黃精多糖通過調(diào)節(jié)JAK2/STAT3通路改善異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌肥厚

方歡樂，李瑤瑤，陳晶晶，安 昌，陳渝婷，楊永華

0 引言

心血管疾病(Cardiovascular diseases，CVD)如高血壓、冠心病是危害人類健康的首要疾病[1-2]。心肌肥厚導(dǎo)致心臟重塑是引發(fā)多種CVD發(fā)生率升高的重要因素。因此，臨床治療心血管疾病的重點(diǎn)是減緩甚至逆轉(zhuǎn)心臟重塑，這對(duì)于改善患者的長(zhǎng)期生存至關(guān)重要[3-4]。酪氨酸蛋白激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(Janus activated kinase signal transducer and activator of transcription，JAK2/STAT3)信號(hào)通路是心肌細(xì)胞增殖、分化的重要通路，其活性的改變與心肌肥大有著密切關(guān)聯(lián)[5-6]。黃精為百合科植物滇黃精或多花黃精的干燥根莖，其主要活性成分為黃精多糖(Polygonatumsibiricum polysaccharides，PSP)。研究表明，黃精多糖藥用價(jià)值非常高，具有抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抑菌、抗炎等活性[5]。近年研究表明，黃精多糖干預(yù)可抑制炎癥因子的釋放，減輕心肌損傷程度，改善心肌梗死[7]。黃精多糖可清除心肌組織中過量的氧自由基，提高抗氧化酶的活性[8]。本課題前期實(shí)驗(yàn)研究表明，黃精多糖可通過抗炎調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附分子ICAM-1和VCAM-1蛋白表達(dá)，改善小鼠心室重塑[9]。但異丙腎上腺素(Isoproterenol,ISO)誘導(dǎo)心肌肥厚過程中活化JAK2/STAT3通路，黃精多糖是否通過阻斷JAK2/STAT3通路保護(hù)心肌組織，目前尚未見報(bào)道。本研究通過給大鼠皮下注射異丙腎上腺素制作心肌肥厚模型，觀察黃精多糖抑制JAK2/STAT3通路改善心肌肥厚的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 60只SPF級(jí)SD雄性大鼠，體重(180±20)g，購(gòu)買于中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證編號(hào)：SCXK(軍)2017-0007。

1.1.2 藥物與試劑 黃精多糖(多糖含量≥90.0%)，南京景竹生物科技公司。普萘洛爾片，天津力生制藥股份有限公司，批號(hào)：20141015；ISO，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：150513；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化脂質(zhì)(LPO)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)試劑盒由南京建成生物工程研究所提供，生產(chǎn)批號(hào)：1710150、1710181、1710151；抗體JAK2、P-JAK2、STAT3、P-STAT3 由Abcam公司提供。

1.1.3 儀器 MK3全自動(dòng)酶標(biāo)儀(賽默飛世爾公司)；XSP-2C數(shù)碼生物顯微鏡(深圳市西尼科光學(xué)儀器有限公司)；垂直電泳槽、濕電轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad伯樂，USA)；Tanon-5200全自動(dòng)熒光/化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，上海天能科技有限公司。

1.2 動(dòng)物模型及分組給藥 異丙腎上腺素背部皮下注射5 mg/(kg · d)，1次/d，連續(xù)給藥14 d，建立大鼠的心肌肥厚模型[10]。取SD雄性大鼠60只，隨機(jī)分為6組，即對(duì)照組，模型組(ISO組)，黃精多糖低、中、高劑量組，普萘洛爾組，每組10只。對(duì)照組每日1次皮下注射0.9% NaCl，模型組及其他組溶解ISO(5 mg/kg)在生理鹽水中，皮下注射連續(xù)給藥14 d造心肌肥厚模型；造模后第2天開始，黃精多糖低、中、高劑量組分別按照200、400、800 mg/kg每天灌胃給藥，普萘洛爾組150 mg/kg灌胃給藥。給藥0.5 h后皮下注射ISO，連續(xù)給藥治療1個(gè)月。大鼠的體重每4天記錄1次。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1 d禁食，自由飲水。

