貂源銅綠假單胞菌耐藥性及生物學(xué)特性

張明亮，張淼丹，閆新武，孫長江，顧敬敏，崔子寅，韓文瑜

(1.安陽工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，河南 安陽 455000； 2.吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062；3.河南省動物疫病防控與營養(yǎng)免疫院士工作站，河南 安陽 455000； 4.洛陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 洛陽 471000；5.河南省孟津縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南 孟津 471100)

銅綠假單胞菌是常見的革蘭氏陰性桿菌，廣泛分布于自然環(huán)境中，是醫(yī)院常見的獲得性感染病原菌[1]。它作為一種常見的條件致病菌，能夠在宿主免疫力低下時，長期誘導(dǎo)宿主發(fā)生感染，例如能引起囊性纖維化病人、燒傷病人、癌癥病人、艾滋病病人等的長期慢性感染[2]。同時，銅綠假單胞菌也能感染動物，例如水貂、貉子、狐貍、貓等，是一種能給公共衛(wèi)生帶來很大風(fēng)險的病原菌[3-4]。

水貂是重要的毛皮動物，在特種經(jīng)濟動物養(yǎng)殖業(yè)中占有重要的地位。水貂出血性肺炎是由銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)引起的以患病貂突然死亡、鼻孔及嘴角流血為主要特征的水貂烈性傳染病[5]。水貂出血性肺炎給全球的水貂養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失，研究者于1953年首次確認該病的病原是銅綠假單胞菌[6]。水貂出血性肺炎的暴發(fā)具有季節(jié)性，于每年的9月至11月呈暴發(fā)式流行，造成的死亡率可以達到50%[7]。長期以來，抗生素是人類對抗細菌性感染的有力武器，β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類和氟喹諾酮類抗生素是臨床中防控銅綠假單胞菌的主要抗生素。但隨著臨床抗生素的濫用，銅綠假單胞菌耐藥率呈現(xiàn)出日漸升高的趨勢。本研究從水貂出血性肺炎病料中分離鑒定出20株銅綠假單胞菌，并對其耐藥性及生物學(xué)特性進行分析，以期為水貂出血性肺炎臨床治療及相關(guān)生物制品的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒及試劑 20株疑似貂源銅綠假單胞菌、大腸桿菌克隆菌株DH5α均由吉林大學(xué)微生物與免疫學(xué)實驗室保存；銅綠假單胞菌標準菌株ATCC27853購自中國獸藥監(jiān)察所；PremixTaq，DL2000 DNA Marker、pMD18-T克隆載體購自TaKaRa公司；溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司，所有供試培養(yǎng)基根據(jù)需要加入質(zhì)量濃度為100 μg/mL的氨芐青霉素(Amp)。

1.1.2 供試動物 6周齡體質(zhì)量為(20±2)g的雌性清潔級昆明小鼠購自吉林大學(xué)實驗動物中心。

1.1.3 引物的合成 參照GenBank公布的16S rRNA基因序列(GenBank：KT031989.1)合成引物L(fēng)J1/LJ2；參照GenBank公布的PAToxA基因序列(GenBank：JX026663.1)合成引物L(fēng)D1/LD2。所需引物均由北京華大基因研究中心合成(表1)。

表1 PCR擴增引物序列Tab.1 The primer sequences for PCR amplification

1.2 試驗方法

1.2.1 銅綠假單胞菌的模板DNA制備 取保存的銅綠假單胞菌菌種劃線接種溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察并挑取優(yōu)勢菌落進行傳代，進一步培養(yǎng)純化。利用煮沸法提取銅綠假單胞菌的基因組DNA：取過夜培養(yǎng)的銅綠假單胞菌菌液200 μL，12 000 r/min離心2 min，棄上清，加100 μL ddH2O，以相同的轉(zhuǎn)速離心后棄上清，再加80 μL ddH2O，沸水煮10 min，離心取上清，置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 銅綠假單胞菌分離株的生化鑒定 參照國標《實驗動物 綠膿桿菌檢測方法》(GB/T 14926.17—2001)對所分離的疑似銅綠假單胞菌菌株進行生化鑒定[8]。

