異維A酸對肽聚糖誘導(dǎo)的SZ95人皮脂腺細(xì)胞相關(guān)炎癥基因表達(dá)的影響

曹珂 侯霄梟 李昕 Christos C.Zouboulis 鞠強

1上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院皮膚科 200127；2Departments of Dermatology,Venereology,Allergology and Immunology,Dessau Medical Center,Brandenburg Medical School Theodore Fontane，Dessau 06847,Germany

尋常痤瘡是毛囊皮脂腺慢性炎癥性疾病，炎癥貫穿痤瘡發(fā)生的始終。痤瘡丙酸桿菌（Propionibacterium acnes）通過活化Toll樣受體2（Toll-like receptor，TLR2）誘導(dǎo)天然免疫反應(yīng)及炎癥因子如白細(xì)胞介素（IL）1α、IL-1β、IL-6、IL-8以及腫瘤壞死因子（TNF）釋放，在痤瘡炎癥進(jìn)程中起核心作用［1］。異維A酸具有抑制皮脂腺脂質(zhì)合成、改善毛囊皮脂腺導(dǎo)管角化、間接抑制P.acnes增殖及抗炎作用，是目前發(fā)現(xiàn)的唯一可以同時影響?zhàn)畀?個主要發(fā)病環(huán)節(jié)的藥物［2］。近來對異維A酸的抗炎作用研究多集中于患者治療后的血清學(xué)檢測或者外周血單核細(xì)胞因子表達(dá)變化［3-5］，體外針對痤瘡發(fā)生中具有核心作用的皮脂腺細(xì)胞免疫和炎癥的調(diào)節(jié)作用特別是對TLR2介導(dǎo)的天然免疫通路影響的相關(guān)研究仍然缺乏。為此，我們探討異維A酸體外對革蘭陽性細(xì)菌（包括P.acnes）壁主要成分肽聚糖誘導(dǎo)的SZ95人皮脂腺細(xì)胞中與痤瘡發(fā)病可能相關(guān)的炎癥因子的表達(dá)釋放和TLR2基因及其下游MyD88（myeloid differentiation factor 88）基因表達(dá)的影響，探討異維A酸在痤瘡治療中抗炎作用的分子機制。

材料與方法

一、試劑和儀器

肽聚糖［美國Sigma公司，純度≥98%（高效液相色譜法測定）］來源于金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁提取物，用磷酸鹽緩沖液（PBS）配制成20 g/L混懸液，分裝后-20℃?zhèn)溆?；異維A酸［美國Sigma公司，貨號R3255，純度≥98%（高效液相色譜法測定）］，溶解于二甲基亞砜（DMSO）中，配制成10-2mol/L，分裝后-20℃?zhèn)溆?，使用時用工作培養(yǎng)基調(diào)至所需濃度，控制DMSO濃度≤1‰（體積分?jǐn)?shù)）。胰酶（美國Gibco公 司），Trizol RNA提 取 試 劑（美 國Invitrogen公司），反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（日本TaKaRa公司），實時熒光定量PCR試劑盒（美國BioRad公司），酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（武漢博士德公司），兔抗人TLR2、MyD88、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）一抗（美國CST公司），辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（美國CST公司），BCA蛋白分析試劑盒（美國Thermo公司），化學(xué)發(fā)光試劑盒（美 國BioRad公 司）。ViiA7實 時PCR儀（Applied Biosystems?，美國Thermo公司），多功能酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）。

二、細(xì)胞培養(yǎng)

SZ95人皮脂腺細(xì)胞由德國Dessau臨床醫(yī)學(xué)中心皮膚科Zouboulis教授饋贈，將經(jīng)30～40次傳代的細(xì)胞用于實驗。用Sebomed基礎(chǔ)培養(yǎng)基（德國Biochrom公司）培養(yǎng)SZ95細(xì)胞，添加10%胎牛血清、5 μg/L表皮生長因子、100 U/ml青霉素、100 mg/L鏈霉素（均來自美國Gibco公司）、1 mmol/L CaCl2（美國Sigma公司）。置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，每兩天更換1次培養(yǎng)液。新鮮配制工作培養(yǎng)基。

三、實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測細(xì)胞中IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α以及TLR2和MyD88 mRNA水平

