7/8腎切除構建Ⅳ型心腎綜合征模型

保靖夫 佘琴英 竇為娟 盧穎輝 唐 蓉 楊 帆 劉 豐 王 根 劉志紅 鄭春霞

心腎綜合征(CRS)是指心臟或腎臟中任何一個器官損害導致另一器官出現(xiàn)功能障礙的臨床綜合征。其中，由慢性腎臟病(CKD)引起的心血管病變被急性透析質量指導組(ADQI)劃分為Ⅳ型CRS[1]。大量研究顯示，Ⅳ型CRS是CKD患者最常見的死因[2]。因此，Ⅳ型CRS模型構建，對深入研究Ⅳ型CRS的分子病理機制、進而提高其防治水平并改善CKD患者預后具有重要意義。

左心室肥厚(LVH)是Ⅳ型CRS患者最常見的心血管病變，也是患者出現(xiàn)充血型心力衰竭、心律失?；蛉毖孕募〔〉牟±砘A[3-4]。CKD所致LVH是Ⅳ型CRS的主要研究對象。目前大部分相關實驗均采用5/6腎切除制備Ⅳ型CRS模型，但不同實驗卻給出了不同的成模時間(2～5周不等)[5-7]。這提示5/6腎切除構建的Ⅳ型CRS模型的穩(wěn)定性不足，給相關研究帶來不確定因素。本實驗在5/6腎切除 CKD模型的基礎上，采用7/8腎切除構建CKD模型，對其腎功能及心臟的病理生理指標進行動態(tài)評價，以期制作成功率高、穩(wěn)定性強的Ⅳ型CRS模型。

材料與方法

實驗動物清潔級雄性Sprague Dawley (SD)大鼠39只，體重150～160 g，由東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院比較醫(yī)學科提供。

主要試劑異氟烷(河北一品制藥有限公司)；4%中性甲醛溶液(Solarbio)；HE染色試劑盒(Solarbio)；Masson染色試劑盒(Solarbio)；RNA提取試劑盒(Ambion)；qPCR試劑盒(Takara)；麥胚芽凝集素(Wheat Germ Agglutinin,WGA)(Thermo Fisher Scientific)；成纖維細胞因子23(FGF-23) Elisa Kit(Kainos Laboratories)。

主要儀器MSS3小動物麻醉機(任誼生物)；BP2000小動物血壓儀(Visitech Systems)；DXL-D大鼠代謝籠(Asylum Research)；AU680全自動生化分析儀(Beckman Coulter)；Vevo2100高分辨率小動物超聲成像系統(tǒng)(VisualSonics)；DM5000B顯微鏡(Leica Microsystems)。

實驗方法

分組 39只SD大鼠，隨機分為手術組及假手術組，手術組21只、假手術組18只。

CKD模型制備 適應性飼養(yǎng)3d后，手術組以5%異氟烷誘導麻醉、2%異氟烷維持麻醉，俯臥位固定于手術臺上。右側背直肌外側局部備皮，常規(guī)消毒，無菌操作下切開右背側皮膚及各層組織，打開腎脂肪囊以暴露右腎，分離腎上腺并固定右腎，腎上、下極均切除大部，切除范圍見圖1A(大約切除一側腎臟的3/4)，明膠海綿壓迫止血，逐層縫合。術后1周進行第2次手術，同法麻醉，切開左側肋下背直肌外側皮膚及各層組織以暴露左腎，結扎腎蒂，切除左腎(注意不要傷及腎上腺)，逐層縫合。假手術組以同法麻醉后，僅分兩次剝離左腎及右腎脂肪囊，但不切除。術后飼養(yǎng)于室溫24℃、12h光照、12h黑暗的清潔級動物房中，充足供水和標準飼料喂養(yǎng)。

心臟M型超聲檢測 7/8腎切除后1周、3周和5周進行心臟超聲檢測，觀察心臟的動態(tài)變化。異氟烷麻醉后胸骨區(qū)皮膚備皮，Vevo2100測定左室壁厚度、左室內徑、射血分數(shù)、左心室質量等指標。

