皮肌炎患者外周血單核細(xì)胞PD-L1分子的表達(dá)及其臨床意義①

林嘉鴻 陳國強(qiáng) 張紅衛(wèi) 黎志鋒

(佛山市第一人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科,佛山528000)

皮肌炎(Dermatomyositis，DM)是一組以肌無力和皮疹為特點(diǎn)的異質(zhì)性、系統(tǒng)性自身免疫性疾病[1]，其中Gottron征是皮肌炎特異性皮損表現(xiàn)之一，表現(xiàn)為指指關(guān)節(jié)、掌指關(guān)節(jié)伸側(cè)的扁平紫紅色丘疹。皮肌炎的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且尚未完全明確，但有研究發(fā)現(xiàn)皮肌炎病人受累的肌纖維周圍有大量的T細(xì)胞浸潤，部分病人常有多克隆的高球蛋白血癥，表明多種免疫細(xì)胞如T細(xì)胞、B細(xì)胞、抗原提呈細(xì)胞的異?；罨赡軈⑴c本病[2]。

共刺激分子是免疫細(xì)胞之間信號傳導(dǎo)的主要橋梁，其中正性共刺激分子和負(fù)性共刺激分子組成了一個錯綜復(fù)雜的信號體系，綜合調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，在免疫活化和耐受中發(fā)揮重要作用。其中PD-L1、PD-L2是程序性死亡分子-1(Programmed death-1，PD-1)的配體，而PD-1/PD-L1/PD-L2是對T細(xì)胞活化起負(fù)性調(diào)控的協(xié)同刺激分子信號通路，研究發(fā)現(xiàn)，它們在自身免疫性疾病和腫瘤的發(fā)病中起重要作用[3,4]。目前關(guān)于PD-L1在系統(tǒng)性紅斑狼瘡[5,6]、干燥綜合征[7]等自身免疫性疾病的作用已有多篇報(bào)道，但有關(guān)PD-L1與皮肌炎間的相關(guān)報(bào)道甚少。本研究擬通過流式細(xì)胞術(shù)分析PD-L1在皮肌炎病人外周血單核細(xì)胞的表達(dá)，并分析其與炎癥指標(biāo)、皮損和肺間質(zhì)病變等臨床特征的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1資料 25例皮肌炎患者均來自2015年1月至2018年1月收治于我院風(fēng)濕免疫科患者，其中男10例，女15例；年齡(56.1±11.2)歲。臨床診斷符合皮肌炎診斷標(biāo)準(zhǔn)(Bohan等[8]建議的皮肌炎診斷標(biāo)準(zhǔn))，并且在納入研究前半年內(nèi)均未接受過激素或免疫抑制劑治療。25例健康對照組的外周血來自2017年12月的按照年齡、性別匹配的健康體檢者。

1.2方法 流式細(xì)胞術(shù)檢測PD-L1的表達(dá)利用流式細(xì)胞術(shù)評價外周血單核細(xì)胞上PD-L1的表達(dá)。采集受試者清晨空腹?fàn)顟B(tài)下外周靜脈血2 ml，EDTA抗凝，F(xiàn)icoll梯度分離外周血單核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)經(jīng)PBS洗滌后配置成1×106細(xì)胞懸液，取50 μl分別與3 μl FITC標(biāo)記CD14抗體(BD公司，美國)以及APC標(biāo)記的PD-L1抗體(Invitrogen公司，美國)共孵育30 min，PBS洗滌后上機(jī)檢測。

2 結(jié)果

2.1皮肌炎患者外周血單核細(xì)胞PD-L1表達(dá)水平升高 皮肌炎患者外周血單核細(xì)胞中PD-L1表達(dá)水平(20.69±1.10)%明顯高于健康對照組(10.86±0.79)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

2.2PD-L1與炎癥指標(biāo)的關(guān)系 紅細(xì)胞沉降率(Erythrocyte sedimetation rate,ESR)和C反應(yīng)蛋白(Creatcive protein,CRP)是反映皮肌炎活動的炎癥指標(biāo)。根據(jù)ESR、CRP是否升高，將皮肌炎患者分別分為ESR升高組(16例)和ESR正常組(9例)，CRP升高組(17例)和CRP正常組(8例)。分析各組間外周血單核細(xì)胞中PD-L1表達(dá)差異。ESR升高組外周血單核細(xì)胞中PD-L1表達(dá)水平(22.64±1.35)%明顯高于ESR正常組(17.22±1.30)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。CRP升高組外周血單核細(xì)胞中PD-L1表達(dá)水平(22.99±1.15)%明顯高于CRP正常組(15.80±1.26)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,表2)。

GroupsnPD-L1+(%)DM patients2520.69±1.101)Healthy controls2510.86±0.79

Note：1)P<0.05.

