Poly(I：C)刺激下豬肺泡巨噬細(xì)胞TLR3基因及其信號(hào)通路基因表達(dá)變化分析

李聰聰，葉連萌，盧 濤， 吳 姣，徐秋良，宋素芳，李婉濤

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 動(dòng)物科技學(xué)院，河南 鄭州 450046； 2.河南省畜禽遺傳資源保護(hù)工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046)

疾病發(fā)生是我國(guó)生豬養(yǎng)殖業(yè)一直存在的問(wèn)題，且近幾年呈現(xiàn)出日益嚴(yán)重的趨勢(shì)。目前，豬的疾病種類很多，并且表現(xiàn)出復(fù)雜化和典型化現(xiàn)象，給生豬養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大危害。其中，病毒性疾病傳播速度快，病豬的死亡率高，防控形勢(shì)嚴(yán)峻。病毒能夠寄宿在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行生存和繁殖，不易被消除，并且病毒的遺傳物質(zhì)極易發(fā)生突變，普通疫苗的防控難度大。因此，亟須深入探索與病毒致病相關(guān)的信號(hào)通路及其基因的調(diào)控機(jī)制，從而找到治療豬病毒病的新思路。

巨噬細(xì)胞是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)一類重要的免疫細(xì)胞，在固有免疫和適應(yīng)性免疫中均發(fā)揮重要作用。當(dāng)豬受到病毒(例如豬藍(lán)耳病毒)感染后，首先被影響的便是巨噬細(xì)胞(例如肺泡巨噬細(xì)胞)。有數(shù)據(jù)表明，感染豬藍(lán)耳病毒后，豬體內(nèi)巨噬細(xì)胞的功能會(huì)受到抑制，形成嚴(yán)重的免疫抑制反應(yīng)，從而導(dǎo)致豬體對(duì)其他病毒性和細(xì)菌性疾病的易感性明顯增加[1]。

宿主細(xì)胞的抗病毒作用主要是Toll受體3(Toll-like receptor 3，TLR3)與病毒雙鏈RNA(Double-stranded RNA，dsRNA)兩者的特異性作用，其作用機(jī)制大致有2類：第一，當(dāng)dsRNA與TLR3特異性結(jié)合后，會(huì)進(jìn)入胞內(nèi)并引起干擾素等抗病毒細(xì)胞因子的活化，從而抑制病毒的復(fù)制；第二，當(dāng)dsRNA與TLR3特異性結(jié)合后，會(huì)激活特異性的RNA酶，從而分解病毒的RNA，以調(diào)控非特異性抗病毒反應(yīng)[2]。朱博等[3]研究表明，TLR3能夠同時(shí)介導(dǎo)2種免疫反應(yīng)：TLR3能夠識(shí)別dsRNA并發(fā)生天然的抗病毒免疫反應(yīng)；TLR3通過(guò)活化髓樣分化因子88(Myeloid differentiation factor 88，MyD88)蛋白，并介導(dǎo)共刺激分子CD86、CD80等其他細(xì)胞因子的表達(dá)，繼而發(fā)生炎癥反應(yīng)。TLR3可通過(guò)MyD88非依賴/TRIF依賴型信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)產(chǎn)生Ⅰ型干擾素(Interferon，IFN)，其中β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TIR-domain-containing adapter-inducing interferon β，TRIF)是TLR3介導(dǎo)的MyD88非依賴信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白[4]。當(dāng)TLR3識(shí)別dsRNA后，通過(guò)TRIF銜接蛋白促進(jìn)TANK結(jié)合激酶1(TANK-binding kinase 1，TBK1)和IKK激酶ε(Inhibitor-κB kinase ε，IKKε)等轉(zhuǎn)錄因子的生成，從而激活干擾素調(diào)節(jié)因子3(Interferon regulatory factor 3，IRF3)[5-8]，進(jìn)而誘導(dǎo)共刺激分子CD40、CD80和CD86的表達(dá)[9-13]。

