秦巴山區(qū)蕙蘭內生真菌多樣性分析

羅陽蘭，鄧百萬，劉軍生，柏秋月，解修超，張毓文

(陜西理工大學 生物科學與工程學院/陜西省食藥用菌工程技術研究中心，陜西 漢中 723001)

蕙蘭(Cymbidiumfaberi)為蘭科蕙蘭屬地生蘭，生于濕潤且排水良好的透光林地，廣泛分布于我國陜西南部、甘肅南部、浙江、四川、云南和西藏東部等地。蕙蘭是我國栽培最久和最普及的四大國蘭之一[1]，市場需求量大。而人為的過度采挖，加之該物種本身繁殖速度慢，生長周期長，使其難以滿足近年來日益增長的市場需求[2]。研究表明，內生真菌可為蘭科植物的幼苗提供營養(yǎng)物質和植物激素等[3-4]，有助于提高幼苗成活率，并促進其生長發(fā)育[5-6]。如張晉彥等[7]利用篩選的4種內生真菌通過固體菌劑和液體菌劑2種接種方式，建立了蘭花組培苗與真菌的共生培養(yǎng)體系，提高了幼苗的成活率。研究秦巴山區(qū)蕙蘭內生真菌的多樣性，分離鑒定出更多內生真菌，對開發(fā)利用秦巴山區(qū)蕙蘭內生真菌資源，促進蕙蘭生長發(fā)育具有重要意義。鑒于此，以陜西省略陽縣、洋縣和南鄭區(qū)3個地點采集的野生蕙蘭為試材，對其根部內生真菌進行分離鑒定，并分析內生真菌多樣性，以期為秦巴山區(qū)蕙蘭內生真菌資源的開發(fā)利用和資源保護提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

2018年3—4月，對采集于陜西省漢中市略陽縣、南鄭區(qū)和洋縣3個地點的蕙蘭樣品(無病蟲害)進行內生真菌的分離。各試驗樣地的環(huán)境條件見表1。

表1 各樣品采集地基本情況

1.2 試劑

葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硝酸鈉、硫酸亞鐵、蔗糖、瓊脂均為分析純，購自上海生工生物工程有限公司。

1.3 儀器

SW-CJ-1D型單人超凈工作臺(上海蘇凈實業(yè)有限公司)、YXQ-LS-50S型高壓滅菌鍋(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)、5404R型高速冷凍離心機(德國Eppendorf儀器公司)、GELDOC型凝膠成像儀(美國Bio-Rad有限公司)、K960型熱循環(huán)PCR儀(杭州晶格科學儀器有限公司)。

1.4 培養(yǎng)基

改良PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、蛋白胨5 g/L、磷酸二氫鉀5 g/L、硫酸鎂3 g/L、蕙蘭組織勻漿濾液(100 g/L)100 mL、瓊脂15 g/L、水900 mL，pH值自然。

察氏培養(yǎng)基(CA)：硝酸鈉3 g/L、磷酸氫二鉀1 g/L、硫酸鎂0. 5 g/L、硫酸亞鐵0. 01 g/L、蔗糖30 g/L、瓊脂15 g/L、水1 000 mL，pH值自然。

1.5 方法

1.5.1 內生真菌的分離 將蕙蘭根組織用流水沖洗干凈，75%乙醇處理1 min，無菌水沖洗4次，0.1%升汞處理8 min，然后用2.5%次氯酸鈉消毒4 min，之后用無菌水沖洗5次，無菌濾紙吸干水分待用。將接入分離培養(yǎng)基的根組織用解剖刀切成1 cm長小段，每皿接種3塊組織塊，3個樣地共9個蕙蘭樣品各接種10皿，28 ℃恒溫箱培養(yǎng)，待菌絲長出，轉接入新培養(yǎng)皿。菌種保藏采用改良PDA 瓊脂斜面培養(yǎng)基，28 ℃恒溫箱培養(yǎng)，4 ℃冰箱保藏。

1.5.2 內生真菌形態(tài)鑒定 在察氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)，采用棉藍染色法[8]在光學顯微鏡下觀察菌絲體的形態(tài)和大小[9]，參考《真菌鑒定手冊》[10]對其進行基本的分類鑒定。

