來曲唑通過cAMP通路下調(diào)MMP-2的表達抑制子宮肌瘤細胞的遷移與侵襲

劉 玨 張瀟迪 張群鋒

(南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科,衡陽421001)

子宮肌瘤也被稱為子宮纖維瘤或纖維肌瘤，是中年女性生殖器官常見腫瘤。多數(shù)患者發(fā)病無明顯癥狀，主要在超聲檢查或盆腔檢查時才發(fā)現(xiàn)[1，2]。來曲唑為人工合成的芐三唑類衍生物，是第3代芳香化酶抑制劑。其能夠通過降低雌激素水平來消除雌激素對腫瘤生長的刺激作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)子宮肌瘤患者在接受治療后腫瘤體積明顯縮小且不會對肝腎功能等方面造成負面影響，取得了較好的效果[4]。本研究擬通過探討來曲唑?qū)AMP信號通路和MMP-2表達的影響，結(jié)合患者臨床病理特征，進一步探討來曲唑在抑制子宮肌瘤細胞的遷移與侵襲中的具體機制。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1研究對象 收集本院病理科自2014年8月至2017年12月病理證實為子宮肌瘤的手術(shù)切除標(biāo)本320例為實驗組(Tumour組)，患者年齡31～58歲，平均(38.14±7.15)歲，體重43～83 kg，平均(59.86±7.97)kg；病程2～115個月，平均(31.13±16.08)個月；肌瘤平均體積(167.47±54.23)cm3。均為新發(fā)病例，納入標(biāo)準:①病理類型均為子宮肌瘤；②收集標(biāo)本前未進行任何針對腫瘤的治療，如放療、化療等。同時收集因子宮肌瘤切除的全子宮的正常子宮肌組織280例作為正常對照組(Normal組)，對照組患者年齡33～62歲，平均年齡(40.13±7.59)歲。將手術(shù)切除后離體的宮頸標(biāo)本立即置于無菌狀態(tài)下，裝入無RNA酶的EP管中，立即放入液氮罐中，轉(zhuǎn)存入-80℃冰箱內(nèi)保存。

1.1.2主要試劑 RNA提取試劑盒由北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司提供，ABI7500定量PCR儀由美國ABI公司提供，BCA試劑盒由上海翊圣生物科技有限公司提供，光學(xué)顯微鏡由上海蔡康光學(xué)儀器有限公司提供，免疫組織化學(xué)以及WB中抗體由美國Abcam公司提供，ELISA試劑盒由上海邦奕生物科技有限公司提供，流式細胞儀由武漢科力瓦貿(mào)易有限公司提供。

1.2方法

1.2.1HE染色 用10%中性甲醛溶液固定標(biāo)本24 h 以上，梯度酒精脫水并切片 (5 μm)，將切片置于80℃烤箱中1 h。再次使用常規(guī)酒精脫水、沖洗、進行蘇木素和伊紅染色，中性樹膠封片后在光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

1.2.2免疫組織化學(xué) 石蠟切片置于60℃烘箱過夜，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水、PBS沖洗、室溫封閉后加1 μg/ml的MMP-2抗體工作液，PBS代替一抗作為陰性對照，4℃孵育過夜。加辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗，室溫孵育30 min。DAB顯色5 min，流水沖洗5 min，蘇木素復(fù)染3 min，1%鹽酸酒精分化5 s，自來水浸泡10 min返藍。中性樹脂封片后于光學(xué)顯微鏡下觀察。每張切片隨機選取5個視野，采用 Image-Pro Plus 7.0 軟件計算每個視野陽性染色的平均吸光度值。

1.2.3原代人子宮肌瘤細胞培養(yǎng)與鑒定 無菌條件下取肌瘤組織約1 cm3，用DMEM培養(yǎng)液消化，DMEM培養(yǎng)液吹打懸浮后將培養(yǎng)液接種于50 ml培養(yǎng)瓶中并于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。根據(jù)肌瘤細胞貼壁生長的特性而分離肌瘤細胞。α-actin抗體進行免疫細胞化學(xué)法染色鑒定子宮肌瘤細胞，取對數(shù)生長期且狀態(tài)穩(wěn)定的細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.4細胞分組與藥物干預(yù) 用 DMSO(在培養(yǎng)基中的濃度<1%)溶解來曲唑。將細胞分組為:Normal組(正常子宮肌細胞)，Tumour組(子宮肌瘤細胞)，NC組(二甲基亞砜DMSO)，dBcAMP組(子宮肌瘤細胞轉(zhuǎn)染cAMP mimic質(zhì)粒)，Low dose組(10-7mol/L 來曲唑組)，Medium dose組(10-6mol/L 來曲唑組)，High dose組(10-5mol/L來曲唑組)。