2.3PD-L1與典型皮損的關(guān)系 根據(jù)有無Gottron征，將皮肌炎患者分為Gottron征組(19例)和無Gottron征組(6例)，比較各組間外周血單核細(xì)胞中PD-L1表達(dá)差異。Gottron征組患者外周血單核細(xì)胞中PD-L1表達(dá)水平(22.15±1.26)%明顯高于無Gottron征組(16.07±0.82)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖1)。

2.4PD-L1與肺間質(zhì)病變的關(guān)系 根據(jù)有無肺間質(zhì)病變(符合下列診斷標(biāo)準(zhǔn)中1項(xiàng)及1項(xiàng)以上，且發(fā)病時病原學(xué)檢查排除肺部感染：①肺功能異常，具體表現(xiàn)為限制性通氣功能障礙，彌散功能降低，CO彌散率<80%時具有診斷意義；②不明原因的靜息或活動后氣促；③不明原因咳嗽>3個月；④肺部聽診聞及Velcro啰音；⑤肺高分辨率CT有肺間質(zhì)病變的影像學(xué)改變)，將皮肌炎患者分為伴肺間質(zhì)病變組(6例)和無肺間質(zhì)病變組(19例)，比較兩組間外周血單核細(xì)胞中PD-L1表達(dá)差異，伴肺間質(zhì)病變組外周血單核細(xì)胞中PD-L1表達(dá)水平(26.88±2.05)%明顯高于無肺間質(zhì)病變組(18.74±0.94)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

Inflammatory markersnPD-L1+(%)ESR High1622.64±1.351) Normal917.22±1.3CRP High1722.99±1.151) Normal815.80±1.26

Note：1)P<0.05.

圖1 有和無Gottron征皮肌炎患者外周血CD14+單核細(xì)胞PD-L1表達(dá)水平的比較Fig.1 Comparison of PD-L1 expression levels on CD14+ mononuclear cells of DM patients with or without Gottron′s signNote: *.P<0.05.

圖2 有和無肺間質(zhì)病變皮肌炎患者外周血CD14+單核細(xì)胞PD-L1表達(dá)水平的比較Fig.2 Comparison of PD-L1 expression levels on CD14+ mononuclear cells of DM patients with or without interstitial lung diseaseNote：*.P<0.05.

3 討論

皮肌炎是一種以橫紋肌炎性細(xì)胞浸潤為特點(diǎn)的自身免疫性疾病，可累計(jì)肺臟等多種重要臟器，致死率高，該病的具體發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，目前知道T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫可能參與該病。T細(xì)胞活化需要雙重信號，除MHC-抗原肽-TCR相互結(jié)合產(chǎn)生第一信號外,還需要T細(xì)胞表面受體與APC表面的相應(yīng)配體等共刺激分子結(jié)合產(chǎn)生第二信號，這些共刺激分子在免疫應(yīng)答中起著至關(guān)重要的作用，介導(dǎo)和參與腫瘤、感染及自身免疫性疾病等[9-12]。目前已有多種協(xié)同刺激信號通路被發(fā)現(xiàn)及研究，其中PD-1/PD-L1信號通路是一種負(fù)性協(xié)同刺激信號通路，可以傳導(dǎo)抑制性的信號而調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活化和耐受，從而介導(dǎo)和/或破壞免疫平衡(自身耐受性)，參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等多種自身免疫性疾病及腫瘤性疾病[13-15]。其中SLE患者外周血PBMC中存在PD-1及PD-L1表達(dá)異常，導(dǎo)致機(jī)體免疫耐受失調(diào)而產(chǎn)生自身抗體[16]。干燥綜合征患者唾液腺淋巴細(xì)胞PD-1表達(dá)上調(diào)，腺泡和導(dǎo)管上皮細(xì)胞上的PD-L1也存在表達(dá)上調(diào)[7]。

但截至目前為止尚無PD-L1與皮肌炎的相關(guān)報(bào)道，本研究提示PD-L1在皮肌炎的單核細(xì)胞表面異常表達(dá)，并可能與肌炎、皮損和肺間質(zhì)病變等疾病活動相關(guān)。

作為負(fù)性調(diào)控信號，PD-L1/PD-1主要抑制T細(xì)胞活化和增殖。病原菌通過PD-L1/PD-1信號通路抑制宿主免疫防御，而使病原菌感染持續(xù)。腫瘤組織通過PD-L1/PD-1信號通路抑制特異性T細(xì)胞免疫，從而避免被T細(xì)胞殺傷[17]。但在本研究中，皮肌炎患者單核細(xì)胞的PD-L1表達(dá)水平明顯高于健康對照組，且皮肌炎患者單核細(xì)胞PD-L1表達(dá)水平與炎癥指標(biāo)、肌炎、皮損、肺間質(zhì)病變呈正相關(guān)，提示單核細(xì)胞PD-L1表達(dá)水平越高，病情活動度越高。這一結(jié)果與感染和腫瘤中PD-L1抑制T細(xì)胞的活性作用明顯不同。因此，我們猜測皮肌炎患者中單核細(xì)胞表達(dá)的PD-L1可能向T細(xì)胞提供正向調(diào)控信號，從而參與及加重皮肌炎病情。

總之，皮肌炎患者外周血單核細(xì)胞的PD-L1分子表達(dá)水平存在異常，并且與疾病活動相關(guān)，但其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。若條件允許，后期我們將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量來驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果,此工作可能為進(jìn)一步探討PD-L1分子的生物學(xué)功能及皮肌炎的發(fā)病機(jī)制提供線索。