBA）可 以 通 過 PI3K/AKT/mTOR 信號通路抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而負(fù)向調(diào)控自噬；當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制該通路時，NGF 誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞機(jī)械損傷早期會增加細(xì)胞自噬和減少細(xì)胞凋亡，證實了通過該通路抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可增加自噬，這為SCI的治療提供了新的思路。

3.3 抑制神經(jīng)元凋亡 神經(jīng)元凋亡可導(dǎo)致瘢痕形成、組織損傷和運動功能障礙等。Li等［27］研究顯示，MT可增加自噬激活蛋白的表達(dá)，降低SCI后神經(jīng)元凋亡激活蛋白的表達(dá)水平，改善SCI后第7天大鼠的運動功能，MT 可通過抑制PI3K/AKT/mTOR 信號通路增強(qiáng)神經(jīng)元自噬，抑制細(xì)胞凋亡來改善運動功能障礙。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）鋅指蛋白反義鏈 1（ZNFX1-antisence 1，ZFAS1）是一種競爭性內(nèi)源性RNA，可與共享的非編碼小分子RNA（microRNAs，miRNAs）結(jié)合，從而調(diào)節(jié)信使 RNA（mRNAs）的表達(dá)。Chen 等［34］發(fā)現(xiàn)，在SCI 小鼠的脊髓組織中ZFAS1表達(dá)上調(diào)，而miR-1953 表達(dá)下調(diào)；PTEN 是 miR-1953 的一個潛在靶點，miR-1953 可以通過靶向 PTEN 的 3'UTR 負(fù)調(diào)控PTEN的表達(dá)；與SCI小鼠相比，敲除ZFAS1的SCI小鼠miR-1953 表達(dá)水平升高，運動功能改善，促炎因子水平降低，脊髓神經(jīng)元的凋亡減少；與僅敲除ZFAS1的 SCI 小鼠相比，同時抑制 miR-1953 或同時過表達(dá)PTEN后，消除了敲除ZFAS1對SCI小鼠脊髓神經(jīng)元凋亡和炎癥的抑制作用；該研究認(rèn)為ZFAS1可通過與miR-1953 結(jié)合，調(diào)節(jié)PTEN/PI3K/AKT 通路，抑制脊髓神經(jīng)元的凋亡，并促進(jìn)SCI的恢復(fù)。另有研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)械損傷后脊髓神經(jīng)元中的AKT 快速增加，mTOR 的磷酸化水平快速上調(diào)，從而抑制了PI3K/AKT/mTOR 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，增加了自噬水平，使線粒體膜電位降低，細(xì)胞凋亡減少，表明PI3K/AKT/mTOR 信號通路還可以通過調(diào)控自噬來調(diào)節(jié)SCI后的線粒體凋亡，從而促進(jìn)神經(jīng)恢復(fù)［15］。

3.4 抗炎癥反應(yīng) 自噬過程中的LC3、Beclin-1 蛋白以及凋亡反應(yīng)中的Caspases家族、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和B淋巴細(xì)胞瘤-2 家族（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）蛋白通過 PI3K/AKT/mTOR 信號通路參與炎癥反應(yīng)［35］。Zhang 等［36］對SCI 后SD 大鼠尾靜脈注射外周巨噬細(xì)胞衍生的外泌體（peripheral macrophages-derived exosomes，PM-Exos）發(fā)現(xiàn)，PM-Exos 組脊髓功能和恢復(fù)情況優(yōu)于注射相同劑量磷酸鹽緩沖溶液的對照組，并且其機(jī)制的關(guān)鍵因素是通過下調(diào)PI3K/AKT/mTOR 信號通路來激活和促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞自噬，從而增加抗炎型小膠質(zhì)細(xì)胞極化，刺激局部小膠質(zhì)細(xì)胞的抗炎特性，發(fā)揮對SCI的保護(hù)作用。

3.5 促進(jìn)髓鞘再形成 SCI后運動和生理功能障礙的一大原因是軸突脫髓鞘，導(dǎo)致軸突延長障礙并且備用回路減少，而少突膠質(zhì)細(xì)胞最突出的生理功能是在神經(jīng)元周圍形成緊密的髓鞘。因此，少突膠質(zhì)細(xì)胞的變性是SCI脫髓鞘和軸突功能障礙的主要因素 。 Ding 等［37］研 究 證 實 ，神 經(jīng) 調(diào) 節(jié) 蛋 白 -1（neuregulin，Nrg1）可以通過激活反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞表面的表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）從而增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)轉(zhuǎn)導(dǎo)的PI3K/AKT/mTOR 通路功能，促進(jìn)髓鞘和少突膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，從而將反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為少突膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞，促進(jìn)SCI 的修復(fù)。Liu等［38］研究證實，雷帕霉素干預(yù)SCI小鼠后自噬增強(qiáng)，促使 SCI 后 Beclin-1、LC3 表達(dá)升高，p62 表達(dá)降低，并增加了脊髓白質(zhì)的完整性，減少了膠質(zhì)瘢痕的形成和脊髓組織的損失，增加了SCI 后小鼠軸突和雪旺細(xì)胞相關(guān)髓鞘的數(shù)量，使小鼠運動功能得到改善，并降低了小鼠體質(zhì)量，雷帕霉素可以通過抑制mTOR和增強(qiáng)自噬來減輕SCI后的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞的恢復(fù)和髓鞘的形成，限制軸突變性。

3.6 促進(jìn)軸突再生 Chen 等［39］研究發(fā)現(xiàn)，SCI 急性期至亞急性期星形膠質(zhì)細(xì)胞PI3K/AKT/mTOR 通路被激活并可能參與了膠質(zhì)瘢痕的形成；SCI 后PTEN的過表達(dá)下調(diào)了硫酸軟骨素蛋白多糖（chondroitin sulfate proteoglycans，CSPGs）的表達(dá)水平，改善了損傷部位的軸突再生，腺病毒載體過表達(dá)PTEN 可減輕膠質(zhì)細(xì)胞增生，減少脊髓中神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕的形成，改善 SCI 后的運動功能。Yin 等［40］證實，miR-29a 可降低PTEN表達(dá)，促進(jìn)AKT磷酸化，提高軸突的生長能力，過表達(dá)miR-29a 則可增加AKT 和通路下游次級結(jié)合蛋白S6 磷酸化，促進(jìn)軸突再生相關(guān)關(guān)鍵標(biāo)記蛋白neurofiament-200 的表達(dá)，從而促進(jìn)損傷中心的軸突再生和突觸形成，并最終促進(jìn)運動功能的恢復(fù)。

4 小結(jié)

目前，自噬在SCI 后繼發(fā)性損傷的作用機(jī)制仍缺乏廣泛的研究。自噬在神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞中均發(fā)揮了重要作用。SCI 后PI3K/AKT/mTOR 信號通路被過度激活，導(dǎo)致自噬受到抑制，加重了錯誤折疊蛋白和炎性因子等的蓄積，而且神經(jīng)元損傷后的自我修復(fù)能力非常微弱。PI3K/AKT/mTOR 作為自噬的經(jīng)典信號通路之一，可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元生長和分化的信號并啟動自噬相關(guān)基因，抑制該通路可以增加Beclin1蛋白等的表達(dá)，從而激活神經(jīng)元自噬，調(diào)節(jié)神經(jīng)元分化與增殖、減輕炎癥和抑制神經(jīng)元凋亡，促進(jìn)脊髓損傷后神經(jīng)元修復(fù)，從而能在一定程度上減輕病情。