家蠶狹胸(narrow breast, nb)突變性狀觀察及基因的精細(xì)定位

劉品彥 劉茹鳳 叢江珊 劉 春

(1.家蠶基因組生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蠶桑生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400716)

家蠶是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，又是遺傳學(xué)研究的良好材料。早在5000年前，人們就開始馴養(yǎng)家蠶。如果從1906年由日本遺傳學(xué)家外山龜太郎開展蠶絲性狀及形態(tài)突變的研究算起，至今家蠶遺傳學(xué)研究歷史已逾100年，并取得了豐碩的成果。全世界保存了大約1000種左右的突變體，其中西南大學(xué)家蠶基因資源庫保存了約有600份突變體。28個(gè)連鎖群現(xiàn)已全部發(fā)現(xiàn)，到2005年發(fā)表最新的經(jīng)典遺傳圖譜上共有246個(gè)形態(tài)和生化標(biāo)記，其中有196個(gè)已經(jīng)被定位在每個(gè)連鎖群上具體的座位上[1]，其它的分子圖譜也在20世紀(jì)90年代紛紛完成[2-5]。特別是到了21世紀(jì)，BAC文庫、EST文庫、家蠶基因組計(jì)劃、SNP連鎖圖譜相繼實(shí)施及完成[6-11]，為利用定位克隆的手段開展家蠶突變體分子遺傳研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。從2008年3月報(bào)道的第一個(gè)利用定位克隆闡明無翅(fl)突變機(jī)理[12]到現(xiàn)在，已經(jīng)有包括nsd-2、ow、od、bts、C、sch、mln、cts等突變種通過定位克隆的手段闡明了突變的分子機(jī)理[13-21]。

狹胸(narrowbreast,nb)突變種屬家蠶的自然突變，最早于1953年由日本學(xué)者筑紫發(fā)現(xiàn)，該突變?yōu)殡[性突變，幼蟲胸部狹窄，腹部肥大，近紡錐形，手觸松弛。該突變位于家蠶經(jīng)典遺傳連鎖圖中第19連鎖群19-31.2座位上，該連鎖群上還有Pes(19-0.0)、Gl(19-19.2)、Ict-D(19-29.1)、Alb(19-37.4)、msn(19-45.8)5個(gè)已定位標(biāo)記和4個(gè)未定位標(biāo)記。該突變是少數(shù)幾個(gè)關(guān)于家蠶形體的突變體，但其突變基因還未被分離克隆，其突變機(jī)理未知。為此，本研究首先對其突變性狀進(jìn)行了觀察，并利用SNP標(biāo)記對突變基因進(jìn)行了精細(xì)定位，為分離和克隆突變基因奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)選取西南大學(xué)家蠶基因庫系統(tǒng)編號為18-110的nb突變種及大造作為材料，常規(guī)桑葉飼育。以nb及大造作為親本，F(xiàn)1雄個(gè)體與nb雌個(gè)體回交后，根據(jù)突變表型對BC1代回交群體進(jìn)行單個(gè)樣品收集，液氮速凍后提取基因組DNA進(jìn)行連鎖分析。

1.2 外部形態(tài)及內(nèi)部器官觀察

分別選取健康而且大小適中5齡第3d和5齡第7d的nb/nb，nb/+進(jìn)行觀察拍照。取健康而且大小適中5齡5d家蠶大造和nb，從背部解剖，保持消化道的整體完整性，對位于胸部的消化道進(jìn)行形態(tài)觀察拍照。

1.3 基因組的提取

本實(shí)驗(yàn)中使用的親本P代及F1代基因組利用DNAzol試劑(Roche公司)提取，回交群體基因組利用高通量的核酸自動(dòng)抽提儀(Kurobo-PI1200，日本)進(jìn)行提取。操作方法按試劑盒說明書和儀器說明書進(jìn)行。提取的基因組DNA利用家蠶看家基因rpl3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測基因組質(zhì)量。在抽檢的樣品中其出帶的比例達(dá)95%以上表明基因組DNA質(zhì)量可用于后續(xù)工作。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性10 sec，55℃退火15 sec，72℃延伸30 sec，30個(gè)循環(huán)，72℃ 7 min，4℃保存。