本研究使用Poly(I：C)模擬病毒，刺激體外培養(yǎng)的豬肺泡巨噬細(xì)胞(3D4/21細(xì)胞)，設(shè)計(jì)不同的處理時(shí)間，觀察3D4/21細(xì)胞形態(tài)的變化，采用qPCR方法檢測(cè)TLR3基因及其信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)量的變化，探討3D4/21細(xì)胞在Poly(I：C)刺激下發(fā)生的免疫應(yīng)答分子機(jī)制，旨在為豬病毒性疾病的抗病工作提供新的方法和思路。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

Poly(I：C)(tlrl-pic-5)購(gòu)自InvivoGen公司。將50 mL無(wú)菌Poly(I：C)稀釋液PBS(購(gòu)自Gibco公司)與50 mg的Poly(I：C)粉末加入錐形瓶中,完全稀釋至1 mg/mL，分裝后保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 3D4/21細(xì)胞培養(yǎng)及Poly(I：C)刺激

10%的FBS和89%的1640培養(yǎng)基以及1%的MEM非必需氨基酸溶液(MEM-NEAA)構(gòu)成了培養(yǎng)3D4/21細(xì)胞(由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)趙書(shū)紅課題組惠贈(zèng))的完全培養(yǎng)基，其中FBS、1640培養(yǎng)基和MEM-NEAA均購(gòu)自Gibco公司。將細(xì)胞置于5% CO2、飽和濕度的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)到90%左右時(shí)，用25 μg/mL[14]的Poly(I：C)進(jìn)行刺激，分別在刺激4、8、12、24 h時(shí)用倒置顯微鏡觀察3D4/21細(xì)胞形態(tài)并于拍照后收集細(xì)胞，同時(shí)以加入等量稀釋液PBS的3D4/21細(xì)胞作為陰性對(duì)照，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.3 3D4/21細(xì)胞的總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及qPCR

利用Trizol(購(gòu)自Invitrogen公司)提取細(xì)胞的總RNA，并用NanoDrop 1000(購(gòu)自Invitrogen公司)測(cè)定質(zhì)量濃度，并記錄每個(gè)樣品的總RNA質(zhì)量濃度和OD260/OD280值。每個(gè)樣品取2 μg，加入RNA變性Loading Buffer[15]，進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)28S rRNA、18S rRNA以及5.8S rRNA條帶的完整性。

用DNaseⅠ(購(gòu)自Invitrogen公司)對(duì)提取的總RNA去除基因組DNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒K1622(購(gòu)自Invitrogen公司)的操作步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，將cDNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以所得cDNA為模板，對(duì)TLR3、IRF3、CD86、IFNα基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)分析，各基因檢測(cè)引物見(jiàn)表1，引物由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行合成。10 μL的反應(yīng)體系：5 μL 2×SYBR?Green Real-time PCR Master Mix(購(gòu)自Toyobo公司)，25 pmol引物，50 ng模板cDNA，補(bǔ)水至10 μL。利用ABI7500 Fast系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s。

表1 定量PCR引物信息Tab.1 The information of primers for qPCR

1.4 數(shù)據(jù)處理

qPCR數(shù)據(jù)用相對(duì)定量2-ΔΔCt法進(jìn)行分析[18]，GAPDH作為內(nèi)參基因?qū)Ω骰虮磉_(dá)水平進(jìn)行校正。t檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)差異顯著性，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 Poly(I：C)刺激下不同處理時(shí)間3D4/21細(xì)胞形態(tài)變化

如圖1所示，對(duì)照組的3D4/21細(xì)胞均呈現(xiàn)橢圓形和不規(guī)則形狀，胞內(nèi)漿液較為豐富，且細(xì)胞呈現(xiàn)均勻密集分布，貼壁良好。但在Poly(I：C)刺激下，4 h時(shí)試驗(yàn)組的3D4/21細(xì)胞大部分為貼壁細(xì)胞，大多數(shù)仍呈橢圓形，只有少量的圓形死細(xì)胞出現(xiàn)；8 h時(shí)試驗(yàn)組的3D4/21細(xì)胞密度增大，圓形死細(xì)胞的數(shù)量開(kāi)始增多；12 h時(shí)試驗(yàn)組的3D4/21細(xì)胞發(fā)生形態(tài)變化，出現(xiàn)較多菱形、星形的細(xì)胞，還有少部分細(xì)胞出現(xiàn)偽足和突起；24 h時(shí)試驗(yàn)組的大部分3D4/21細(xì)胞出現(xiàn)清晰的偽足和突起，且出現(xiàn)大量的圓形死細(xì)胞，并且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，試驗(yàn)組死細(xì)胞越來(lái)越多。

