妊娠期糖尿病TNF-α與VCAM-1的表達及相關(guān)性研究

趙莉莉 楊筱青

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)是發(fā)生在妊娠期的一種常見病理狀態(tài)，增加了孕產(chǎn)婦和圍生兒并發(fā)癥的發(fā)生率[1]。研究表明妊娠期糖尿病的特征是胰島素抵抗和與亞臨床炎癥有關(guān)的血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，胰島素是通過血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮作用，當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損時可引起胰島素抵抗，發(fā)生妊娠期糖尿病[2]。因此，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷在妊娠期糖尿病發(fā)病機制中起重要作用。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)是一種促炎性細(xì)胞因子，在體外將TNF-α添加到原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的實驗中發(fā)現(xiàn)TNF-α可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙[3]。血管細(xì)胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)是內(nèi)皮功能障礙的生物標(biāo)志物[4]。VCAM-1可結(jié)合存在于白細(xì)胞上的配體，促進白細(xì)胞附著于血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[5]。目前國內(nèi)關(guān)于TNF-α在GDM的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷發(fā)病機制方面還未見文獻報道，關(guān)于VCAM-1在GDM中的研究甚少。本研究通過測定正常孕婦和妊娠期糖尿病患者血漿、胎盤中TNF-α、VCAM-1的表達，測定所有研究對象血中空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、糖化血紅蛋白(hemoglobinA1c,HbA1c)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein,HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein,LDL-C)、載脂蛋白A(apolipoprotein A, APOA)和載脂蛋白B(apolipoprotein B,APOB)的水平，探討TNF-α、VCAM-1在妊娠期糖尿病發(fā)生、發(fā)展中的作用，及與妊娠期糖尿病病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性，進而為妊娠期糖尿病的治療方案提供依據(jù)。

對象與方法

1.研究對象：選取2015年8月～2016年1月在筆者醫(yī)院產(chǎn)檢和住院分娩的妊娠期糖尿病孕婦50例為GDM組，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照第8版《婦產(chǎn)科學(xué)》，妊娠期糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)：在妊娠24～28周行75g空腹葡萄糖耐量試驗，空腹血糖為5.1mmol/L，1h血糖為10.0mmol/L，2h血糖為8.5mmol/L，任意一點的血糖值達到或超過上述標(biāo)準(zhǔn)即可診斷為妊娠期糖尿病。另選取同期在筆者醫(yī)院產(chǎn)檢和住院的無妊娠合并癥和并發(fā)癥的正常孕婦50例為正常組。GDM組患者年齡21～35歲，平均年齡31.5±5.3歲，分娩孕周37.0～41.1周，平均孕周38.5±1.2周，正常組年齡21～35歲，平均年齡28.1±4.2歲，分娩孕周37.0～41.2周，平均孕周38.6±1.3周，均為單胎妊娠。所有研究對象均無妊娠期高血壓疾病、心臟病、嚴(yán)重肝、腎疾病，其他內(nèi)分泌疾病、血液性疾病、胎膜早破和近期感染病史，無酗酒、抽煙和吸毒及應(yīng)用胰島素等。

2.標(biāo)本采集：入院后治療前抽取空腹靜脈血6ml，3ml用于測定血漿TNF-α、VCAM-1的濃度，另外3ml送筆者醫(yī)院生化檢驗室測定FBG、HbA1c、HDL、LDL、APOA和APOB。胎盤娩出后15min內(nèi)收取胎盤母體面近臍帶根部直徑3cm范圍內(nèi)的組織，約1cm3，進行沖洗、固定、脫水、石蠟包埋等。

3.檢驗指標(biāo)：分別記錄兩組的一般資料，如年齡、分娩孕周、身高、體重、及血壓等，并測定兩組研究對象血中TNF-α、VCAM-1、FBG、HbA1c、HDL、LDL、APOA及APOB的水平。采用ELISA測定血漿TNF-α、VCAM-1濃度；采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測TNF-α、VCAM-1的表達并進行圖像分析；FBG、HbA1c、HDL、LDL、APOA和APOB等送筆者醫(yī)院生化檢驗室測定。

4.主要試劑:人TNF-α酶聯(lián)免疫試劑盒(中國武漢Elabscience公司)，人VCAM-1酶聯(lián)免疫試劑盒(中國武漢Elabscience公司)，鼠抗人TNF-α多克隆抗體(美國Santa Cruz Biotechnology公司)，兔抗人VCAM-1多克隆抗體(美國Santa Cruz Biotechnology公司)。

5.采用雙抗體夾心法：應(yīng)用人TNF-α酶聯(lián)免疫試劑盒和人VCAM-1酶聯(lián)免疫試劑盒分別對TNF-α、VCA M-1的濃度進行測定(操作步驟按試劑盒說明書進行)。采用免疫組化法測定胎盤組織中TNF-α、VCAM-1的表達，在光學(xué)顯微鏡下觀察胎盤組織，陽性表達是細(xì)胞的胞質(zhì)染色為深棕色顆粒，在鏡下選圖，Image-pro plus 6.0處理圖片，計算吸光度值。

