達(dá)拉菲尼對小鼠腎臟缺血再灌注損傷的保護作用

劉舒蘇 陳彥伊 王少俠 于 青

急性腎損傷(AKI)由于發(fā)病率高、死亡率高、治療費用昂貴，已經(jīng)嚴(yán)重威脅人類健康[1]。缺血再灌注損傷(IRI)是AKI的常見原因。IRI的發(fā)生機制復(fù)雜，有研究認(rèn)為受體相互作用蛋白3(RIP3)介導(dǎo)的程序性壞死在IRI中發(fā)揮主要作用[2-3]。敲除RIP3可以保護缺血再灌注誘導(dǎo)的腎損傷[3-4]。達(dá)拉菲尼是一種由美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)用于治療攜帶突變的B-RAFV600E轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的抗腫瘤藥物。近年來研究發(fā)現(xiàn)達(dá)拉菲尼還具有抑制RIP3酶活性的能力[5]。目前有研究報道過達(dá)拉菲尼對缺血再灌注誘導(dǎo)的腦損傷、對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的肝損傷具有保護作用[6-7]，而達(dá)拉菲尼在缺血再灌注誘導(dǎo)的AKI中的作用未見報道。本研究通過建立小鼠IRI模型，旨在探討達(dá)拉菲尼對小鼠IRI的保護作用及其機制。

材料與方法

實驗動物24只SPF級雄性C57BL/6小鼠(上海市第一人民醫(yī)院動物實驗中心提供)，鼠齡6～8周，體質(zhì)量22～25g。

試劑達(dá)拉菲尼(美國MCE公司)；HPMC、Tween80(上海生工)；血清肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)檢測試劑盒(南京建成)； PMSF(威奧生物)；RIPA、BCA試劑盒、SDS-PAGE(碧云天)；ECL發(fā)光液(雅酶)；PVDF膜(millipore)； RIP3、pMLKL、MLKL和羊抗兔二抗(CST)；NGAL、KIM-1、TNF-α和pRIP3抗體(Abcam)；GAPDH抗體(上海生工),特異性引物(上海生工)，免疫組化染色試劑盒(上?；蚩萍?，TUNEL試劑盒(美國sigma)。

實驗動物分組以及IRI模型的建立將24只C57BL/6小鼠隨機分成4組：假手術(shù)組(sham組)、缺血再灌注組(IRI組)、達(dá)拉菲尼組(DAB組)及達(dá)拉菲尼+缺血再灌注組(DAB+IRI組)，每組6只。術(shù)前12h禁食不禁水。達(dá)拉菲尼溶解于含0.5%HPMC和含0.1%Tween80的純水中，其劑量為200 mg/kg。 DAB組以及DAB+IRI組于術(shù)前2h灌胃給予達(dá)拉菲尼200 mg/kg，sham組與IR組則在同樣時間灌胃給予等量助溶劑。造?；静襟E：參照[8]構(gòu)建小鼠IRI模型。小鼠經(jīng)2%戊巴比妥鈉(60 mg/kg)腹腔注射麻醉，固定，使用恒溫板使溫度保持在37℃。取腹部正中切口，小心游離雙側(cè)腎蒂，無創(chuàng)微血管夾夾閉雙側(cè)腎蒂,肉眼觀察到腎臟顏色由鮮紅色變成暗紅色，30 min后松開血管夾，恢復(fù)灌注，肉眼可觀察到腎臟顏色由暗紅色恢復(fù)成鮮紅色，逐層關(guān)腹，于24h后取材。sham組和DAB組僅游離暴露雙側(cè)腎蒂，不夾閉腎蒂。

標(biāo)本采集與處理術(shù)后24h，收集小鼠右心房靜脈血與腎臟標(biāo)本。將靜脈血3 000 r/min離心15 min后取上清，置于-80℃冰箱保存；取左腎的一半置于10%中性福爾馬林固定，留作病理學(xué)檢查，其余腎臟標(biāo)本迅速置于液氮中，-80℃保存，留作Western Blot檢測。