圖1 Poly(I：C)刺激下不同處理時(shí)間3D4/21細(xì)胞的形態(tài)(×100)Fig.1 The morphological changes of the 3D4/21 cells after stimulation with Poly(I：C) (×100)

2.2 3D4/21細(xì)胞總RNA的提取及質(zhì)量檢測(cè)

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的3D4/21細(xì)胞總RNA，共顯示出3條亮帶(28S rRNA、18S rRNA和5.8S rRNA)，其中28S rRNA條帶亮度接近18S rRNA條帶亮度的2倍，并且點(diǎn)樣孔附近沒(méi)有其他條帶的出現(xiàn)(圖2)，說(shuō)明所獲得的細(xì)胞總RNA完整性及質(zhì)量良好。

圖2 3D4/21細(xì)胞總RNA瓊脂糖凝膠電泳(部分)Fig.2 Total RNA agarose gel electrophoresis of 3D4/21 cells (Section)

2.3 Poly(I：C)刺激下3D4/21細(xì)胞中TLR3基因及其信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)量變化

在Poly(I：C)刺激下，4個(gè)處理時(shí)間中試驗(yàn)組TLR3基因和IRF3基因的表達(dá)量均呈現(xiàn)先下調(diào)后上調(diào)趨勢(shì)。與對(duì)照組相比，在4 h和8 h時(shí)，試驗(yàn)組TLR3基因表達(dá)量與對(duì)照組無(wú)顯著差異；在12 h時(shí)，試驗(yàn)組TLR3基因的表達(dá)量是對(duì)照組的1.63倍，且差異顯著(P<0.05)；在24 h時(shí)，試驗(yàn)組TLR3基因的表達(dá)量最高，是對(duì)照組的2.77倍，且差異顯著(P<0.05)(圖3)；在4個(gè)處理時(shí)間中，試驗(yàn)組IRF3基因的表達(dá)量均高于對(duì)照組，但差異均不顯著(圖3)。在Poly(I：C)刺激下，4個(gè)處理時(shí)間中試驗(yàn)組IFNα基因的表達(dá)量呈上調(diào)趨勢(shì)。與對(duì)照組相比，4 h時(shí)試驗(yàn)組IFNα基因的表達(dá)量略有上升，但差異不顯著；在8 h和12 h時(shí)，試驗(yàn)組IFNα基因的表達(dá)量分別是對(duì)照組的1.84倍和2.14倍，且差異顯著(P<0.05)；在24 h時(shí)，試驗(yàn)組IFNα基因的表達(dá)量最高，是對(duì)照組的2.91倍，且差異顯著(P<0.05)(圖3)。在Poly(I：C)刺激下，4個(gè)處理時(shí)間中試驗(yàn)組CD86基因的表達(dá)量呈先上調(diào)后下調(diào)的趨勢(shì)，在4、8、12 h時(shí)，試驗(yàn)組CD86基因表達(dá)量均較對(duì)照組大幅度上升。在4 h時(shí)，CD86基因的表達(dá)量是對(duì)照組的4.70倍，差異顯著(P<0.05)；在8 h時(shí)，CD86基因的表達(dá)量是對(duì)照組的7.92倍，差異極顯著(P<0.01)；在12 h時(shí)，CD86基因的表達(dá)量最高，是對(duì)照組的17.60倍，差異極顯著(P<0.01)；但在24 h時(shí)，試驗(yàn)組CD86基因的表達(dá)量較8 h和12 h呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，并且其表達(dá)量是對(duì)照組的6.00倍，差異極顯著(P<0.01)(圖3)。以上數(shù)據(jù)表明，當(dāng)Poly(I：C)刺激3D4/21細(xì)胞時(shí)，能夠誘導(dǎo)TLR3基因及其信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)量發(fā)生變化，其中TLR3和IRF3基因表達(dá)趨勢(shì)均呈現(xiàn)波動(dòng)上調(diào)，IFNα基因呈現(xiàn)持續(xù)上調(diào)的趨勢(shì)，而CD86基因的表達(dá)則表現(xiàn)為先上調(diào)后下調(diào)的趨勢(shì)。