1.4 SNP標(biāo)記引物及SNP位點(diǎn)鑒定

本實(shí)驗(yàn)主要利用SNP標(biāo)記對nb突變基因進(jìn)行精細(xì)定位，其SNP標(biāo)記的引物序列主要根據(jù)Yamamoto[10]等人2008年公布的家蠶SNP圖譜中引物信息。利用親本基因組DNA 作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測后進(jìn)行PCR產(chǎn)物測序，其測序方法如下：首先使用SAP酶(TaKaRa公司)及Exonuclease I對PCR產(chǎn)物進(jìn)行消化，反應(yīng)條件：37℃ 20 min，80℃ 30 min。然后進(jìn)行測序PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件：96℃ 1 min， 96℃ 10 sec，50℃ 5 sec，60℃ 4 min，25個(gè)循環(huán)，4℃保溫。最后使用乙醇醋酸鈉沉淀法對測序樣品進(jìn)行純化。使用HITACHI3730測序儀進(jìn)行測序分析。

表1 SNP標(biāo)記引物

續(xù)表1 SNP標(biāo)記引物

1.5 擴(kuò)增產(chǎn)物的SNP位點(diǎn)查找

1.6 連鎖分析

在構(gòu)建連鎖圖譜時(shí)，把nb表型的個(gè)體標(biāo)記為A，正常表型的個(gè)體標(biāo)記為H，親本大造在SNP位點(diǎn)表型標(biāo)記為B，親本nb在SNP位點(diǎn)的表型標(biāo)記為A，F(xiàn)1在SNP位點(diǎn)的雜合型標(biāo)記為H，后面BC1的SNP位點(diǎn)表型也根據(jù)以上方法進(jìn)行標(biāo)記，統(tǒng)計(jì)結(jié)果整理放入Excel表格。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

2.1 nb突變體表型觀察

對不同發(fā)育時(shí)期的nb表型進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)在幼蟲期的3齡末期即可從外觀體型上區(qū)分nb突變種和正常個(gè)體(nb/+)，從4眠開始正常個(gè)體和nb突變種間的體型差異開始明顯，到5齡后期，nb突變種表型明顯，胸部與身體的比例變小，胸部縮小，腹部膨大，導(dǎo)致nb突變種的整體呈紡錘體形，這種明顯的體型差異一直持續(xù)到蛹期(圖1)。對其體長和體重進(jìn)行測定，表明體重基本沒有差別，但是nb的體長短于正常個(gè)體。

圖1 nb/+和nb/nb基因型幼蟲期及蛹期的身體形態(tài)觀察

2.2 前腸形態(tài)觀察

因nb的表型差異主要出現(xiàn)在胸部，該區(qū)域主要包含較大的消化器官。為了觀察該區(qū)域的消化器官是否有異常，因此，本實(shí)驗(yàn)對5齡5d正常食桑的正常表現(xiàn)及突變表型的回交個(gè)體進(jìn)行解剖觀察。結(jié)果表明，正常個(gè)體的前腸部分在食道區(qū)域充滿了桑葉碎片，與后面的中腸連接呈現(xiàn)漏斗狀，其形態(tài)是逐漸增大的過程。而在突變表型個(gè)體中，食道處未被桑葉碎片充盈且收縮，后面直接與膨大的中腸相連接 (圖2)，這可能是引起nb胸部狹小的形態(tài)原因。

圖2 nb和大造食道比較

2.3 低密度連鎖圖譜的構(gòu)建

雖然在形態(tài)上已經(jīng)看到了差異，但nb突變基因卻未知，為此，本實(shí)驗(yàn)利用定位克隆方法對nb突變基因進(jìn)行了連鎖定位。本研究利用大造和nb為親本構(gòu)建BC1群體用于開展定位克隆，設(shè)計(jì)了27對引物用于初定位，其中包括21對SNP引物和6對SSR引物。經(jīng)過篩選，我們獲得了可用于定位的標(biāo)記10個(gè)。利用這些標(biāo)記和92個(gè)BC1代個(gè)體構(gòu)建了低密度連鎖圖譜，該圖譜包含40個(gè)交換個(gè)體。通過分析，我們把nb鎖定在標(biāo)記3和8之間，這兩個(gè)標(biāo)記的遺傳距離為7.8cM，物理距離約為1.7Mb。