小鼠血清肌酐以及尿素氮檢測按照所購試劑盒說明書取血清進(jìn)行SCr及BUN的檢測。

腎臟組織病理學(xué)腎組織經(jīng)10%中性福爾馬林固定24h，乙醇階梯脫水，石蠟包埋，厚4 μm石蠟切片，常規(guī)HE和PAS染色，每張片子在光學(xué)顯微鏡下選取10個不重疊的視野觀察各組腎臟病理學(xué)變化并且評估腎小管損傷程度。評估標(biāo)準(zhǔn)[9]如下：根據(jù)腎小管上皮細(xì)胞刷狀緣脫落、管腔擴張、細(xì)胞壞死脫落以及管型形成程度分為：0分：無損傷；1分：腎組織損傷≤10%；2分：腎組織損傷11%～25%；3分：腎組織損傷26%～49%；4分：腎組織損傷50%～75%；5分：腎組織損傷>75%。

WesternBlot 取凍存腎臟組織，加入RIPA+PMSF研磨成組織勻漿，12 000 r/min離心15 min,取上清，根據(jù)BCA法測定總蛋白濃度，調(diào)整蛋白樣本濃度為6 μg/μl，煮沸變性10 min；10%聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)分離蛋白，蛋白上樣量為60 μl/孔；300 mA恒流電轉(zhuǎn)膜90 min；5%脫脂牛奶封閉90 min；TBS洗膜3次，每次5 min；分別加入含相應(yīng)抗體的一抗中4℃搖床過夜；次日TBST洗膜3次，每次10 min；加入二抗，室溫?fù)u床孵育1H；TBST洗膜3次，每次10 min；ECL發(fā)光液顯影。

qRT-PCR 取小鼠腎臟組織，用trizol法提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參，cDNA以相應(yīng)特異性引物擴增，引物序列見表1。應(yīng)用PCR儀(applied Biosystems)，按照SYBRGreen熒光定量試劑進(jìn)行擴增，擴增條件：95℃預(yù)變性30s,95℃30s、60℃34s，熱循環(huán)40次。各組mRNA的表達(dá)以GAPDH校正后的相對表達(dá)量表示。

表1 特異性引物序列

GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶；KIM-1：腎損傷分子1；NGAL：中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白；IL-6：白細(xì)胞介素6；TNF-α：腫瘤壞死因子α

免疫組織化學(xué)染色石蠟切片常規(guī)脫蠟復(fù)水，微波修復(fù)抗原，隨后用3%H2O2室溫孵育15 min,以消除內(nèi)源性過氧化物酶，PBS清洗3次；10%山羊血清室溫封閉30 min；滴加小鼠抗TNF-α一抗4 ℃過夜，37 ℃復(fù)溫2h，PBS洗3遍；滴加生物素標(biāo)記的羊抗小鼠二抗37 ℃孵育30 min；DAB顯色，自來水沖洗，蘇木精復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯通透，封片，顯微鏡下觀察。

TUNEL 腎組織固定包埋，切片4 μm厚，根據(jù)TUNEL試劑盒說明書操作。每張切片在400×光學(xué)顯微鏡(美國Leica)下隨機選取10個不連續(xù)的視野觀察，計數(shù)TUNEL陽性的細(xì)胞數(shù)。

統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 22.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

達(dá)拉菲尼改善小鼠腎功能IRI組Scr、BUN明顯高于sham組與DAB組(P<0.05)；DAB+IRI組SCr、BUN較IRI組顯著下降(P<0.05),而sham組與DAB組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(圖1)。

圖1 各組腎功能血清肌酐(A)、尿素氮(B)的變化sham：假手術(shù)組；IRI：缺血再灌注損傷組；DAB：達(dá)拉菲尼組；DAB+IRI：達(dá)拉菲尼預(yù)處理加缺血再灌注損傷組；*:與sham組比較，P<0.05；#:與IRI組比較，P<0.05

達(dá)拉菲尼減輕小鼠腎臟損傷HE以及PAS染色結(jié)果顯示(圖2)，sham組與DAB組腎小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常；IRI組可見腎小管管腔擴張，部分刷狀緣消失；腎小管上皮細(xì)胞腫脹、壞死，部分管腔出現(xiàn)管型。而DAB+IRI組較IRI組腎組織損傷減輕(P<0.05)。

圖2 達(dá)拉菲尼對腎臟組織病理學(xué)的影響(×400)A：假手術(shù)組；B：缺血再灌注損傷(IRI)組；C：達(dá)拉菲尼(DAB)組；D：DAB+IRI組；*:與假手術(shù)組比較，P<0.05；#:與IRI組比較，P<0.05