*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)

3 結(jié)論與討論

3.1 Poly(I：C)刺激下3D4/21細(xì)胞形態(tài)的變化

一般情況下，3D4/21細(xì)胞呈現(xiàn)橢圓形或不規(guī)則形態(tài)，在dsRNA刺激下，3D4/21細(xì)胞會(huì)隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)生懸浮，最終變?yōu)樗兰?xì)胞，此時(shí)3D4/21細(xì)胞形態(tài)主要呈現(xiàn)圓形，被Poly(I：C)刺激后的3D4/21細(xì)胞形態(tài)會(huì)隨著處理時(shí)間的推移，發(fā)生相應(yīng)的變化[18]。最初，細(xì)胞主要呈現(xiàn)橢圓形或不規(guī)則形狀，且胞漿豐富[19]；用Poly(I：C)刺激4 h后，3D4/21細(xì)胞的貼壁性良好，但隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞密度會(huì)逐漸增大并出現(xiàn)鈍形偽足和突起。楊志梅等[20]報(bào)道，在一定劑量的病毒刺激下，隨著時(shí)間的推移3D4/21細(xì)胞會(huì)變圓死亡，且在24 h時(shí)死亡數(shù)量最多，與本研究結(jié)果一致。

3.2 Poly(I：C)刺激下TLR3基因及其信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)量的變化

本研究中，試驗(yàn)組受體基因TLR3和IRF3基因均呈現(xiàn)波動(dòng)上調(diào)趨勢(shì)，均在24 h達(dá)到最高表達(dá)量，在24 h時(shí)，試驗(yàn)組TLR3和IRF3基因的表達(dá)量分別是對(duì)照組的2.77倍和1.42倍；細(xì)胞因子IFNα基因的表達(dá)量于4個(gè)處理時(shí)間呈上調(diào)趨勢(shì)，在24 h時(shí)，試驗(yàn)組IFNα基因的表達(dá)量是對(duì)照組的2.91倍；共刺激分子CD86的表達(dá)量于4個(gè)處理時(shí)間呈先上調(diào)后下調(diào)的趨勢(shì)，在12 h時(shí)，試驗(yàn)組CD86基因的表達(dá)量是對(duì)照組的17.60倍。

