消銀湯治療銀屑病小鼠模型的實(shí)驗(yàn)研究

史 勇 李冬梅 肖井雷

(長春大學(xué)特殊教育學(xué)院,長春130022)

銀屑病(Psoriasis，PS)俗稱牛皮癬，中醫(yī)稱之為“白疕”，是一種常見的易于復(fù)發(fā)的慢性炎癥性皮膚病，特征性損害為紅色丘疹或斑塊上覆有多層銀白色鱗屑，銀屑病主要病理改變?yōu)楸砥ぴ錾只惓?、真皮乳頭毛細(xì)血管增生擴(kuò)張和炎癥細(xì)胞浸潤[1，2]。增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)和血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(CD31)在細(xì)胞增生、分化及血管形成過程中起重要調(diào)控作用[3，4]。本研究通過建立銀屑病動(dòng)物模型，觀察中藥消銀湯治療后銀屑病小鼠血清及皮損區(qū)PCNA、VEGF和CD31的表達(dá)及分布特點(diǎn)，為探討銀屑病的發(fā)病機(jī)制及消銀湯的廣泛臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器 消銀湯由長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院提供，其主要成分：黃芪10 g，生地15 g，牡丹皮12 g，赤芍15 g，半枝蓮30 g，白化蛇舌草15 g，槐花10 g，紫草10 g，玄參15 g，丹參15 g，雞血藤15 g，甘草6 g；用水煎煮2次，煎煮合并濃縮液每劑168 ml(1 g/ml)，每天攝入量2.8 g/kg(成人60 kg)。十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate，SDS)購于北京鼎國生物有限公司；RNA提取試劑Trizol購于Invitrogen公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq酶和DL 2000 marker購于塔克拉公司； 兔抗鼠PCNA、VEGF和CD31一抗購于Abcam公司；SP9710和DAB顯色試劑盒購于福州邁新生物有限公司；Biotek Epoch酶標(biāo)儀；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI7300)、Biometra PCR擴(kuò)增儀(Biotek公司，美國)；OLYMPUS BX51顯微鏡(OLYMPUS公司，日本)。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥 BALB/c雌性小鼠(合格證號(hào)：SCXK遼2015-0001)50只隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、消銀湯低、中和高劑量組，每組10只。消銀湯組采用灌胃方式給予消銀湯17.3、34.5和69.0 g/kg，對(duì)照組及模型組均每日灌胃給予等劑量的生理鹽水，每天2次，連續(xù)治療14 d，然后處死取血液和皮膚組織。

1.2.2動(dòng)物模型制備[5]實(shí)驗(yàn)前1 d全部小鼠背部皮膚去毛(3 cm2)；次日模型組和消銀湯各劑量組小鼠背部去毛處皮膚均勻涂抹10% SDS 2 ml，1次/d，共7 d制備模型；對(duì)照組小鼠給予蒸餾水同樣涂抹7 d。

1.2.3樣本采集和檢測指標(biāo) 各組動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后次日清晨處死，取血液及皮膚組織，一部分于4℃冰箱暫存待測，一部分固定于10%福爾馬林液，每組取10個(gè)樣品。

1.2.3.1小鼠皮損組織的病理學(xué)觀察 蘇木精-伊紅(HE)染色后，通過OLYMPUS BX51顯微鏡觀察。

1.2.3.2小鼠血液和皮損組織中PCNA、VEGF和CD31 mRNA水平的檢測 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測，引物的設(shè)計(jì)和合成由上海生物工程有限公司提供。PCNA上游引物：5′-GACACATACCGCTGCGATCG-3′，下游引物：5′-TCACCACAGCATCTC-CAATAT-3′，片段307 bp；VEGF上游引物：5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游引物：5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′，片段260 bp；CD31上游引物：5′-AGCGTTGAGCCAAGTGTAGAC-3′，下游引物：5′-ATGCTCATGCACGTCCGTGCAT-3′，片段287 bp。每個(gè)樣本基因擴(kuò)增3次，取樣本得Ct值均值，采用2-ΔΔCt表示目的基因相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.3.3小鼠皮損組織中PCNA、VEGF和CD31蛋白的陽性表達(dá)強(qiáng)度的檢測 采用免疫組織化學(xué)方法，陽性表達(dá)呈棕黃色，細(xì)胞核復(fù)染為藍(lán)色。通過Motic Images Advanced 3.2圖像分析軟件分析，蛋白陽性表達(dá)強(qiáng)度用光密度值(OD值)表示，OD值越大陽性表達(dá)越強(qiáng)。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠皮損組織的病理改變 HE染色200倍鏡光學(xué)顯微鏡下觀察可見，正常組小鼠：表皮較薄排列規(guī)則，真皮層未見淋巴細(xì)胞浸潤。模型組：與對(duì)照組及三個(gè)治療劑量組比較，表皮明顯增厚，真皮層淋巴細(xì)胞浸潤多見。消銀湯高、中、低劑量組：與對(duì)照組比較，表皮均略增厚，真皮層偶見淋巴細(xì)胞浸潤，高、中、低劑量組在病理改變方面未見明顯差異，均能使表皮變薄，減輕病變?cè)斐傻难装Y反應(yīng)。各組小鼠皮膚的附屬器均未見異常，見圖1。

2.2各組小鼠皮損組織中PCNA、VEGF和CD31蛋白的陽性表達(dá)強(qiáng)度 200倍鏡光學(xué)顯微鏡下觀察與對(duì)照組比較，模型組小鼠皮膚組織中PCNA、VEGF和CD31的蛋白陽性表達(dá)強(qiáng)度(OD值)均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，消銀湯各組小鼠皮膚組織中PCNA、VEGF和CD31蛋白的陽性表達(dá)強(qiáng)度(OD值)隨劑量增加顯著降低，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