達(dá)拉菲尼減少小管損傷標(biāo)志物NGAL和KIM-1的蛋白和mRNA水平Western Blot與qRT-PCR結(jié)果均顯示(圖3),與sham相比，IRI組NGAL和KIM-1蛋白和mRNA水平均升高(P<0.05)；與IRI組比較，DAB+IRI組NGAL和KIM-1蛋白和mRNA水平均有不同程度的減少(P<0.05)。

達(dá)拉菲尼減輕炎癥反應(yīng)與sham組相比，IRI組IL-6和TNF-α mRNA含量明顯升高(P均<0.05)，小鼠腎臟免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示IRI組TNF-α陽性細(xì)胞主要分布在小管；與IRI組比較，DAB+IRI組IL-6與TNF-α mRNA水平明顯下降(P均<0.05)，TNF-α陽性細(xì)胞在小管中分布減少。DAB組與sham組間無統(tǒng)計學(xué)差異(圖4)。

圖3 腎小管損傷標(biāo)志物NGAL、KIM-1蛋白和mRNA水平的變化NGAL：中性粒細(xì)胞明膠酶脂質(zhì)運載蛋白；KIM-1：腎損傷分子1；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶；*:與sham組比較，P<0.05；#:與IRI組比較，P<0.05

圖4 腎臟炎癥因子IL-6和TNF-α表達(dá)情況A：PCR檢測IL-6及TNF-α mRNA水平；B：免疫組化檢測TNF-α分布；a：sham組；b：IRI組；c：DAB組；d：DAB+IRI組；sham:假手術(shù)組;IRI:缺血再灌注損傷;DAB:達(dá)拉菲尼;IL-6：白細(xì)胞介素6；TNF-α：腫瘤壞死因子α；*:與sham組比較，P<0.05；#:與IRI組比較，P<0.05

達(dá)拉菲尼減少腎組織程序性壞死與sham組相比，IRI組TUNEL陽性細(xì)胞顯著增加(P<0.05)；與IRI組相比，DAB+IRI組TUNEL陽性細(xì)胞明顯減少(P<0.05)(圖5)。Western Blot結(jié)果顯示(圖6)，IRI組RIP1、RIP3、pRIP3、MLKL和pMLKL相對蛋白含量均明顯高于sham組(P<0.05)；DAB+IRI組RIP3、pRIP3、pMLKL相對蛋白含量較IR組下降(P<0.05)，RIP1和MLKL蛋白水平改變不明顯；sham組與DAB組間各蛋白水平無統(tǒng)計學(xué)差異。

圖5 腎臟組織TUNEL染色(×400)A：假手術(shù)組；B：缺血再灌注損傷(IRI)組；C：達(dá)拉菲尼(DAB)組；D：DAB+IRI組；與sham組比較，DAPI：4,6-二氨基-2-苯基吲哚；TUNEL：末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記；*:與假手術(shù)組比較,P<0.05；#:與IRI組比較，P<0.05

圖6 程序性壞死通路相關(guān)蛋白水平的改變RIP1：受體相互作用蛋白1；RIP3：受體相互作用蛋白3；pRIP3：磷酸化的受體相互作用蛋白3；MLKL：混合系列蛋白激酶復(fù)合物；pMLKL：磷酸化的混合系列蛋白激酶復(fù)合物；sham:假手術(shù)組;IRI:缺血再灌注損傷;DAB:達(dá)拉菲尼;*:與sham組比較，P<0.05；#:與IRI組比較，P<0.05