王繼英等[17]設(shè)置4種Poly(I：C)質(zhì)量濃度(0、10、20、40 μg/mL)和4個(gè)處理時(shí)間(4、8、12、24 h)對(duì)豬的外周血單核細(xì)胞進(jìn)行刺激，檢測(cè)TLR3、IRF3、IFNα基因的表達(dá)水平變化發(fā)現(xiàn)，在Poly(I:C)質(zhì)量濃度為20～40 μg/mL時(shí)，TLR3和IRF3基因的表達(dá)量隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，并在刺激24 h時(shí)的表達(dá)量最高，與本研究測(cè)定結(jié)果一致；在Poly(I：C)刺激4 h時(shí)IFNα基因的表達(dá)量最高，但隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)其表達(dá)量逐漸降低，本研究中，IFNα基因的表達(dá)量在刺激24 h時(shí)達(dá)到最高，推測(cè)原因可能是單核細(xì)胞與3D4/21細(xì)胞類型的差異造成，并且供試Poly(I：C)可能也存在一定的差異。王彥平等[16]用20 μg/mL的Poly(I：C)刺激長(zhǎng)白豬的外周血單核細(xì)胞24 h，檢測(cè)免疫應(yīng)答過(guò)程中相關(guān)基因的表達(dá)變化，結(jié)果表明，TLR3和IFNα基因表達(dá)量均上調(diào)，但變化不大，刺激組的IRF3基因表達(dá)量較對(duì)照組下調(diào)，而本研究中，IRF3基因的表達(dá)量波動(dòng)上調(diào)，但差異不顯著(P>0.05)，推測(cè)可能的原因是細(xì)胞類型不同，且細(xì)胞來(lái)源存在個(gè)體差異。王海飛[21]用20 μg/mL的Poly(I：C)刺激長(zhǎng)白豬的外周血單核細(xì)胞，分別選擇0、4、8、12、24 h為處理時(shí)間，檢測(cè)免疫應(yīng)答過(guò)程中相關(guān)基因的表達(dá)水平變化，結(jié)果表明，在Poly(I：C)刺激24 h時(shí)，TLR3和IRF3基因的表達(dá)量達(dá)到最高，與本研究結(jié)果一致；在Poly(I∶C)刺激4 h時(shí)，IFNα基因的表達(dá)量最高，隨后逐漸降低，而在本研究中，IFNα基因的表達(dá)量在Poly(I：C)刺激24 h時(shí)最高，與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。王冬梅等[22]用100 μg/L的Poly(I：C)與200個(gè)TCID50的豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)感染的豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM細(xì)胞)，分別在12、24、36、48 h時(shí)檢測(cè)IRF3基因的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，12 h時(shí)IRF3基因的表達(dá)量最高，但在本研究中，IRF3基因的表達(dá)量在12 h和24 h持續(xù)上調(diào)，推測(cè)原因可能是PRRSV存在一定的作用。WANG等[23]用1 μg/mL的Poly(I：C)刺激雞胚成纖維細(xì)胞(CEFs)，并分別于2、6、12、20 h時(shí)檢測(cè)IRF3基因的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，在Poly(I：C)刺激6 h時(shí)，IRF3基因表達(dá)量最高，隨后IRF3基因的表達(dá)量下降。王冬梅等[24]用PRRSV感染PAM細(xì)胞1 h，而后用100 μg/mL的Poly(I：C)刺激細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)12、24、36、48 h，收集細(xì)胞檢測(cè)PAM細(xì)胞中的IFNα基因表達(dá)水平變化發(fā)現(xiàn)，刺激組與對(duì)照組相比，IFNα基因的表達(dá)量顯著上調(diào)，證明PRRSV和Poly(I：C)刺激PAM細(xì)胞后均能促進(jìn)IFNα基因的轉(zhuǎn)錄，與本研究結(jié)果一致。LI等[14]用25 μg/mL的Poly(I：C)刺激豬PK15細(xì)胞，并分別在0、4、12、24 h時(shí)進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，于Poly(I：C)刺激12 h前，CD86基因表達(dá)量基本無(wú)變化，但在24 h時(shí)表達(dá)量最高，而本研究中，在Poly(I：C)刺激12 h時(shí)，試驗(yàn)組CD86基因的表達(dá)量最高，但在24 h時(shí)其表達(dá)量較12 h時(shí)降低，與對(duì)照組相比差異均極顯著(P<0.01)，推測(cè)原因可能是供試細(xì)胞的類型不同。綜上所述，不同類型或不同來(lái)源的細(xì)胞對(duì)不同批次Poly(I：C)的耐受力不同，Poly(I：C)刺激的質(zhì)量濃度和處理時(shí)間選擇不同，另外還有個(gè)體差異的因素都會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。

本研究采用Poly(I：C)體外刺激3D4/21細(xì)胞，qPCR檢測(cè)TLR3基因及其信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)量變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Poly(I：C)能夠誘導(dǎo)TLR3、IRF3、IFNα和CD86基因的上調(diào)表達(dá)，表明豬體感染病毒時(shí)TLR3信號(hào)通路發(fā)揮了重要調(diào)控作用，為豬病毒病的抗病育種防治提供新的方法和策略。