將SZ95細(xì)胞接種于24孔板（1×105個/孔），培養(yǎng)24 h后分成3組，對照組不做處理，另外兩組分別用20 mg/L肽聚糖［6］單獨（肽聚糖組）或聯(lián)合10-5mol/L異維A酸［7］（共刺激組）共同處理。作用3 h后，胰酶消化收集細(xì)胞，用Trizol試劑提取總RNA，使用TaKaRa試劑盒按照說明書逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，檢測基因及引物序列見表1。以GAPDH作為內(nèi)參照。RT-PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，循環(huán)45次，于60℃時收集數(shù)據(jù)。目的基因mRNA相對表達(dá)量以2-ΔΔCt表示，ΔCt=Ct目的基因-CtGAPDH，ΔΔCt=ΔCt目的基因-ΔCt對照組。

四、ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8以及TNF-α分泌量

將SZ95細(xì)胞接種于24孔板中（1×105個/孔），次日PBS清洗后，分組和處理同上，24 h后收集細(xì)胞上清液，4℃300×g離心后收集上清液分裝，-20℃保存。按照ELISA試劑盒說明書操作檢測，并設(shè)定空白對照孔，酶標(biāo)儀檢測各孔450 nm處吸光度（A值）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣本濃度。

五、Western印跡檢測細(xì)胞中TLR2和MyD88蛋白水平

將SZ95細(xì)胞接種于6孔板中（1×106個/孔），24 h后待細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上時，PBS清洗，分組和處理同上，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，RIPA裂解液提取總蛋白，刮下細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至1.5 ml微量離心管中，冰上裂解30 min，使蛋白充分裂解，10 000×g離心5 min，吸取上清液留存，棄沉淀。BCA試劑盒測定蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度，加入5×十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白上樣緩沖液，煮沸變性。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，封閉液封閉1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。加入兔抗人TLR2、MyD88、GAPDH一抗，4℃孵育過夜，加入羊抗兔二抗室溫孵育2 h，化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)ECL試劑盒顯影成像。

表1 實時熒光定量PCR檢測基因及引物序列（5′-3′）

六、數(shù)據(jù)處理

結(jié)果

一、異維A酸抑制肽聚糖誘導(dǎo)的SZ95細(xì)胞IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α mRNA表達(dá)

見表2。作用3 h后，對照組、肽聚糖組和共刺激組間IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α mRNA表達(dá)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），肽聚糖組上述指標(biāo)均高于對照組（均P＜0.016 7）和共刺激組（均P＜0.016 7）。

二、異維A酸對肽聚糖誘導(dǎo)的SZ95細(xì)胞分泌IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8以及TNF-α蛋白的影響

見表3。作用24 h后，對照組、肽聚糖組和共刺激組間上清液中IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α蛋白水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），肽聚糖組上述指標(biāo)均高于對照組（均P＜0.0167）和共刺激組（均P＜0.016 7）。

三、異維A酸對肽聚糖誘導(dǎo)的SZ95細(xì)胞TLR2和MyD88 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

見圖1。作用3 h后，對照組、肽聚糖組和共刺激組間MyD88 mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=10.17，P＜0.01），肽聚糖組高于對照組（t=4.740，P＜0.016 7）和共刺激組（t=3.298，P＜0.0167）。作用48 h后，3組間MyD88蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，肽聚糖組高于對照組和共刺激組。肽聚糖組TLR2 mRNA（t=7.071，P＜0.016 7）和蛋白表達(dá)水平均明顯高于對照組，而與共刺激組無顯著差異。

表2 異維A酸體外對肽聚糖誘導(dǎo)的SZ95人皮脂腺細(xì)胞IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α mRNA表達(dá)的影響（2-ΔΔCt）

表3 異維A酸體外對肽聚糖誘導(dǎo)的SZ95細(xì)胞分泌IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α蛋白的影響（ng/L）

圖1 異維A酸對肽聚糖誘導(dǎo)的人皮脂腺細(xì)胞Toll樣受體2（TLR2）和MyD88 mRNA（1A、1B）和蛋白（1C）表達(dá)的影響a：P＜0.016 7

討論

研究顯示，痤瘡患者外周血單核細(xì)胞高表達(dá)TLR2［3-4］，且TLR2信號通路介導(dǎo)的天然免疫反應(yīng)在痤瘡發(fā)病中起重要作用。P.acnes通過激活角質(zhì)形成細(xì)胞及皮脂腺細(xì)胞中TLR2及其下游MyD88和核因子κB（NF-κB），誘導(dǎo)相關(guān)因子如IL-1α、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8等表達(dá)上調(diào)和釋放被認(rèn)為是痤瘡發(fā)生發(fā)展的重要信號通路。炎癥發(fā)生與毛囊皮脂腺導(dǎo)管角化、皮脂腺脂質(zhì)分泌等也密切相關(guān)［8-9］。作為病原相關(guān)分子模式，肽聚糖是革蘭陽性細(xì)菌（包括P.acnes）細(xì)菌壁的主要成分，是細(xì)胞表面天然免疫分子TLR2的天然配體和激活劑［10］，常被用于體外痤瘡炎癥模型的刺激物。