1.3 大鼠心臟重量參數(shù)測(cè)定 稱量大鼠體重(BW)，麻醉，腹主動(dòng)脈取血后，取出心臟，PBS清洗殘血，濾紙吸干后稱量全心重(HM)，計(jì)算心重指數(shù)(Heart mass index，HMI=HW/BW)。分離左心室，稱取重量，計(jì)算左室重量指數(shù)(Left ventricular mass index，LVMI)，即左心室重量(LVW)與體重(BW)的比值(LVW/BW)。

1.4 大鼠心臟標(biāo)本形態(tài)學(xué)檢測(cè) 取大鼠心臟標(biāo)本，切取左心室約50 mg，放置在10%甲醛溶液中固定，24 h后取出心臟用蒸餾水反復(fù)沖洗，梯度乙醇溶液脫水后過夜，用石蠟包埋、切片進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色。數(shù)碼生物顯微鏡下觀察大鼠心肌組織病理學(xué)改變、照相分析。

1.5 大鼠血清生化指標(biāo)檢測(cè) 大鼠用20%烏拉坦溶液麻醉，腹主動(dòng)脈取血，EP管收集血液5 ml左右。使用離心機(jī)3 600 r/min離心20 min，取上清液，按照試劑盒說明檢測(cè)氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、MDA、GSH-Px、LPO的含量。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定炎性指標(biāo)TNF-α、IL-6濃度 取血，離心方法參照“1.5”項(xiàng)。采用雙抗體夾心ABC-ELISA法測(cè)定TNF-α、IL-6濃度，檢測(cè)450 nm處OD值，實(shí)驗(yàn)操作步驟按試劑盒說明書方法進(jìn)行。

1.7 Western blot法測(cè)定心臟組織中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3的表達(dá)情況 取各組部分心臟組織加入裂解液，于冰浴上進(jìn)行勻漿裂解，12 000 r/min低溫離心15 min。取上清液BCA法測(cè)定蛋白濃度。應(yīng)用8%PAGE上膠分離上樣蛋白，濕法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂牛奶37 ℃封閉膜45 min。取出分別加入特異性抗體JAK2、STAT3(1∶200)、p-JAK2、p-STAT3(1∶500)、GAPDH(1∶5 000)，孵育1 h后4 ℃過夜。次日TBST洗膜，加入二抗，孵育45 min后洗膜。加化學(xué)發(fā)光試劑孵育，暗室發(fā)光。照片用Gel-Pro Analyzer 4.0 software分析。

2 結(jié)果

2.1 黃精多糖對(duì)心肌肥厚大鼠心臟質(zhì)量指數(shù)和左心室指數(shù)的影響 ISO皮下注射致大鼠心肌肥厚，結(jié)果顯示，模型組大鼠HMI、LVMI較對(duì)照組顯著增加(P<0.01)，表明模型建立成功。用藥物治療1個(gè)月后，與模型組比較，高劑量黃精多糖和普萘洛爾可顯著抑制大鼠心臟指數(shù)及左心室指數(shù)的增加(P<0.05，P<0.01)。見表1。

表1 黃精多糖對(duì)心肌肥厚大鼠心臟質(zhì)量指數(shù)和左心室指數(shù)的影響

注：與模型組比較，*P<0.05，* *P<0.01

2.2 黃精多糖對(duì)心肌肥厚大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)的影響 大鼠心肌組織HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)正常、排列緊密。與對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌細(xì)胞增大、間隙增寬。藥物治療后，黃精多糖中、高劑量組及普萘洛爾組心肌細(xì)胞形態(tài)相對(duì)正常，細(xì)胞排列緊密(與對(duì)照組比較)，表明藥物具有保護(hù)受損的心肌細(xì)胞的作用。見圖1。

2.3 黃精多糖對(duì)心肌肥厚大鼠血液中SOD、GSH-PX、MDA、LPO 活性的影響 由表2可知，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血液中脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA、LPO含量明顯增加，抗氧化產(chǎn)物SOD、GSH-PX含量顯著下降(P<0.05，P<0.01)。與模型組比較，黃精多糖中劑量組MDA、LPO含量降低(P<0.05)，中劑量組GSH-PX含量升高(P<0.05)，高劑量組及普萘洛爾組SOD、GSH-PX含量升高(P<0.05，P<0.01)，中、高劑量組及普萘洛爾組MDA、LPO含量降低(P<0.05，P<0.01)。

圖1 各組大鼠心肌組織光鏡下病理形態(tài)學(xué)改變(HE，400×)