1.2.3 銅綠假單胞菌分離株的PCR鑒定 16S rRNA基因序列擴增體系20 μL：PremixTaq10 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板DNA 1 μL，用ddH2O補平至20 μL。PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性94 ℃ 4 min;94 ℃ 40 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，29個循環(huán)；終末延伸72 ℃ 10 min。對PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。將擴增片段克隆至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，進行測序鑒定。

1.2.4 銅綠假單胞菌分離株的血清型鑒定 采用玻片凝集法對所分離的銅綠假單胞菌株進行血清型分型。

1.2.5 銅綠假單胞菌分離株的耐藥性分析 選用氨基糖苷類、多黏菌素類、β-內(nèi)酰胺類、氯霉素類、喹諾酮類和四環(huán)素類共6類抗生素中的阿米卡星(AMI)、慶大霉素(GEN)、妥布霉素(TOB)、多黏菌素B(PB)、氨芐西林(AMP)、氨曲南(AZT)、頭孢呋辛(CEFU)、頭孢哌酮(CEFO)、頭孢吡肟(CEF)、頭孢曲松(CRO)、頭孢噻吩(CEP)、頭孢噻肟(CTX)、頭孢他啶(FOR)、頭孢西丁(MEF)、頭孢唑林(CFZ)、哌拉西林(PIP)、氯霉素(CHL)、洛美沙星(LOM)、環(huán)丙沙星(CIP)、四環(huán)素(TET)共20種藥敏紙片，對所分離的銅綠假單胞菌進行耐藥性檢測。采用K-B擴散法進行藥敏試驗，參照美國《抗菌藥物敏感性試驗執(zhí)行標準》的判定標準進行藥敏結(jié)果判斷[9]。

1.2.6 銅綠假單胞菌分離株的產(chǎn)毒素A基因及產(chǎn)色素鑒定 無菌挑取所分離的20株銅綠假單胞菌的單菌落，接種于液體LB培養(yǎng)中，37 ℃培養(yǎng)12 h，參照1.2.1中的方法提取各分離株的基因組DNA。采用引物L(fēng)D1/LD2鑒定所分離的銅綠假單胞菌株是否產(chǎn)生毒素A(ToxA)基因。反應(yīng)程序：預(yù)變性94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，30個循環(huán)；終末延伸72 ℃ 10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，進行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果并拍照。將20株銅綠假單胞菌轉(zhuǎn)接于液體LB培養(yǎng)中，37 ℃培養(yǎng)12 h，觀察銅綠假單胞菌的產(chǎn)色素情況。

1.2.7 銅綠假單胞菌分離株的強毒株篩選 將42只20 g左右的昆明小鼠隨機分為21組并編號。將20株銅綠假單胞菌轉(zhuǎn)接于液體LB培養(yǎng)中，37 ℃培養(yǎng)12 h，分別調(diào)整菌液濃度為1×107cfu/mL，將調(diào)整好的菌液注射0.1 mL(含1×106cfu的銅綠假單胞菌)于小鼠腹腔，觀察7 d。

1.2.8 銅綠假單胞菌分離株ZHDL9感染小鼠后的毒力檢測 將銅綠假單胞菌分離株ZHDL9轉(zhuǎn)接于液體LB培養(yǎng)中，37 ℃培養(yǎng)12 h，調(diào)整菌液濃度為5×1010cfu/mL。然后利用無菌PBS分別將其倍比稀釋成5×1010、5×109、5×108、5×107cfu/mL共4個濃度梯度。每個濃度梯度鼻腔接種10只小鼠(注射量為0.1 mL/只)，觀察30 d，記錄每組小鼠死亡情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 銅綠假單胞菌分離菌株的生化特征

如表2所示，所分離出的20株疑似銅綠假單胞菌的病原菌均能在十六烷三甲基溴化銨培養(yǎng)基、乙酰胺培養(yǎng)基、普通瓊脂斜面培養(yǎng)基42 ℃生長；并同時能在硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基上產(chǎn)氣，能使明膠液化，氧化酶試驗呈陽性。