1.2.5qRT-PCR法 細胞總RNA按照RNA提取試劑盒提取總RNA。設(shè)計MMP-2、cAMP、Bcl-2、P450arom、Bax、caspase-3、TIMP-2引物，交由TaKaRa公司合成(表1)。應(yīng)用ABI7500定量PCR儀進行實時熒光定量PCR檢測，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10 min，95℃變性30 s，60℃退火20 s，72℃延伸34 s，40個循環(huán)。熒光定量PCR反應(yīng)體系20 μl：SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(2×)10 μl，PCR Forward Primer (10 μl)0.8 μl，Uni-miR qPCR Primer(10 μl) 0.8 μl，ROX Reference Dye (50 × )0.4 μl，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA模板2 μl，ddH2O 6 μl。目的基因的表達水平采用2-ΔΔCt法計算。

表1 qRT-PCR引物序列

Tab.1 Primer sequences

GeneSequencesMMP-2Upstream:5′-TCTGGTCCCTTGCAGCTAGT-3′Downstream:5′-TGGGACAAGAACCAGATCAC-3′cAMPUpstream :5′-AGGTCCTCAGCTACAAGGAAG-3′Downstream:5′-TCTTGAAGTCACAATCCTCTGGT-3′P450aromUpstream:5′-CTCCTCACTGGCCTTTTCTC-3′Downstream:5′-GCCGAATCGAGCGCTGATTA-3′TIMP-2Upstream:5′-ATCAGGGCCAAAGGGTCAGTG-3′Downstream:5′-GTCACACAGGGTGATGTGCAT-3′Caspase-3Upstream:5′-CTTTCTCAAGGACCACCG-3′Downstream:5′-TCACTTGGCAT ACAAATCA-3′BaxUpstream:5′-GTTTCATCCAGGATCGAGC-3′Downstream:5′-GGAAGTCCAATGTCCAGC-3′ Bcl-2Upstream:5′-GTGGAGGAGCTCTTCAGGGA-3′Downstream:5′-AGGCACCCAGGGTGATGCAA-3′ GAPDHUpstream:5′-GGTGTGAACCACGAGAAATATGAC-3′Downstream :5′-TCATGAGCCCTTCCACAATG-3′

1.2.6Western blot 取各組細胞，加入1 ml細胞裂解液， BCA試劑盒測定每個樣品的蛋白濃度。配制10% SDS分離膠與濃縮膠，樣品與加樣緩沖液混合，煮沸、冰浴、離心后進行電泳分離，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉4℃封閉2 h。分別于兔抗人MMP-2、cAMP、P450arom、TIMP-2、Bax、Bcl-2、Caspase-3和HRP標(biāo)記的兔抗人GAPDH 抗體中4℃過夜，再以1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗孵育2 h，ECL化學(xué)顯色。各目的蛋白的表達量用蛋白的A值與GAPDH的A值的比值半定量表示。

1.2.7ELISA法測定細胞培養(yǎng)基中雌二醇(E2)和cAMP含量 來曲唑作用72 h后，收集各組細胞培養(yǎng)基，3 000 r/min離心 20 min 后取上清。嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作。于20 min內(nèi)在全能酶標(biāo)儀 (BioTek Synergy 2) 測定450 nm波長處各孔的吸光度 (OD值)，檢測E2和cAMP的含量。

1.2.8MTT法檢驗各組細胞轉(zhuǎn)染后增殖能力變化 待各組細胞生長密度大約為80%時，PBS沖洗、胰酶消化后制成單細胞懸液。96孔板中每孔接種3×103～6×103個，體積0.2 ml，分別于培養(yǎng)24 h、48 h、72 h時取出培養(yǎng)板，換含10% MTT溶液的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸掉上清液，每孔加100 μl二甲基亞砜，輕輕振蕩混勻10 min，使其充分溶解由活細胞產(chǎn)生的甲瓚晶體，使用酶標(biāo)儀檢測490 nm處各孔吸光度值。