血壓測定 7/8腎切除后1周、3周和5周利用BP2000進行血壓測定，收集收縮壓及舒張壓數(shù)據(jù)。

腎功能及鈣磷代謝指標測定 7/8腎切除第2次手術后1周、3周和5周將大鼠置于代謝籠24h，收集尿液，麻醉后稱取體重，摘除眼球取血，室溫靜置2h后4 500g，4℃，離心5 min以制備血清。全自動生化分析儀測定尿肌酐、血清肌酐，血清尿素氮，血清鈣，血清磷濃度。并測定血清FGF-23濃度。利用下述公式計算肌酐清除率：

肌酐清除率=(尿液肌酐濃度×每分鐘尿量)/(血清肌酐濃度×體重(g)/100)

心臟重量指數(shù)的測定 7/8腎切除第2次手術后1周、3周和5周各處死一批大鼠(每次均為假手術組6只，手術組5或6只)。麻醉并留取血液后，左心室灌注生理鹽水，洗凈淤血后取出心臟，修剪多余組織并用濾紙吸干其表面水分。稱量心重，計算心重/體重。利用超聲獲得的左心室質量，計算左心室重/心重及左心室重/體重。

心臟及腎臟病理 沿垂直于腎臟長軸的方向橫斷腎臟，取部分放入4%中性甲醛中固定，制備石蠟切片，用Masson染色試劑盒染色后200倍鏡下拍照，觀察纖維化情況。心臟放入4%中性甲醛中固定，制備石蠟切片，用HE染色試劑盒染色后8倍鏡下拍照，觀察心肌肥厚情況；用Masson染色試劑盒染色后200倍鏡下拍照，觀察纖維化情況。

心肌肥厚指標的測定 取左心室部分約30mg組織，RNA提取試劑盒提取總RNA?？俁NA進行二步法qPCR，以18S為參比基因對心房鈉尿肽(ANP)及腦尿鈉肽(BNP)進行相對定量。PCR引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

統(tǒng)計學方法應用Graphpad Prism 8軟件進行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，兩組之間差異采用t檢驗或Mann Whitney檢驗分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一般情況手術組第1次手術后全部存活，第2次手術后1周內共死亡4只，存活率81%。其中2只死亡于術后第3天，1只死亡于術后第5天，1只死亡于術后第6天。假手術組全部存活。第2次手術后1、3、5周觀察大鼠(圖1B)，可見假手術組皮毛致密、整齊而有光澤，反應速度正常，進食進水正常；手術組在7/8 腎切除后1周尚無明顯異常，精神尚可，活動正常，但7/8 腎切除后3周至5周逐漸出現(xiàn)不同程度皮毛蓬松、枯槁無光澤，精神不振，食欲減退。

CKD模型的腎臟表型7/8腎切除后1、3、5周，可見大鼠體重增加緩慢，與假手術組的差異逐漸

圖1 腎臟切除示意及觀察時間安排A：腎切除范圍示意圖，虛線外為5/6 腎切除切除腎組織范圍，實線外為7/8 腎切除切除腎組織范圍；B：術后觀察時間及觀察內容

增大(圖2A)。手術組血清肌酐在7/8 腎切除后1周時極度升高、3周時有所降低，但在第5周又出現(xiàn)上升的趨勢(圖2B)。對應的肌酐清除率亦出現(xiàn)降低、升高、再降低的趨勢(圖2C)。手術組血尿素氮則呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(圖2D) 。手術組出現(xiàn)明顯的高血壓，收縮壓及舒張壓均表現(xiàn)出逐漸上升的趨勢(圖2E、F)。與假手術組相比，手術組血清鈣呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，血清磷呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢。FGF23作為一重要的鈣磷調節(jié)分子[8]，亦因高磷血癥而呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(表2)。腎組織Masson染色可發(fā)現(xiàn)，手術組在7/8 腎切除后1周即有部分腎小管擴張，術后第3周擴張的腎小管增多，術后第5周出現(xiàn)明顯的腎間質纖維化(圖2G)。上述結果表明7/8 腎切除后5周，CKD模型構建成功。