異維A酸在皮脂腺細(xì)胞內(nèi)能特異性轉(zhuǎn)化為全反式維A酸，并蓄積在細(xì)胞內(nèi)作用于維A酸受體RAR（retinoic acid receptor）及RXR（retinoid X receptor），獨特的分子作用機制使其可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡而具有強大的抑制皮脂腺分泌活性［2］。異維A酸對痤瘡免疫和炎癥的調(diào)控作用是近年來藥物作用機制的研究熱點，研究顯示其可以抑制中性粒細(xì)胞遷移、溶酶體酶釋放、花生四烯酸代謝及白三烯和一氧化氮等炎癥介質(zhì)生成，并抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-9、MMP-13及MMP-2的活性等［11］；痤瘡患者血清TNF-α、IL-4、IL-17和IFN-γ的基線水平顯著高于對照組，但在接受異維A酸治療后顯著降低［12］；異維A酸也被發(fā)現(xiàn)可以下調(diào)痤瘡患者外周血單核細(xì)胞TLR2的表達(dá)［13］。我們在肽聚糖誘導(dǎo)的人皮脂腺細(xì)胞炎癥模型上發(fā)現(xiàn)，異維A酸明顯下調(diào)IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的表達(dá)，提示異維A酸對炎癥因子具有調(diào)控作用。

異維A酸可以抑制黑素瘤細(xì)胞中NF-κB p65、p50、c-Rel亞基和其他轉(zhuǎn)錄因子如c-fos、活化的轉(zhuǎn)錄因子2和環(huán)腺苷的活化和核轉(zhuǎn)位，從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移以及血管生成［14］。在小鼠肺泡癌Line 1細(xì)胞系中NF-κB的過度活化可以通過全反式維A酸過度激活RAR來抑制［15］。在小鼠脂肪細(xì)胞中，全反式維A酸的抗炎作用與NF-κB途徑中兩個亞基IκB和p65的磷酸化水平降低相關(guān)［16］。RXRα配體抑制NF-κB激活后TNF-α的表達(dá)，從而誘導(dǎo)MCF-7人乳腺癌細(xì)胞的凋亡［17］。全反式維A酸能誘導(dǎo)人胚胎癌細(xì)胞MyD88表達(dá)下調(diào)，而MyD88依賴TLR通路激活NF-κB［18］。全反式維A酸還能通過RARβ調(diào)節(jié)TLR4來改善大鼠和小鼠模型中腸上皮屏障功能［19］。前期研究證實肽聚糖誘導(dǎo)SZ95細(xì)胞MyD88表達(dá)增高［6］，我們進(jìn)一步對相關(guān)信號通路的研究發(fā)現(xiàn)，異維A酸對肽聚糖誘導(dǎo)的人皮脂腺細(xì)胞的TLR2表達(dá)沒有產(chǎn)生影響，但下調(diào)其下游關(guān)鍵基因MyD88的表達(dá)，提示異維A酸可能在皮脂腺細(xì)胞質(zhì)內(nèi)通過某種交聯(lián)直接作用于MyD88而非通過影響細(xì)胞膜上TLR2表達(dá)來發(fā)揮抗炎作用。由于異維A酸在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)通過轉(zhuǎn)化為全反式維A酸作用于維A酸受體而發(fā)揮作用［7］，未來需要進(jìn)一步研究異維A酸下調(diào)MyD88基因表達(dá)的機制。

總之，我們采用肽聚糖體外刺激人皮脂腺細(xì)胞構(gòu)建皮脂腺細(xì)胞炎癥模型，發(fā)現(xiàn)肽聚糖明顯促進(jìn)皮脂腺細(xì)胞分泌與痤瘡發(fā)病可能相關(guān)的炎癥因子，而異維A酸能夠顯著抑制肽聚糖誘導(dǎo)的這些炎癥因子mRNA和蛋白表達(dá)，并且抑制肽聚糖誘導(dǎo)的TLR2下游分子MyD88而非TLR2本身的表達(dá)。異維A酸抑制肽聚糖誘導(dǎo)的天然免疫反應(yīng)可能是其治療痤瘡的機制之一，進(jìn)一步探索異維A酸如何作用于MyD88及其他相關(guān)炎癥基因并影響天然免疫信號通路有助于進(jìn)一步揭示異維A酸的抗炎機制，指導(dǎo)臨床合理用藥。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突