1.5.3 內生真菌ITS分子鑒定 利用CTAB法提取分離得到的內生真菌菌株DNA，采用真菌通用引物ITS-1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS-4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對ITS序列進行擴增。PCR反應體系50 μL：2×TaqMaster Mix 25 μL，10 μmol/L引物各2 μL，模板DNA 1 μL(質量濃度10 ng/μL),ddH2O補齊至50 μL。反應條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃ 30 s， 59 ℃退火30 s，72 ℃ 60 s，33個循環(huán)；72 ℃延伸2 min，4 ℃保存。將PCR產物送至上海生工生物工程有限公司測序，測序結果整理后進行Blast比對，并提交NCBI申請獲得登錄號，利用Mega 7.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5.4 統(tǒng)計分析 利用分離率(Isolation rate，IR)[11]分析不同樣地蕙蘭內生真菌的分布情況， IR=(樣本組織塊中分離的菌株數/全部供試樣本組織塊數)×100%。

利用相對分離頻率(Relative frequency，RF)[12]衡量蕙蘭中某種內生真菌的優(yōu)勢度，RF=(樣本中分離的某種內生真菌的菌株數/分離的總菌株數)×100%。

蕙蘭內生真菌多樣性指數和相似性系數計算方法如下：

香農-維納指數(Shannon-Wiener index，H’)=-ΣPiln(Pi)，其中，Pi=Ni/N；

均勻度指數(Evenness index，E)=H’/lnS；

豐富度指數(Margalef index，M)=(S-1) /Log2(N)。

其中，Pi為內生真菌i的菌株數占全部內生真菌菌株數的百分數，H’為內生真菌多樣性指數，S為每個樣地蕙蘭內生真菌種類數，N為每個樣地蕙蘭內生真菌總數。

辛普森指數(Simpson index，D)=1-Σ(Ni/N)2，Ni為每個樣地蕙蘭內生真菌i的數量，N為每個樣地蕙蘭內生真菌總數。

采用相似性系數(Sorenson similarity coefficient，Cs) 比較兩地蕙蘭樣品之間內生真菌種類組成的相似程度，Cs=j/(a+b-j)。其中，j是兩地蕙蘭樣品之間共同具有的內生真菌種類數，a是一地蕙蘭樣品中內生真菌的種類數，b是另一地蕙蘭樣品中內生真菌的種類數[12]。各樣地間的相似性系數在0.25以下，為極不相似；在0.25～0.50，為不相似，0.50以上為相似。

2 結果與分析

2.1 蕙蘭內生真菌的分離和鑒定結果

采用組織分離法從3個地點采集的9個蕙蘭樣品的270塊組織中共分離得到內生真菌309株，其中，略陽縣共分離出102株，南鄭區(qū)共分離出93株，洋縣共分離出114株。

利用形態(tài)學方法根據菌落形態(tài)特征將分離到的菌株進行初步排重、歸類后，共得到內生真菌212株，其中，略陽縣88株，南鄭區(qū)64株，洋縣60株，分離得到的內生真菌形態(tài)特征見表2。

表2 蕙蘭內生真菌種類及形態(tài)學特征

續(xù)表2 蕙蘭內生真菌種類及形態(tài)學特征

利用分子生物學方法進行鑒定，以ITS1和ITS4為引物進行擴增，得到長度約800 bp的擴增片段，經測序后，提交至GenBank數據庫中，進行序列分析和相似性比較，取相似性大于99%的序列建立系統(tǒng)發(fā)育樹以確定3個樣地所分離菌株的系統(tǒng)分類地位，如圖1—3所示，略陽縣分離得到的88株內生真菌分屬于4個門9個綱25個屬；南鄭區(qū)的64株內生真菌分屬于3個門8個綱20個屬；洋縣的60株內生真菌分屬于4個門11個綱20個屬。