1.2.9流式細胞儀檢測細胞凋亡情況 Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)染色檢測細胞凋亡情況，各組細胞培養(yǎng)48 h后，收集細胞，用0.25%胰蛋白酶溶液消化。置培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)中培養(yǎng)48 h，收集細胞，PBS沖洗后取200 μl離心細胞加入結(jié)合緩沖液內(nèi)，后加入10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，加入300 μl結(jié)合緩沖液，用流式細胞儀于波長488 nm檢測細胞凋亡情況。

1.2.10劃痕實驗檢測各組細胞遷移情況 收集各組對數(shù)生長期細胞，6孔板中每孔接種1×106個，置于培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)中培養(yǎng)直至細胞融合度約為95%，用20 μl微量移液頭在6孔板內(nèi)垂直線性劃痕，D-hanks液沖洗去除飄落細胞后加入無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，劃痕后0、36 h取樣，相差顯微鏡下隨機選擇3個100×視野拍照，比較各組間劃痕愈合差異，在照片選取3個不同位置，測量劃痕寬度，計算平均值，并通過計數(shù)遷移細胞數(shù)。

1.2.11Transwell實驗檢測各組細胞侵襲情況 各組細胞饑餓、消化、PBS沖洗后調(diào)整濃度為2×106個/ml。采用24孔板8 μm Transwell小室，每組3個小室，實驗前在小室鋪50 μl Matrigel基質(zhì)膠，48 h后在Transwell小室上室分別加入各組細胞的單細胞懸液200 μl (4 × 104個細胞)，而小室下室加入650 μl 含10% FBS的G-DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。后取出小室，PBS沖洗，0.1%結(jié)晶紫染色，使用棉簽輕輕擦去微孔膜上層的細胞。在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察并且采集圖像，隨機選擇4個視野，對穿過微孔膜的細胞進行計數(shù)，計算平均值。

2 結(jié)果

2.1子宮肌瘤組織及瘤旁正常子宮肌組織病理學(xué)變化 HE染色結(jié)果顯示：Normal組子宮平滑肌層無明顯增生，肌細胞排列整齊，胞漿紅染呈多邊形，染色質(zhì)濃集呈固縮狀，細胞緊密黏連，沒有或極少炎性細胞浸潤；子宮肌瘤組織中子宮平滑肌層顯著增厚，肌細胞增生，可見炎性細胞浸潤，細胞圓形或橢圓形，核仁明顯，細胞大小不等，有的腫瘤組織被纖維組織分隔成大小不等的癌巢(圖1)。

2.2子宮肌瘤組織及正常子宮肌組織中MMP-2蛋白表達情況 免疫組化結(jié)果顯示在正常子宮肌組織中MMP-2蛋白呈陰性表達(圖2A)，MMP-2主要表達在子宮肌細胞胞漿中，細胞間質(zhì)會中也有少許MMP-2表達。癌團的癌細胞MMP-2的表達強于孤立癌細胞(圖2B)。MMP-2 在正常子宮肌細胞中表達陽性率為(5.90±0.74)%，在子宮肌瘤組織中的表達陽性率為 (60.52±2.98)%，與正常子宮肌組織比較，子宮肌瘤組織中MMP-2陽性率顯著上升(P<0.05)(圖2C)。

圖1 子宮肌瘤組織及瘤旁正常子宮肌組織HE染色(×200)Fig.1 HE staining results of uterine fibroids and adjacent normal uterine muscle tissues(×200)Note：A.Normal uterine muscle tissue;B.Uterine myoma tissue.