圖2 慢性腎臟病模型的腎臟表型A：手術組體重增長緩慢，與假手術組體重差距逐漸增加；B：手術組血清肌酐呈現(xiàn)高-低-高趨勢；C：手術組肌酐清除率呈現(xiàn)低-高-低趨勢；D：手術組血清尿素氮呈現(xiàn)增高趨勢；E～F：手術組收縮壓及舒張壓呈現(xiàn)增高趨勢；G：手術組腎小管擴張并逐漸出現(xiàn)間質纖維化；與同周假手術組比較；**：P<0.01

表2 術后血清鈣、磷及成纖維細胞生長因子23濃度

*及**均為與同周假手術組比較；*：P<0.05；**：P<0.01

CKD模型的心臟表型7/8腎切除后1、3、5周進行心臟超聲觀察，可見大鼠在7/8 腎切除后第5周出現(xiàn)明顯的心肌壁厚度增加(圖3A)。M型超聲顯示舒張期室間隔厚度(IVS;d)及舒張期左心室后壁厚度(LVPW;d)均呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，并在7/8腎切除后第5周出現(xiàn)明顯的肥厚(圖3C、D)；假手術組與手術組間的舒張期左心室內徑(LVID;d) 在術后第5周則未出現(xiàn)明顯差異，提示7/8腎切除后 5周大鼠心臟呈現(xiàn)向心性肥厚(圖3E)。具體超聲數(shù)據(jù)可見表3。與假手術組相比，手術組心重/體重、左心室重/心重及左心室重/體重在術后第5周均有顯著差異(圖3F～H) 。上述結果表明7/8 腎切除后第5周大鼠出現(xiàn)明顯的左心室向心性肥厚。

圖3 慢性腎臟病模型的心臟表型IVS;d：舒張期室間隔厚度；LVPW;d：舒張期左心室后壁厚度；LVID;d：舒張期左心室內徑 A～B：手術組在7/8腎切除后第5周出現(xiàn)LVH；C～D：手術組在7/8腎切除后第5周出現(xiàn)的IVS;d及LVPW;d明顯增加；E：手術組與假手術組的LVID;d無顯著差別；F～H：手術組術后第5周出現(xiàn)心重/體重、左心室重/心重及左心室重/體重顯著增加；*：P<0.05；**：P<0.01

表3 超聲心動圖結果

IVS;d：舒張期室間隔厚度；LVPW;d：舒張期左心室后壁厚度；LVID;d：舒張期左心室內徑 IVS;s：收縮期室間隔厚度；LVPW;s：收縮期左心室后壁厚度；LVID;s：收縮期左心室內徑；與同周假手術組比較；*：P<0.05；**：P<0.01

CKD所致LVH的病理學性質由于7/8 腎切除后第5周大鼠出現(xiàn)明顯的心肌肥厚，因此選擇第5周的大鼠心肌組織進行進一步觀察。心臟橫截面切片觀察顯示明顯的左心室肥厚(圖3B)。WGA染色可見，相較于假手術組，手術組出現(xiàn)明顯的心肌細胞橫截面積增加，說明7/8腎切除可直接導致心肌細胞的肥大，這也是心肌肥厚的組織學基礎(圖4A、B)。Masson染色后觀察切片，假手術組心肌細胞分布均勻且心肌間質無明顯纖維化，而手術組則出現(xiàn)心肌間質膠原沉積、纖維化，心肌組織結構紊亂(圖4C)。實時定量PCR顯示手術組心肌組織肥厚指標ANP及BNP出現(xiàn)明顯上調 (圖4D)。上述結果表明7/8腎切除后第5周大鼠Ⅳ型CRS模型構建成功。

圖4 7/8腎切除后第5周大鼠出現(xiàn)病理性LVHANP：心房鈉尿肽；BNP：腦尿納肽；LVH：左心室肥厚；A～B：手術組在7/8腎切除后第5周出現(xiàn)明顯的心肌細胞橫截面積增加；C：手術組在7/8腎切除后第5周出現(xiàn)明顯心肌結構紊亂、間質纖維化；D：手術組在7/8腎切除后第5周心肌組織出現(xiàn)明顯的ANP、BNP表達上調增加；**：P<0.01