2.3各組小鼠皮膚組織和血清中PCNA、VEGF和CD31的mRNA水平 與對(duì)照組比較，模型組小鼠皮膚組織和血清中PCNA、VEGF和CD31 mRNA水平均顯著升高， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)； 與模型組比較，消銀湯各組小鼠皮膚組織和血清中PCNA、VEGF和CD31的mRNA水平隨劑量增加其降低趨勢(shì)顯著，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

GroupsmRNA level of skin lesions tissuePCNAVEGFCD31mRNA level in serumPCNAVEGFCD31Control group6.33±0.9511.02±1.418.37±1.464.06±0.796.13±0.927.22±1.04Model group16.91±1.281)21.45±2.831)22.52±3.031)8.89±1.311)13.25±2.071)15.01±3.651)Low dose group13.09±1.021)2)17.42±2.511)2)15.19±2.071)2)7.16±1.151)2)10.64±1.811)2)12.36±2.941)2)Medium dose group11.16±1.351)2)3)14.08±1.621)2)3)12.86±2.141)2)3)6.08±1.291)2)3)8.35±1.421)2)3)10.03±1.921)2)3)High dose group8.69±0.971)2)3)4)11.74±1.392)3)4)10.13±1.371)2)3)4)4.67±0.852)3)4)6.71±0.892)3)4)8.52±1.261)2)3)4)

Note：Compared with control group，1)P<0.05;compared with model group，2)P<0.05;compared with Low dose group，3)P<0.05;compared with Medium dose group，4)P<0.05.

圖1 各組小鼠皮膚組織的HE染色、免疫組織化學(xué)染色及蛋白陽性表達(dá)強(qiáng)度(OD值)的比較

Fig.1 Comparison of HE staining，immunohistochemical staining and protein positive expression in skin tissues of mice in each group

Note: Compared with control group，*.P<0.05;compared with model group，#.P<0.05;compared with Low dose group，△.P<0.05;compared with Medium dose group，▲.P<0.05.

3 討論

銀屑病是一種較常見的易復(fù)發(fā)的慢性炎癥皮膚病，是具有遺傳傾向的變態(tài)反應(yīng)性皮膚疾病，目前國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)銀屑病與遺傳、感染鏈球菌、免疫異常、內(nèi)分泌代謝障礙、環(huán)境因素及精神因素等有關(guān)，屬于多基因遺傳的疾病[6-8]。銀屑病組織病理學(xué)以表皮角化不全、角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖、炎癥細(xì)胞浸潤及新生血管形成為主要特征，其確切病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚[9]。

PCNA是分子量為36 kD的酸性非組胺核蛋白，僅在增殖細(xì)胞中合成或表達(dá)[10]。1978 年Miyachi 等[11]首次發(fā)現(xiàn)并命名，它在細(xì)胞周期G1期開始升高，S期合成達(dá)到高峰，M期降至最低。PCNA參與DNA的合成，凡處于增殖期的細(xì)胞、組織均可檢出PCNA的陽性表達(dá)，而處于靜止?fàn)顟B(tài)的細(xì)胞、組織PCNA表達(dá)則為陰性，其變化與DNA的合成相一致，因此檢測PCNA含量可間接反映局部細(xì)胞、組織的增殖狀態(tài)[10,12]。VEGF又名血管通透因子，由角蛋白細(xì)胞分泌，是血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性有絲分裂原，是一種促血管生成的主要調(diào)節(jié)因子，它通過血管內(nèi)皮生長因子受體轉(zhuǎn)導(dǎo)其促血管生成的信號(hào)，促使血管通透性增加及血管內(nèi)皮細(xì)胞增生、遷移，最終導(dǎo)致新生血管形成，對(duì)血管生成具有重要作用，是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及誘導(dǎo)血管生成的因子[13,14]。CD31主要存在于內(nèi)皮細(xì)胞表面，可反映血管增殖變化及組織形態(tài)變化[15,16]。

針對(duì)國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)PCNA、VEGF和CD31是與銀屑病皮損病理學(xué)相關(guān)的基因[3,17]。PCNA、VEGF和CD31在銀屑病小鼠皮損處過度表達(dá)，會(huì)促進(jìn)表皮細(xì)胞過度增殖、角化不全、加速血管增生及增加血管的滲透性，誘發(fā)炎癥細(xì)胞的遷移，從而加重銀屑病皮損處的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)銀屑病的病理進(jìn)程，因此降低PCNA、VEGF和CD31在銀屑病小鼠皮損處的表達(dá)，可能成為銀屑病的治療靶點(diǎn)。

消銀湯應(yīng)用于銀屑病治療發(fā)現(xiàn)它具有改善病情、延長緩解期、不良反應(yīng)小及防止復(fù)發(fā)的特點(diǎn)[18,19]。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究制備銀屑病模型小鼠，通過消銀湯高、中、低劑量治療，觀察小鼠皮損處表皮厚度、真皮炎癥細(xì)胞浸潤度、PCNA、VEGF和CD31的蛋白及mRNA表達(dá)水平，探索消銀湯治療銀屑病的作用機(jī)制及臨床療效。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)不同劑量的消銀湯能不同程度地抑制銀屑病模型小鼠背部皮損的角質(zhì)細(xì)胞過度增殖、真皮乳頭層微血管擴(kuò)張迂曲；能降低小鼠皮損組織、血清中PCNA、VEGF和CD31的蛋白及mRNA水平，高、中、低劑量組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明：消銀湯能通過下調(diào)PCNA、VEGF和CD31的蛋白及mRNA表達(dá)水平，明顯改善銀屑病小鼠的臨床癥狀，為消銀湯的臨床推廣用藥和指導(dǎo)其臨床用藥具有重要意義。