2.2 蕙蘭內生真菌的種群組成及分布特征

龐雄飛等[13]研究認為，某物種占整體物種的百分比即分離率分別體現(xiàn)了3種情況：優(yōu)勢屬≥10%，常見屬為1%～10%，稀有屬≤1%。由表3可知，蕙蘭內生真菌中優(yōu)勢屬僅有1個，為木霉屬(Trichodermasp.)，其分離率和相對分離頻率分別為18.52%、23.58%。常見屬14個，其中，鐮刀菌屬(Fusariumsp.)分離率和相對分離頻率分別為8.89%、11.32%，青霉屬(Penicilliumsp.)分離率和相對分離頻率分別為6.67%、8.49%，曲霉屬(Aspergillussp.)分離率和相對分離頻率分別為5.56%、7.08%等。其余30個屬為稀有屬。此外，不同樣地的蕙蘭也有各自特有的內生真菌菌屬，從略陽縣分離得到的內生真菌有12個獨有屬，分別為亡革菌屬(Thanatephorussp.)、節(jié)菱孢屬(Arthriniumsp.)、叢赤殼屬(Nectriopsissp.)、Cephalothecasp.、Aphanoascussp.、Eladiasp.、小克銀漢霉屬(Cunninghamellasp.)、栓菌屬(Trametessp.)、棒孢屬(Corynesporasp.)、Trichaptumsp.、傘狀霉屬(Umbelopsissp.)和煙管菌屬(Bjerkanderasp.)；南鄭區(qū)有10個獨有屬，分別為擬莖點霉屬(Phomopsissp.)、Cadophorasp.、絲孢菌屬(Scedospoiumsp.)、毀絲霉屬(Myceliophthorasp.)、Microdiplodiasp.、Paraconiothyriumsp.、毛殼屬(Chaetomiumsp.)、瓶霉菌屬(Phialophorasp.)、粒毛盤菌屬(Lachnumsp.)和間座殼屬(Diaporthesp.)；洋縣有8個獨有屬，分別為炭角菌屬(Xylariasp.)、殼二孢屬(Ascochytasp.)、根霉屬(Rhizopussp.)、角擔菌屬(Ceratobasidiumsp.)、Acrocalymmasp.、革孔菌屬(Coriolopsissp.)、新赤殼屬(Neocosmosporasp.)和鬼傘屬(Coprinussp.)。

LY+數字表示略陽縣樣品所分離菌株的順序編號

2.3 蕙蘭內生真菌的多樣性和相似性分析

由表4可知，不同樣地所分離的內生真菌多樣性指數不同，香農-維納指數、均勻度指數、辛普森指數大小順序均為略陽縣>洋縣>南鄭區(qū)，豐富度指數、分離率、相對分離頻率大小順序均為略陽縣>南鄭區(qū)>洋縣。由此可見，略陽縣采集的蕙蘭內生真菌多樣性程度高，生境條件適宜，群落結構穩(wěn)定。相關性分析結果表明，香農-維納指數分別與均勻度指數、辛普森指數呈正相關關系。香農-維納指數與均勻度指數之間的回歸方程為y=0.118 8x+0.529 7，決定系數(R2)=0.592 4；香農-維納指數與豐富度指數之間的回歸方程為y=0.204 7x+0.353 7，R2=0.900 8。豐富度指數與分離率和相對分離頻率呈顯著正相關關系，豐富度指數與相對分離率之間的回歸方程為y=47.075x-77.442，R2=0.998 6；豐富度指數與相對分離頻率之間的回歸方程為y=19.962x-32.808，R2=0.998 8。

NZ+數字表示南鄭區(qū)樣品所分離菌株的順序編號

由表5可知，3個樣地間，略陽縣與南鄭區(qū)，南鄭區(qū)與洋縣間的蕙蘭內生真菌組成不相似，而略陽縣和洋縣間的內生真菌組成相似。

LG+數字表示洋縣樣品所分離菌株的順序編號

門Phylum屬Genus數量/個 Number略陽縣Lueyang南鄭區(qū)Nanzheng洋縣Yangxian總數Total分離率/%Isolation rate相對分離頻率/%Relative frequency子囊菌門Ascomycota肉座菌屬(Hypocrea sp.)21693.334.25青霉屬(Penicillium sp.)963186.678.49曲霉屬(Aspergillus sp.)636155.567.08節(jié)菱孢屬(Arthrinium sp.)10010.370.47赤霉菌屬(Gibberella sp.)10120.740.94叢赤殼屬(Nectriopsis sp.)40041.481.89生赤殼屬(Bionectria sp.)11020.740.94毛殼屬(Chaetomium sp.)04041.481.89瓶霉菌屬(Phialophora sp.)02020.740.94粒毛盤菌屬(Lachnum sp.)01010.370.47炭團菌屬(Hypoxylon sp.)02241.481.89間座殼屬(Diaporthe sp.)01010.370.47炭角菌屬(Xylaria sp.)00331.111.42