2.4 高密度連鎖圖譜的構(gòu)建

然后，我們利用初定位標(biāo)記3和8從1794個(gè)BC1代個(gè)體中篩選得到67個(gè)交換個(gè)體。隨后，我們新設(shè)計(jì)了15對用于精細(xì)定位的SNP引物，經(jīng)過篩選，獲得了13個(gè)可用于定位標(biāo)記。利用9個(gè)標(biāo)記和67個(gè)交換個(gè)體構(gòu)建了高密度連鎖圖譜，該圖譜包含了8個(gè)標(biāo)記，54個(gè)交換個(gè)體。通過分析，我們把nb鎖定在標(biāo)記31和38之間區(qū)域，該區(qū)域物理距離約為1Mb(圖3)。通過對定位區(qū)域進(jìn)行基因預(yù)測，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域內(nèi)含有44個(gè)基因。結(jié)合低密度連鎖圖譜及高密度連鎖圖譜，繪制nb的定位連鎖示意圖(圖4)。

3 討論

nb突變體是家蠶少數(shù)的體型突變體之一，由于其突變基因未被分離克隆，其突變機(jī)理未知。本研究為了揭示其突變機(jī)理，本研究首先對其突變形態(tài)進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)nb在食道處與正常相比存在差異；對其進(jìn)行定位克隆，將其突變基因鎖定在1Mb的范圍內(nèi)，該研究為nb突變基因的分離克隆奠定了基礎(chǔ)。

圖4 nb定位連鎖示意圖

本研究的一個(gè)新的發(fā)現(xiàn)是nb的前腸部分與正常相比有差異，推測該形態(tài)變化是導(dǎo)致其表型出現(xiàn)胸部狹小的主要原因。由于家蠶的體型主要受外骨骼及內(nèi)部器官的形態(tài)而決定，nb蠶與正常相比表現(xiàn)為胸部狹小，腹部膨大。對其胸部的前腸器官進(jìn)行解剖觀察，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域在nb中，其前腸在食道處縊縮，與其緊密連接的中腸迅速膨大。正常表型個(gè)體只在咽喉部縊縮，在食道處呈現(xiàn)漏斗狀的膨大形狀。我們推測，這樣的前腸形態(tài)導(dǎo)致nb的梭形體型。由于前腸壁有大量的肌肉組織，是否這些肌肉組織發(fā)育異常導(dǎo)致其形態(tài)的變化特征還有待進(jìn)一步研究。

同時(shí)，本研究以大造和nb為親本配置BC1代定位群體。利用92個(gè)BC1代個(gè)體和10個(gè)標(biāo)記構(gòu)建了低密度連鎖圖譜，把nb相關(guān)基因鎖定在1.7Mb的區(qū)域內(nèi)。進(jìn)一步利用1794個(gè)BC1代個(gè)體和8個(gè)標(biāo)記構(gòu)建了高密度連鎖圖譜，把nb相關(guān)基因鎖定在1Mb的區(qū)域內(nèi)。對定位區(qū)域進(jìn)行基因預(yù)測發(fā)現(xiàn)含有44個(gè)基因。初步的基因注釋分析發(fā)現(xiàn)，在這些預(yù)測基因中，有11個(gè)表皮基因，其中一個(gè)編號為BGIBMGA001945含有Tsg結(jié)構(gòu)功能域，該基因和果蠅的cv基因具有很高的相似性。cv基因具有調(diào)控果蠅成蟲跳躍肌(TDT)肌纖維數(shù)量的功能[22-24]，在后期的研究中，該基因?qū)⒆鳛閚b的主要候選基因進(jìn)行深入的研究。