討 論

腎臟IRI是AKI的常見原因[10]。迄今為止除了腎臟替代治療外AKI尚無有效的治療措施。因此尋找有效的減輕AKI的治療方案成為目前急需解決的問題。IRI的發(fā)生機制復(fù)雜，目前尚未完全闡明。近年來，有學(xué)者認(rèn)為necroptosis在缺血再灌注誘導(dǎo)的腎損傷中發(fā)揮重要作用[11-14]。程序性壞死是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞死亡方式，其與凋亡(apoptosis)不同，并不依賴于caspase通路；通常由死亡受體(如TNF,Fas等)引發(fā)，依賴于RIP3和MLKL[12]。當(dāng)RIP3自身磷酸化后，RIP3迅速募集并且磷酸化其底物MLKL，MLKL隨即轉(zhuǎn)位至細(xì)胞膜上而后使細(xì)胞膜破裂從而啟動程序性壞死。目前來說，程序性壞死仍然沒有一個檢測的金標(biāo)準(zhǔn)。本文中采用TUNEL染色結(jié)合Western Blot檢測RIP3等標(biāo)志蛋白來共同驗證小鼠腎臟組織的程序性壞死。本研究中，IRI組RIP1、RIP3、pRIP3、MLKL、pMLKL蛋白表達(dá)水平明顯高于sham組，同時TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)也較sham組增多，由此可以發(fā)現(xiàn)程序性壞死參與了缺血再灌注誘導(dǎo)的AKI。

腎小管上皮細(xì)胞對IRI比較敏感，因此也是IRI后腎臟損傷的主要部位[15]。NGAL和KIM-1[16]是AKI損傷的標(biāo)志物，在正常腎臟組織中，NGAL和KIM-1表達(dá)很少，而當(dāng)腎臟缺血再灌注損傷后，兩者表達(dá)均顯著升高。本實驗中，sham組與DAB組幾乎檢測不到NGAL和KIM-1,而在IRI組中，NGAL和KIM-1蛋白和mRNA水平較sham組均升高(P<0.05)。IRI后，腎小管上皮細(xì)胞分泌大量炎癥因子，進(jìn)而加重腎組織損傷，引起腎功能異常[9]。本研究結(jié)果顯示，小鼠IRI后腎功能、腎臟病理學(xué)均損傷；同時，我們檢測炎癥因子IL-6和TNF-α mRNA水平，二者均有不同程度地升高；結(jié)合TNF-α免疫組化染色結(jié)果可以證實IRI后腎臟組織內(nèi)也伴隨炎癥因子的釋放。

達(dá)拉菲尼最早是在2013年被FDA批準(zhǔn)用于治療攜帶突變的B-RAFV600E轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者。近年來，研究發(fā)現(xiàn)達(dá)拉菲尼在其他疾病模型中具有治療作用。Li等[7]發(fā)現(xiàn)達(dá)拉菲尼可以減輕對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的肝損傷；Kim等[17]發(fā)現(xiàn)在中毒性表皮溶解壞死(TEN)的體外模型中，達(dá)拉菲尼可以減少細(xì)胞的程序性壞死；Mohsen等[18]發(fā)現(xiàn)達(dá)拉菲尼能減輕結(jié)晶顆粒對腎小管上皮細(xì)胞的毒性；Gruz等[6]發(fā)現(xiàn)達(dá)拉菲尼可減少腦缺血模型的梗死面積。研究表明其機制是由于RIP3的激酶域和B-RAF激酶域相似，因此 B-RAF抑制劑達(dá)拉菲尼可以通過競爭性抑制RIP3,且其抑制RIP3的效能最高[5]。由此，我們猜測達(dá)拉菲尼能否對缺血再灌注誘導(dǎo)的AKI具有保護作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與IRI組比較，DAB+IRI組Scr、BUN降低，腎臟組織病理學(xué)損傷有所改善，腎小管損傷標(biāo)志物NGAL和KIM-1蛋白及mRNA水平均下降，炎癥因子IL-6、TNF-α釋放減少；此外達(dá)拉菲尼預(yù)處理能明顯減少TUNEL陽性的細(xì)胞數(shù)量，降低RIP3、pRIP3、pMLKL蛋白含量；而RIP1和MLKL總蛋白水平變化不明顯。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，RIP3介導(dǎo)的程序性壞死在缺血再灌注誘導(dǎo)的AKI中發(fā)揮重要作用。預(yù)處理達(dá)拉菲尼能保護腎功能，減輕腎臟病理損傷，減少腎小管損傷標(biāo)志物NGAL及KIM-1的含量，抑制炎癥反應(yīng)；同時結(jié)合TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量減少及pRIP3、pMLKL的蛋白水平改變，推測達(dá)拉菲尼可能通過抑制RIP3介導(dǎo)的程序性壞死及后續(xù)的炎癥反應(yīng)從而減輕小鼠腎臟IRI。上述結(jié)果為缺血再灌注誘導(dǎo)的AKI的治療提供了新的方法及理論基礎(chǔ)。