表2 黃精多糖對(duì)心肌肥厚大鼠血液中SOD、GSH-PX、MDA、LPO 活性影響

注：與模型組比較，*P<0.05，* *P<0.01

2.4 黃精多糖對(duì)心肌肥厚大鼠血TNF-α、IL-6含量的影響 模型組大鼠血TNF-α、IL-6含量高于對(duì)照組(P<0.01)。與模型組比較，黃精多糖中、高劑量組及普萘洛爾組大鼠血TNF-α、IL-6含量降低(P<0.01，P<0.05)。見表3。

表3 黃精多糖對(duì)心肌肥厚大鼠血液中TNF-α、IL-6含量的影響

注：與模型組比較，*P<0.05，* *P<0.01

2.5 黃精多糖對(duì)心肌肥厚大鼠心臟組織中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)的影響 白細(xì)胞介素(IL)-6可使得JAK2磷酸化而激活，磷酸化的JAK2催化其下游STAT3發(fā)生磷酸化后，引發(fā)心肌肥厚[11]。本研究進(jìn)一步檢測(cè)了心肌肥厚大鼠心臟組織中JAK2、p-JAK2 和STAT3、p-STAT3 蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)提高(P<0.05，P<0.01)。與模型組比較，黃精多糖中、高劑量組及普萘洛爾組p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05，P<0.01)。見圖2。

3 討論

臨床研究表明，心肌肥厚是引起心血管疾病發(fā)生率顯著升高的重要危險(xiǎn)因素，早期的心肌肥大具有一定的代償意義，但持續(xù)加重的心肌肥大終將導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生[11-12]。異丙腎上腺素通過激活動(dòng)物腎上腺素受體促進(jìn)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，刺激心肌細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白的合成及表達(dá)，引起膠原沉積出現(xiàn)心肌肥厚。模擬這一失代償過程，可觀察到心臟體積增大、心肌細(xì)胞肥大、氧化代謝異常，心肌中促炎因子表達(dá)增加[13-14]。促炎因子如TNF-α、IL-6等參與心肌肥厚的發(fā)生[15]，調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、生長(zhǎng)及代謝等。

圖2 各組大鼠心臟組織中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 蛋白表達(dá)

炎癥可進(jìn)一步引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷、活性氧產(chǎn)生，導(dǎo)致機(jī)體氧化平衡系統(tǒng)失衡，活性氧清除功能降低，使氧自由基大量堆積[16]。近年研究表明，黃精多糖可減輕炎癥反應(yīng)、提高氧自由基清除能力，對(duì)急性心肌梗死模型大鼠心肌損傷有保護(hù)作用[17]。本研究顯示，與對(duì)照組比較，異丙腎上腺素引發(fā)的心臟肥厚過程中心臟體積增大、心體重比增高，HE染色的心肌細(xì)胞肥大，抗氧化指標(biāo)SOD、GSH-PX減少、脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA、LPO增多，炎癥標(biāo)志物IL-6、TNF-α含量明顯升高。治療1個(gè)月后，與模型組比較，黃精多糖中、高劑量組各項(xiàng)指標(biāo)均得到改善，表明黃精多糖具有一定的抗氧化抗炎、改善心肌肥大作用。

心肌肥厚是慢性心力衰竭主要的病理改變之一，其中 JAK/STAT信號(hào)通路是引起心力衰竭心肌重塑改變的重要發(fā)病機(jī)制，血清 JAK水平是反映心肌肥厚、心肌重塑程度的指標(biāo)[18]。JAK/STAT途徑主要在心肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，是連接細(xì)胞表面受體到細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄的一種直接信號(hào)傳導(dǎo)途徑。在導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大的各種病理情況下，該途徑可被一些細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)因子激活，在心肌肥厚形成過程中具有重要意義[19-20]。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組心肌細(xì)胞中p-JAK2、p-STAT3表達(dá)上調(diào)；黃精多糖中、高劑量組可以抑制異丙腎上腺素引起的p-JAK2、p-STAT3表達(dá)增加，提示黃精多糖可能通過抑制JAK2/STAT3信號(hào)傳導(dǎo)通路的激活來減輕心肌肥厚程度和炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生保護(hù)心臟作用。

綜上所述，黃精多糖對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌肥厚有一定保護(hù)作用。