表4 3個樣地蕙蘭內生真菌的多樣性指數

3 結論與討論

本試驗從秦巴山區(qū)3個樣地采集的蕙蘭中共分離出212株內生真菌，分屬于4個門45個屬，其中，木霉屬的分離率和相對分離頻率最高，分別為18.52%、23.58%，為優(yōu)勢內生真菌類群。另外還有14個常見屬和30個稀有屬，這可能是因為稀有屬真菌在蕙蘭內部分布頻率較低，或者培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件不適宜其生長，也可能是菌株本身即為稀有屬[14]，如瓶霉菌屬(Phialophorasp.)、傘狀霉屬(Umbelopsissp.)、附毛孔菌屬(Trichaptumsp.)[15]等。

多樣性指數分析結果表明，略陽縣采集的蕙蘭內生真菌多樣性程度高，生境條件適宜，群落結構穩(wěn)定，其植株長勢也較好，可對其生長環(huán)境條件如土壤理化性質、養(yǎng)分含量和酶活力等進一步研究，探索適宜蕙蘭生長的環(huán)境條件，為人工栽培蕙蘭提供借鑒。相似性分析結果表明，洋縣蕙蘭與略陽縣蕙蘭之間內生真菌群落結構相似，這可能是由于兩地同屬于秦嶺山系，海拔、降水和土壤理化性質等趨于一致，而南鄭區(qū)采樣點位于巴山山系，與這兩地的蕙蘭樣品中內生真菌群落結構不相似，這與SAKAMOTO等[16]認為蘭科內生真菌種類與其所處地理位置具有較大的相關性的觀點相一致。王倩[17]研究發(fā)現(xiàn)，浙江天目山、重慶金佛山的蕙蘭與膠膜菌屬真菌共生，河南信陽的蕙蘭與臘殼菌屬(Sebacinasp.)菌根真菌共生，而本研究分離的內生真菌中包含角擔菌屬和亡革菌屬2個菌根真菌屬的真菌，表明秦嶺蕙蘭與角擔菌屬和亡革菌屬菌根真菌共生，這說明蘭屬植物與菌根真菌的共生存在地域多樣性，并不是專一與膠膜菌屬共生。

植物內生菌是一類重要的微生物資源，在促進植物生長、提高植物抗逆性[18]、加強生物防治[19]、生產活性次生代謝產物[20]和修復環(huán)境污染[21]等方面發(fā)揮了重要作用。本研究分離鑒定的內生真菌中有多種類群與已報道的具有應用價值的真菌為同一菌屬。楊秀麗等[22]認為，瓶霉菌屬(Phialophorasp.)真菌是一類具有廣譜性的內生真菌，具有較高的應用價值。木霉屬(Trichodermasp.)和粘帚霉屬(Gliocladiumsp.)真菌均有促進植物生長、防治植物病害等作用[23-24]，小克銀漢霉屬真菌可對甘草次酸、青蒿素、雷諾嗪等藥物進行生物轉化[25-27]。本試驗分離的蕙蘭內生真菌應用潛力巨大，具有進一步開發(fā)利用的價值。本試驗通過分離鑒定秦巴山區(qū)蕙蘭內生真菌并對其進行多樣性分析，了解蕙蘭內生真菌群落結構，后續(xù)試驗將篩選能夠促進蕙蘭生長、提高蕙蘭抗逆性的真菌菌株，這對于開發(fā)具有生防作用的菌劑或菌肥具有重要意義，可為蕙蘭內生真菌資源的開發(fā)利用提供基礎。