討 論

目前認為CKD患者的心血管并發(fā)癥是影響其預后的重要因素[9]，甚至輕度腎功能異常也可顯著增加心血管疾病的風險[10]。ADQI將慢性原發(fā)性腎臟疾病造成心血管功能異常的CRS劃分為Ⅳ型CRS[1]。Ⅳ型CRS 患者的心肌細胞將不可避免地出現(xiàn)肥大及凋亡，由此導致心肌肥厚、纖維化甚至心力衰竭[11]。Ⅳ型CRS最主要的病理特征是LVH，大約65%的透析前患者出現(xiàn)LVH[12]，透析超過5年的患者幾乎都伴有LVH[13-14]。LVH主要由血液動力學因素及非血液動力學因素引發(fā)，而后者又包括神經-內分泌紊亂、炎癥等[15]。非血液動力學因素中涉及極為復雜的分子調控網絡，而目前對其了解極為有限。為進一步研究Ⅳ型CRS，動物模型的構建顯得極為必要。

目前實驗多采用SD大鼠及5/6 腎切除來構建Ⅳ型CRS模型，然而模型構建時間、是否需要其他輔助成模手段均無一致定論。不同研究組給出的成模時間均有不同，如術后2周[5]、4周[7]或5周[16]均有報道模型成功。一些研究人員術后采用高磷飼料喂養(yǎng)[17]，但也有采用標準飼料喂養(yǎng)[18]，卻同樣可出現(xiàn)LVH。我們在預實驗時制作了SD大鼠5/6腎切除 CKD模型，發(fā)現(xiàn)5/6 腎切除后第5周直至第10周，與假手術組相比，手術組雖然出現(xiàn)血清肌酐升高，左心室心肌肥厚的形態(tài)學指標(心臟超聲及左心室重/體重)并未出現(xiàn)統(tǒng)計學差異(數(shù)據(jù)未顯示)。這些均說明5/6腎切除法制備Ⅳ型CRS模型的可靠性較低。

最近，Shi等[19]利用129SV小鼠采取一次性順鉑腹腔注射配合高磷飲食成功地構建了急性腎損傷(AKI)-CKD模型，并在造模后20周觀察到了明顯的心肌肥厚。該造模方法較為簡便，且存活率在80%以上，然而此法是否可用于大鼠仍不清楚，因此我們仍然選擇腎切除制備大鼠Ⅳ型CRS模型。5/6 腎切除法制備Ⅳ型CRS模型的可靠性較低，是否可通過增加腎組織切除量加重腎損傷，最終制備穩(wěn)定的Ⅳ型CRS模型？

7/8腎切除后，大鼠死亡集中于術后3天到第7天，提示手術并發(fā)癥(如出血、麻醉過深等)致死的可能性較低，腎切除所致急性腎損傷可能是大鼠死亡的主要原因。7/8腎切除的死亡也與術者操作水平有關，因此改善手術環(huán)境、提高操作水平等可能會進一步提升7/8腎切除大鼠的存活率。7/8腎切除后，手術組腎單位數(shù)目大幅度降低，出現(xiàn)血尿素氮和血清肌酐明顯升高，肌酐清除率降低，并伴有高血壓、高磷血癥、一定程度的低血鈣及高FGF-23血癥，其中高FGF-23血癥常由腎功能受損后導致的鈣磷代謝紊亂所致，并可直接導致LVH[5]，上述結果表明CKD模型構建成功。同時，手術組在7/8腎切除后5周心肌壁厚度、心重/體重、左心室重/心重及左心室重/體重均出現(xiàn)顯著增高，同時出現(xiàn)心肌細胞肥大、心肌間質纖維化及肥厚指標ANP、BNP表達上調。因此，7/8腎切除后5周手術組不僅可出現(xiàn)明顯CKD表現(xiàn)，尚伴有明顯的心肌肥厚，表明Ⅳ型CRS構建成功。

綜上所述，大鼠7/8腎切除能在無需高磷飼料喂養(yǎng)的情況下在較短時間內形成穩(wěn)定的Ⅳ型CRS模型，這對Ⅳ型CRS的機制研究及藥物開發(fā)均有重要意義。