結(jié) 果

1.一般資料比較:兩組患者的年齡、分娩孕周、身高、體重、收縮壓及舒張壓比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表1)。

表1 一般情況比較

2.正常組各指標(biāo)檢測結(jié)果:血漿TNF-α濃度平均值1.44±0.50ng/ml，血漿VCAM-1濃度平均值57.45±9.60ng/ml，F(xiàn)BG平均4.29±0.40mmol/L，HbA1c平均5.30%±0.30%，HDL平均2.08±0.40mmol/L，LDL平均2.96±0.50mmol/L，APOA平均2.15±0.30g/L，APOB平均1.18±0.20g/L(表2)。

3.GDM組各指標(biāo)檢測結(jié)果：血漿TNF-α濃度平均值1.77±0.50ng/ml，血漿VCAM-1濃度平均值110.82±9.3ng/ml，F(xiàn)BG平均6.50±0.60mmol/L，HbA1c平均5.70%±0.40%，HDL平均1.60±0.30 mmol/L，APOA平均1.94±0.40g/L，LDL平均3.68±0.80mmol/L，APOB平均1.50±0.40g/L(表2)。

4.正常組和GDM組各指標(biāo)間比較：GDM組血漿中TNF-α、VCAM-1、FBG、HbA1c、LDL、APOB的水平比正常組明顯升高(P<0.05)， HDL、APOA水平與正常組比較明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表2 正常組和GDM 組各指標(biāo)間比較

與正常組比較，*P<0.05

5.血漿中各指標(biāo)之間的相關(guān)性分析:GDM組血漿中TNF-α與VCAM-1濃度呈正相關(guān)(P<0.05)，TNF-α、VCAM-1分別與FBG、HbA1c、LDL、APOB濃度呈正相關(guān)(P<0.05)，與HDL、APOA濃度呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。正常組血漿中TNF-α與VCAM-1的濃度無相關(guān)性(P>0.05)，TNF-α、VCAM-1分別與FBG、HbA1c、HDL、LDL、APOA、APOB無相關(guān)性(P>0.05，表3)。

表3 血漿中各指標(biāo)之間的相關(guān)性

6.免疫組化結(jié)果:TNF-α主要表達于胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞上，蛻膜細(xì)胞也有表達，定位于細(xì)胞質(zhì)，染色為棕黃色顆粒(圖1)。TNF-α在正常組和GDM組的平均吸光度值分別為0.06±0.02、0.12±0.02，GDM組TNF-α的平均吸光度值明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在GDM組血漿中TNF-α水平與胎盤中TNF-α平均吸光度值呈正相關(guān)(r=0.693，P<0.05)。VCAM-1主要表達于胎盤絨毛的合體滋養(yǎng)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞上，定位于細(xì)胞質(zhì)，染色為棕黃色顆粒(圖2)。VCAM-1在正常組和GDM組的平均吸光度值分別為0.04±0.02，0.11±0.02，GDM組VCAM-1的平均吸光度值明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在GDM組血漿中VCAM-1水平與胎盤中VCAM-1平均吸光度值呈正相關(guān)(r=0.617，P<0.05)。GDM組胎盤組織中TNF-α平均吸光度值與VCAM-1平均吸光度值呈正相關(guān)(r=0.643，P<0.05)。

圖1 TNF-α在正常組和GDM組胎盤組織中的表達(SP，×400)A.正常組；B.GDM組

圖2 VCAM-1在正常組和GDM組胎盤組織中的表達(SP,×400)A.正常組；B.GDM組

討 論

妊娠期糖尿病是在妊娠期間首次發(fā)現(xiàn)，是最常見的妊娠并發(fā)癥之一，GDM可能導(dǎo)致孕婦及其后代產(chǎn)生各種不良后果，如妊娠高血壓、剖宮產(chǎn)、早產(chǎn)和巨大兒，以及代謝綜合征發(fā)展的傾向和2型糖尿病[6]。研究表明妊娠期糖尿病的特征是胰島素抵抗和與亞臨床炎癥有關(guān)的血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，胰島素是通過血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮作用，當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損時可引起胰島素抵抗，發(fā)生妊娠期糖尿病[2]。因此，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷在妊娠期糖尿病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

TNF-α是一種由中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子。妊娠后胎盤組織也可分泌TNF-α。Tu′uhevaha等[3]在體外將TNF-α添加到原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的實驗中發(fā)現(xiàn)TNF-α可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。本研究結(jié)果表明妊娠期糖尿病患者血漿中TNF-α的濃度與正常組相比明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這說明TNF-α與妊娠期糖尿病的發(fā)病有關(guān)，筆者推測TNF-α引起血管內(nèi)皮損傷后，導(dǎo)致胰島素抵抗，發(fā)生妊娠期糖尿病。同時本研究結(jié)果還表明妊娠期糖尿病患者的胎盤組織中TNF-α的表達與正常組比較明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且胎盤中TNF-α的表達與血漿TNF-α水平呈正相關(guān)。由此筆者推測胎盤組織中TNF-α表達升高可引起胎盤血管內(nèi)皮損傷，造成胎盤功能障礙。這說明TNF-α可能通過損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞促進妊娠期糖尿病的發(fā)生、發(fā)展。