表2 銅綠假單胞菌分離株的生化鑒定Tab.2 Biochemical identification of suspected PA isolates

2.2 銅綠假單胞菌分離株16S rRNA擴增結(jié)果

如圖1所示，對20株銅綠假單胞菌分離株的16S rRNA擴增結(jié)果表明，所分離的20株病原菌均為銅綠假單胞菌。

M：DL2000 DNA Marker；2、19：水對照；1、3—18、20—22：銅綠假單胞菌分離株16S rRNAM：DL2000 DNA Marker; 2,19:Water control; 1,3—18,20—22:PA isolates 16S rRNA

2.3 銅綠假單胞菌分離株的血清型分析

如表3所示，20株銅綠假單胞菌分離株表現(xiàn)出G型和B型2種血清型，其比例分別為85%和15%，因此，銅綠假單胞菌分離株的血清型以G型為主。

表3 銅綠假單胞菌的血清型Tab.3 Classification of serotype of PA isolates

2.4 銅綠假單胞菌分離株的耐藥性分析

如表4所示，20株分離的銅綠假單胞菌對氨基糖苷類的3種抗生素的耐藥率為5%～50%，對妥布霉素的敏感率最高，為95%；對多黏菌素B的耐藥率為15%；對β-內(nèi)酰胺類的耐藥率高達30%～100%，其中對氨芐西林、頭孢呋辛、頭孢曲松、頭孢噻吩、頭孢噻肟、頭孢西丁、頭孢唑林均不敏感；對環(huán)丙沙星和洛美沙星的耐藥率分別為55%和65%；對氯霉素的耐藥率達到了95%，對四環(huán)素100%耐藥。

表4 銅綠假單胞菌分離株對20種抗生素的敏感性試驗Tab.4 Antimicrobial susceptibility test of PA isolates against 20 antimicrobial drugs

注: R表示不敏感，I表示中度敏感，S表示敏感。

Note: R indicates insensitivity, I indicates moderate sensitivity, S indicates sensitivity.

如表5所示，對不同血清型(血清型B型3株，G型17株)銅綠假單胞菌株進行20種抗生素的耐藥率分析發(fā)現(xiàn)，血清型B型菌株的耐藥率為0～100%，而血清型G型的耐藥率則為5.88%～100%。血清型G型和B型對β-內(nèi)酰胺類抗生素頭孢呋辛、頭孢曲松、頭孢噻吩、頭孢噻肟、頭胞西丁、頭孢唑林的耐藥率均為100%，這可能與臨床大量應(yīng)用該類抗生素有關(guān)。

與此同時，對20株銅綠假單胞菌的多重耐藥性進行分析發(fā)現(xiàn)，所有分離株多重耐藥性在10耐至18耐之間，表明銅綠假單胞菌分離株對常見20種抗生素耐藥嚴重(表6)，在臨床治療和預(yù)防中要遵循聯(lián)合用藥的原則，避免更多耐藥菌株的出現(xiàn)。

表5 不同血清型銅綠假單胞菌分離株對20種抗生素的耐藥率Tab.5 Resistance rates of PA isolates from different serotyping against 20 antimicrobial drugs %

表6 銅綠假單胞菌分離株的多重耐藥分析Tab.6 Multiple drug resistance analysis of PA isolates from different serotyping against 20 antimicrobial drugs %

2.5 銅綠假單胞菌分離株的ToxA基因及產(chǎn)色素分析

如圖2所示，對20株銅綠假單胞菌分離株的ToxA基因檢測表明，所有分離株均檢測出397 bp的ToxA基因片段。因此，銅綠假單胞菌分離株都能產(chǎn)生毒素A。

20株銅綠假單胞菌分離株中有2株能夠產(chǎn)淺藍色的色素，其他18株能夠產(chǎn)黃綠色色素(圖3)，說明銅綠假單胞菌分離株以產(chǎn)黃綠色色素為主。

M：DL2000 DNA Marker；5、14：水對照；1—4、6—13、15—22：銅綠假單胞菌分離株的ToxA基因片段M:DL2000 DNA Marker; 5,14:Water control; 1—4,6—13,15—22:ToxAgene fragment in PA isolates