2.3藥物干擾后各組細胞中相關(guān)基因的mRNA和蛋白表達水平 qRT-PCR檢測和Western blot檢測結(jié)果如(圖3)所示：與Normal組相比，其余各組細胞Bax、Caspase-3、TIMP-2、cAMP的mRNA和蛋白表達顯著降低，MMP-2、Bcl-2、P450arom的mRNA和蛋白表達顯著升高 (P<0.05)；與Tumour和NC組比較，dBcAMP組細胞Bax、Caspase-3、TIMP-2、cAMP的mRNA和蛋白表達顯著升高，MMP-2、Bcl-2、P450arom的mRNA表達和蛋白顯著降低 (P<0.05)，各藥物干預(yù)組細胞Bax、Caspase-3、TIMP-2、cAMP的mRNA表達和蛋白隨著來曲唑劑量增加而升高，MMP-2、Bcl-2、P450arom的mRNA表達和蛋白隨著來曲唑劑量增加而降低(P<0.05)。

圖2 免疫組織化學(xué)染色(×200)Fig.2 Immunohistochemical staining results(×200)Note：A.Normal uterine muscle tissue;B.Uterine myoma tissue;C.The positive rate of MMP-2 protein expression in the two groups;compared with normal group,*.P<0.05.

圖3 各組細胞相關(guān)基因mRNA和蛋白表達水平統(tǒng)計圖Fig.3 mRNA and protein expression levels of cell related genes in each groupNote：A.mRNA relative expression;B.Protein strip map;C.Protein relative expression;compared with normal group,*.P<0.05；compared with tumour group and NC group,#.P<0.05.

2.4ELISA檢測E2和cAMP含量 與Normal組比較，其余各組細胞E2含量均顯著升高，cAMP含量顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。與Tumour組、NC組比較，dBcAMP組細胞E2含量顯著降低，cAMP含量顯著升高(均P<0.05)，各藥物干預(yù)組的細胞E2含量顯著降低，cAMP含量顯著升高(均P<0.05)，來曲唑劑量越高，子宮肌瘤細胞E2含量越低，cAMP含量越高，且各組之間差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明來曲唑能顯著降低子宮肌瘤細胞E2含量，且存在劑量依賴性。見表2。

2.5檢測各組細胞生長情況 MTT法檢測結(jié)果表明 (圖4)，培養(yǎng)至48 h和72 h時，與Normal組比較，其余各組細胞增殖能力均顯著增強，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與Tumour組、NC組比較，dBcAMP組細胞增殖能力顯著降低(P<0.05)，各藥物干預(yù)組的細胞增殖能力顯著減弱(P<0.05)，來曲唑劑量越高，子宮肌瘤細胞增殖能力越弱，且各組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.6檢測細胞凋亡情況 Annexin V-FITC/PI 雙標(biāo)染色法檢測結(jié)果顯示(圖5)：與Normal組比較，其余各組細胞凋亡率均顯著降低(P<0.05)。與Tumour組、NC組比較，dBcAMP組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，各藥物干預(yù)組的細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，來曲唑劑量越高，子宮肌瘤細胞凋亡率越高(P<0.05)。

表2 各組細胞E2含量

Tab.2 E2 expression in each group

GroupsE2 expression(pg/ml)cAMP expression(pmol/ml)Normal group212±441 267±37Tumour group884±231) 517±241)NC group875±291) 504±291)dBcAMP group669±361)2) 948±331)2)Low dose group756±221)2) 637±211)2)Medium dose group622±331)2) 873±251)2)High dose group417±411)2)1 055±311)2)

Note：Compared with normal group,1)P<0.05；compared with tumour group and NC group,2)P<0.05.

圖4 各組細胞增殖能力變化Fig.4 Changes of cell proliferation ability in each groupNote：Compared with normal group,*.P<0.05；compared with tumour group and NC group,#.P<0.05.

圖5 各組細胞凋亡率

Fig.5 Cell apoptosis rate in each group

Note: A.Cell apoptosis detection map;B.Cell apoptosis histogram; compared with normal group,*.P<0.05；compared with tumour group and NC group,#.P<0.05.