VCAM-1是免疫球蛋白基因超家族的成員，主要功能是介導(dǎo)淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮的黏附，它在白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。VCAM-1是內(nèi)皮功能障礙的生物標(biāo)志物[4]。VCAM-1可結(jié)合存在于白細(xì)胞上的配體，促進白細(xì)胞附著于血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[5]。研究表明VCAM-1在妊娠期糖尿病及糖尿病合并妊娠中均顯著高于正常組，這與本研究結(jié)果一致[7，8]。本研究結(jié)果顯示，正常組孕婦血漿中VCAM-1的濃度比GDM組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這說明VCAM-1 與妊娠期糖尿病的發(fā)病密切相關(guān)，可以推測當(dāng)VCAM-1損傷血管內(nèi)皮后，引起胰島素抵抗，導(dǎo)致妊娠期糖尿病的發(fā)生。同時本研究結(jié)果還表明正常組孕婦胎盤組織中VCAM-1的表達比GDM組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，并且在GDM組中，胎盤中VCAM-1的表達與血漿VCAM-1的水平呈正相關(guān)，由此可以推測妊娠期糖尿病患者中高表達的VCAM-1可以損傷胎盤血管內(nèi)皮細(xì)胞及滋養(yǎng)層細(xì)胞，造成胎盤功能障礙，進而引起胎兒缺血、缺氧，增加死胎的發(fā)生風(fēng)險。這也說明了VCAM-1可能通過損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞促進妊娠期糖尿病的發(fā)生、發(fā)展。

Di Fulvio等[9]研究結(jié)果表明，在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)TNF-α能刺激ICAM-1、VCAM-1的表達，導(dǎo)致血管通透性增加和血管炎性反應(yīng)，促進內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷，提示妊娠期糖尿病與炎性因子的過度表達和血管性白細(xì)胞黏附分子表達增高有關(guān)，兩者都可導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙和血管疾病，加重胎盤的缺血、缺氧狀態(tài)。本研究結(jié)果表明，正常組血漿中TNF-α與VCAM-1的濃度無相關(guān)性(P>0.05)，而GDM組血漿中TNF-α與VCAM-1濃度呈正相關(guān)(P<0.05)；正常組胎盤組織中TNF-α平均吸光度值與VCAM-1平均吸光度值無相關(guān)性(P>0.05)，而GDM組胎盤組織中TNF-α平均吸光度值與VCAM-1平均吸光度值呈正相關(guān)(P<0.05)。說明TNF-α作為炎性細(xì)胞因子，同時刺激VCAM-1的表達，兩者共同導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，協(xié)同促進了妊娠期糖尿病的發(fā)生、發(fā)展。

本研究結(jié)果表明，GDM組血漿中FBG、HbA1c的濃度明顯高于正常組(P<0.05)，且GDM組血漿中TNF-α、VCAM-1分別與FBG、HbA1c濃度呈明顯正相關(guān)(P<0.05)，而正常組血漿中TNF-α、VCAM-1分別與FBG、HbA1c濃度無相關(guān)性(P>0.05)，說明TNF-α、VCAM-1在一定程度上反映了妊娠期糖尿病的嚴(yán)重程度。

妊娠期的脂質(zhì)代謝異常與妊娠期糖尿病的發(fā)生有關(guān)，是導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局的重要危險因素。HDL和LDL是脂代謝變化的指標(biāo)，APOA是HDL的主要載脂蛋白，APOB是LDL的主要載脂蛋白。妊娠期相對較低的HDL與GDM和巨大兒發(fā)生顯著相關(guān); 而相對較高的HDL是兩者的保護因素[10]。研究發(fā)現(xiàn)GDM組中LDL明顯高于對照組，HDL明顯低于對照組，研究還發(fā)現(xiàn)LDL亞型表型B與GDM風(fēng)險增加4倍相關(guān)。Leiva等[11]研究發(fā)現(xiàn)孕婦血漿中LDL濃度隨孕周增加而升高，可能導(dǎo)致胎兒胎盤血管內(nèi)皮功能的改變。本實驗中GDM組血漿中LDL、APOB的濃度水平與正常組比較明顯升高(P<0.05)， HDL、APOA濃度水平與正常組比較明顯降低(P<0.05)，且GDM組血漿中TNF-α、VCAM-1分別與LDL、APOB濃度呈正相關(guān)(P<0.05)，與HDL、APOA濃度呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，而正常組血漿中TNF-α、VCAM-1分別與HDL、LDL、APOA和APOB沒有相關(guān)性(P>0.05)。

綜上所述，通過監(jiān)測妊娠期糖尿病患者血漿和胎盤組織中TNF-α、VCAM-1的表達，結(jié)合FBG、HbA1c、HDL、LDL、APOA及APOB的水平，評估妊娠期糖尿病病情的嚴(yán)重程度和胎兒宮內(nèi)環(huán)境，為胎兒胎盤血管內(nèi)皮功能障礙提供治療方案，改善不良妊娠結(jié)局及降低孕產(chǎn)婦和圍生兒代謝疾病發(fā)生的風(fēng)險。