圖3 銅綠假單胞菌的產(chǎn)色素鑒定

2.6 銅綠假單胞菌分離株的強毒株篩選

小鼠在進行銅綠假單胞菌腹腔接種后，均表現(xiàn)出精神沉郁、不食、被毛蓬松的癥狀。部分菌株的攻毒小鼠在攻毒16 h后陸續(xù)出現(xiàn)死亡，144 h后沒有小鼠死亡。其中，接種銅綠假單胞菌分離株ZHDL6和ZHDL9的小鼠在24 h全部死亡，而接種分離株ZHDL9后16 h即有1只小鼠死亡，因此，篩選的銅綠假單胞菌分離株ZHDL9為強毒株(表7)。

表7 銅綠假單胞菌分離株的強毒株篩選Tab.7 Screening of virulent strain in PA isolates

2.7 銅綠假單胞分離株ZHDL9感染后小鼠毒力的分析

接種銅綠假單胞菌分離株ZHDL9后，小鼠均表現(xiàn)出精神沉郁、不食、被毛蓬松、咳嗽等癥狀。4個劑量組中只有最低劑量5×106cfu組的小鼠有存活(表8)。如圖4所示，對死亡小鼠進行剖檢，可觀察到被感染的小鼠具有嚴重的肺部充血，病理切片顯示，死亡小鼠的肺泡腔縮小，肺泡壁增厚。根據(jù)動物死亡數(shù)量，得出5×107cfu劑量的銅綠假單胞菌分離株ZHDL9能夠使試驗組小鼠完全致死(表8)。為進一步得出銅綠假單胞菌分離株ZHDL9的絕對致死量(LD100)，將稀釋度分別為5×107、4×107、3×107、2×107、1×107cfu的分離株ZHDL9分別鼻腔接種小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有最高劑量5×107cfu組的小鼠全部死亡。因此，分離株ZHDL9的小鼠絕對致死量(LD100)為5×107cfu。

對死亡小鼠的肺部進行分菌培養(yǎng)后，利用銅綠假單胞菌的16S rRNA通用引物進行擴增，能得到銅綠假單胞菌16S rRNA基因序列條帶，將其回收后克隆至pMD18-T載體后進行測序，結(jié)果表明，由死亡小鼠肺部所分離得到菌株是銅綠假單胞菌，證明小鼠是由銅綠假單胞菌感染而死亡(圖5)。

表8 銅綠假單胞菌分離株的毒力檢測Tab.8 Virulence detection of PA isolates

a：接種銅綠假單胞菌分離株ZHDL9后死亡小鼠；b：接種銅綠假單胞菌株ZHDL9后死亡小鼠肺臟；c：死亡小鼠肺臟病理切片(10×100)；d：對照小鼠解剖；e：對照小鼠肺臟；f：對照小鼠肺臟切片(10×100)

M：DL2000 DNA Marker； 1：水對照；2—4：銅綠假單胞菌16S rRNA M:DL2000 DNA Marker; 1:Water control;2—4:PA 16S rRNA

3 結(jié)論與討論

銅綠假單胞菌常感染免疫系統(tǒng)降低的人群，從而引起發(fā)病人群的獲得性肺炎[10-12]，還能感染狗、貓、水貂、狐貍等動物[13]。銅綠假單胞菌在水貂飼養(yǎng)環(huán)境中分布廣泛，在水、飼槽、飲水槽等處均可分離到。而水貂是對銅綠假單胞菌敏感的動物[14-15]，感染后會患出血性肺炎，患病水貂往往發(fā)生突然死亡，并伴隨有口鼻出血及肺部嚴重出血[6]。