2.7檢測各組細胞遷移情況 劃痕實驗結(jié)果顯示 (圖6)，與Normal組比較，其余各組細胞遷移能力均顯著增強(P<0.05)。與Tumour組、NC組比較，dBcAMP組細胞遷移能力顯著降低(P<0.05)，各藥物干預(yù)組的細胞遷移能力顯著降低(P<0.05)，來曲唑劑量越高，子宮肌瘤細胞遷移能力越低(P<0.05)。

2.8檢測各組細胞侵襲情況 Transwell結(jié)果顯示 (圖7),與Normal組比較，其余各組細胞侵襲能力均顯著增強(P<0.05)。與Tumour組、NC組比較，dBcAMP組細胞侵襲能力顯著降低(P<0.05)，各藥物干預(yù)組的細胞遷移能力顯著降低(P<0.05)，來曲唑劑量越高，子宮肌瘤細胞侵襲能力越低(P<0.05)。

圖6 各組細胞遷移能力的變化Fig.6 Changes of cell migration ability in each groupNote：A.The cell migration test(×200);B.The number of migratory cells in each group;compared with normal group,*.P<0.05；compared with tumour group and NC group,#.P<0.05.

圖7 各組細胞侵襲能力的差異

Fig.7 Difference of cell invasiveness in each group

Note: A.The cell invasiveness of each group (×200);B.The number of invasive cells in each group;compared with normal group,*.P<0.05；compared with tumour group and NC group,#.P<0.05.

3 討論

來曲唑是第3代芳香化酶抑制劑，通過與芳香化酶的活性位點可逆性結(jié)合，抑制芳香化酶的活性，在子宮肌瘤中，來曲唑能顯著降低雌激素的含量，減少雌激素對子宮的刺激，有效治療雌激素引起的疾病[5]。有研究證明，連續(xù)使用來曲唑(5 mg/d)藥物治療12周之后，子宮體積縮小達70%[6]。MMPs是一類依賴Zn2+和Ca2+作為輔助因子的酶，是機體重要的細胞外基質(zhì)降解酶，在腫瘤的侵襲和遷移、傷口愈合中起重要作用，MMP-2則是其中非常重要的一種[7]。TIMP-2能以1∶1 的形式與MMP-2結(jié)合，從而抑制MMP-2的活性，是天然的內(nèi)源性MMPs抑制劑[8]。在cAMP信號通路中，以cAMP為第二信使的信號通路的主要效應(yīng)是通過活化cAMP依賴的PKA使下游靶蛋白磷酸化，從而影響細胞代謝和細胞行為，cAMP信號通路還可影響基質(zhì)的表達，從而影響腫瘤的轉(zhuǎn)移[9,10]。

已有研究發(fā)現(xiàn)MMP-2蛋白在腫瘤的遷移和侵襲中起重要作用，并且可以作為癌癥患者的預(yù)后指標(biāo)[11]。TIMP-2作為MMP-2的拮抗劑，高表達時能顯著抑制癌癥的遷移和侵襲，抑制癌癥的發(fā)展，促進癌細胞的凋亡[12]。cAMP影響體內(nèi)包括TIMP-2和MMP-2的活化從而影響腫瘤的發(fā)展進程，而來曲唑能激活cAMP信號通路，影響MMP-2蛋白和雌激素的表達進而影響子宮肌瘤的進程[12-14]。

本研究發(fā)現(xiàn)，正常子宮肌細胞中cAMP和TIMP-2呈現(xiàn)高表達，MMP-2表達降低，而子宮肌瘤組織中MMP-2陽性率顯著升高，子宮肌瘤細胞中MMP-2表達升高，且cAMP和TIMP-2的表達顯著降低，與此同時凋亡基因Caspase-3和Bax表達顯著降低，細胞凋亡減少，增殖能力、遷移和侵襲能力顯著增加。在施加不同濃度的來曲唑之后，子宮肌瘤細胞中MMP-2的表達顯著降低，瘤細胞遷移、侵襲和增殖能力顯著降低，雌激素含量顯著降低，且cAMP顯著升高，說明在使用來曲唑后，子宮肌瘤中雌激素含量顯著下降，cAMP通路激活，對腫瘤表現(xiàn)抑制作用，這種抑制作用一定程度內(nèi)隨著來曲唑施用量的增加而顯著加強。同時，本實驗設(shè)計了3個藥物干預(yù)組，隨著來曲唑濃度增強，對cAMP、MMP-2、TIMP-2的濃度影響越大，對腫瘤細胞的侵襲和遷移影響越大。

綜上所述，來曲唑能夠上調(diào)cAMP的表達，下調(diào)MMP-2的表達抑制子宮肌瘤細胞的遷移與侵襲，在子宮肌瘤治療中具有較高價值。