目前，在醫(yī)院的臨床治療中，β-內(nèi)酰胺類抗生素、氨基糖苷類抗生素及喹諾酮類抗生素是治療銅綠假單胞菌的常用抗生素。但是，近些年銅綠假單胞菌對這3類抗生素的耐藥率逐漸升高[16]。有研究報道，在所分離的銅綠假單胞菌中發(fā)現(xiàn)了耐藥基因blaNDM-1[17]，從而進一步說明該病原菌的耐藥現(xiàn)象越來越嚴重，抗生素對該病的防控形勢日漸嚴峻。本研究對分離于臨床貂場的20株銅綠假單胞菌進行耐藥性試驗，結(jié)果表明，所分離的水貂場中銅綠假單胞菌的耐藥非常嚴重，單一分離株最高對18種抗生素耐藥，對臨床常見的β-內(nèi)酰胺類抗生素氨芐西林、頭孢呋辛、頭孢西丁、頭孢曲松、頭孢唑林、頭孢噻吩及頭孢噻肟的耐藥率達到了100%。銅綠假單胞菌較高的耐藥率給臨床水貂出血性肺炎的防控帶來了極大的困難。2012年的5—6月，遼寧大連及山東的一些貂場暴發(fā)了水貂出血性肺炎，水貂死亡率接近50%。這可能與高耐藥性的銅綠假單胞菌密切相關(guān)，即常規(guī)的抗生素治療無效果或者效果不明顯，而貂場該病原菌高耐藥菌株的出現(xiàn)可能與不合理用藥密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，20株銅綠假單胞菌分離株對妥布霉素的敏感率為95%，提示妥布霉素可能在臨床防控水貂出血性肺炎中效果明顯。

疫苗被認為是防控感染性疾病的有效手段。銅綠假單胞菌具有眾多的血清型，這也是目前該病原菌相關(guān)疫苗遲遲未上市的主要原因。有關(guān)資料顯示，感染水貂的銅綠假單胞菌血清型常見的有G型、B型、I型和M型[7]。本研究中，20株銅綠假單胞菌分離株中有17株為G型，這與目前報道的諸多文獻相一致[18-19]，表明G型的銅綠假單胞菌是水貂出血性肺炎的感染過程中的主要血清型，其具體致病機制有待于進一步研究。

與此同時，對20株銅綠假單胞菌分離株的毒力進行研究發(fā)現(xiàn)，大部分銅綠假單胞菌分離株接種小鼠72 h后，小鼠僅有零星死亡，其他小鼠表現(xiàn)出精神萎靡等臨床癥狀，而接種了分離株ZHDL6和ZHDL9的小鼠，在24 h時全部死亡，剖檢后的小鼠肺臟出現(xiàn)嚴重的出血現(xiàn)象，說明不同的銅綠假單胞菌分離株存在較大的毒力差異，且小鼠可作為銅綠假單胞菌感染肺部的模式動物。此外，接種銅綠假單胞菌分離株ZHDL9的小鼠在16 h即發(fā)生了死亡，說明分離株ZHDL9的毒力較其他分離株強，為疫苗候選菌株的篩選提供了依據(jù)，有助于將來疫苗的開發(fā)。

毒力因子是銅綠假單胞菌行使其毒力的前提。常見的毒力因子有毒素A、脂多糖(LPS)、溶血素、毒素S等。毒素A是銅綠假單胞菌的胞外分泌毒素，具有嚴格的種屬特異性，分泌該毒素的銅綠假單胞菌的分離率通常在90%左右。毒素A的含量常常決定了銅綠假單胞菌感染宿主后對宿主的損傷程度。一方面毒素A能夠抑制蛋白質(zhì)因子EF-2的活性，從而抑制相關(guān)蛋白質(zhì)的合成來發(fā)揮其毒力作用，另一方面毒素A還能形成一些免疫復(fù)合物來進一步加強其毒力作用[20]。本研究中，銅綠假單胞菌分離株均能分泌毒素A，并且在臨床分離病原的過程中，發(fā)現(xiàn)死亡水貂的肺部有彌漫性出血的現(xiàn)象，也說明了毒素A可能介導(dǎo)水貂的肺部損傷。因此，對毒素A進行深入研究，可能能夠進一步解釋水貂為什么是目前唯一對銅綠假單胞菌敏感的動物[21]。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)水貂出血性肺炎病原(銅綠假單胞菌)新近流行株對妥布霉素較為敏感，可為該病的臨床治療提供理論依據(jù)。同時本研究篩選出毒力較強的銅綠假單胞菌分離株ZHDL9，為貂源銅綠假單胞菌生物制品的研發(fā)提供了依據(jù)。