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    利用蛋白組學(xué)和化學(xué)計量學(xué)區(qū)分海捕和養(yǎng)殖的中國對蝦

    2019-05-21 11:59:46胡玲萍張鴻偉薛長湖張曉梅
    食品科學(xué) 2019年8期
    關(guān)鍵詞:對蝦區(qū)分標(biāo)志物

    胡玲萍,張鴻偉,,張 峰,林 超,薛長湖,*,張曉梅,*

    (1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 青島 266003;2.山東出入境檢驗檢疫技術(shù)中心,山東 青島 266002;3.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院,北京 100176)

    中國對蝦(Fenneropenaeus chinensis)又稱東方對蝦,隸屬于節(jié)肢動物門、甲殼綱、十足目、對蝦科、對蝦屬,是我國重要的經(jīng)濟養(yǎng)殖蝦類之一[1]。中國對蝦主要分布于我國黃海和渤海海域[2],不僅產(chǎn)量豐富,而且具有營養(yǎng)價值高、保健功能強等特點,深受廣大消費者的青睞[3-5]。中國對蝦是中國和朝鮮半島重要的水產(chǎn)品之一[6],同時也是我國蝦類出口的主要產(chǎn)品[7]。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖的發(fā)展,中國對蝦發(fā)揮著越來越重要的作用。但是養(yǎng)殖和海捕的中國對蝦在風(fēng)味、口感和商業(yè)價值上存在一定差異。海捕中國對蝦較養(yǎng)殖中國對蝦鮮味濃,口感也有所不同[8]。海捕中國對蝦的價格也明顯高于養(yǎng)殖中國對蝦的價格,為謀求利益,養(yǎng)殖對蝦代替海捕對蝦的現(xiàn)象時常發(fā)生[9-10]。因此有必要開發(fā)一種簡便、快速、準(zhǔn)確區(qū)分海捕和養(yǎng)殖中國對蝦的方法。

    目前,國內(nèi)外已有一些用于區(qū)分海捕和養(yǎng)殖對蝦的方法。20世紀(jì)80年代研究者以感官方法和解剖對比區(qū)分海捕和養(yǎng)殖的中國對蝦[11],但對于普通消費者來說很難通過感官方法區(qū)分海捕和養(yǎng)殖的中國對蝦。林洪等[12]研究表明肌動球蛋白溶解度、ATPase活性、疏水性可作為鑒別海捕對蝦和養(yǎng)殖對蝦的指標(biāo)。薛長湖等[13]研究表明對蝦肌肉蒸煮后的失水率和脂肪酸中C18:2ω6含量可用于區(qū)分海捕和養(yǎng)殖中國對蝦。Ortea等[14]通過砷、鉛、鉻等重金屬等多元統(tǒng)計分析區(qū)分海捕和養(yǎng)殖的對蝦。Kim等[15]利用穩(wěn)定性同位素性δ13C和δ15N區(qū)分海捕和養(yǎng)殖的對蝦。

    與上述方法相比,以質(zhì)譜為基礎(chǔ)的蛋白組學(xué)方法在穩(wěn)健性、靈敏度、選擇性、多路復(fù)用和高通量方面具有明顯的優(yōu)勢,迅速發(fā)展成為一種強有力的食品認(rèn)證工具,這一點從不斷增加的物種識別、食品摻假和食品生產(chǎn)方法(野生/養(yǎng)殖)的研究中得到證明[16-19]。到目前為止,使用蛋白組學(xué)方法區(qū)分海捕和養(yǎng)殖對蝦的研究仍然受限。但隨著定量蛋白組學(xué)和質(zhì)譜的發(fā)展,采集所有理論碎片離子(sequential window acquisition of all theoretical fragment ions,SWATH)技術(shù)應(yīng)運而生。SWATH蛋白組學(xué)技術(shù)作為一種無標(biāo)記的蛋白定量方法,可以同時對上千種蛋白進行平行量化[20],為復(fù)雜食品中蛋白定量提供更高的精確度和重現(xiàn)性[21-22]。由于組學(xué)研究通常涉及大量的樣本和變量,因此有必要采用化學(xué)計量學(xué)方法提取有效信息并建立樣本之間的關(guān)系[23]。

    本研究以超高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜(ultra-high performance liquid chromatography coupled to quadrupole time of flight-mass spectrometry,UPLC-Q TOF-MS)為分析工具,運用比較定量蛋白組學(xué)結(jié)合化學(xué)計量學(xué)尋找區(qū)分海捕和養(yǎng)殖中國對蝦的蛋白生物標(biāo)志物,為區(qū)分海捕和養(yǎng)殖中國對蝦提供一定的技術(shù)支持。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    中國對蝦由中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院提供,經(jīng)鑒定為中國對蝦(Fenneropenaeus chinensis)。

    測序級胰蛋白酶(比活力18 523 U/mg) 美國Promega公司;質(zhì)譜級甲酸(純度>98%) 瑞士Fluka公司;乙腈 美國Fisher公司;碘代乙酰胺 美國Sigma公司;二硫蘇糖醇、尿素、碳酸氫銨、鹽酸 國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    AB SCIEX Triple TOF? 5600 MS儀 美國SCIEX公司;Nexera X2 30A UPLC儀 日本島津公司;MQS50001型超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司;HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司;AB135-S型精密電子分析天平 瑞士Mettler-Toledo公司。

    1.3 方法

    1.3.1 中國對蝦蛋白提取和酶解

    海捕和養(yǎng)殖的中國對蝦分別取6 個完整個體,用分析磨床在液氮浴中研磨成粉末。各取1 g研磨成粉末的樣品,分別用10 mL蛋白提取液(8 mol/L尿素,50 mmol/L NH4HCO3溶液),垂直振蕩30 min提取蛋白,高速低溫離心20 min(4 ℃、15 000 r/min)。參考Wi?niewski[24]和Mi Rui[25]等方法,各取上清液100 μL,分別加入2 μL 1 mol/L二硫基蘇糖醇在60 ℃反應(yīng)1 h。取5 μL 1 mol/L現(xiàn)配的碘代乙酰胺,加入到已經(jīng)冷卻至室溫的上述反應(yīng)液中,室溫避光反應(yīng)1 h,實驗重復(fù)3 次。采用10 kDa截留分子質(zhì)量超濾離心管在15 000 r/min離心超濾20 min后,每次用200 μL 50 mmol/L NH4HCO3溶液洗滌膜上層蛋白,共洗滌3 次。最后在膜上層加入200 μL 50 mmol/L NH4HCO3溶液作為緩沖液并按酶和底物比1∶50將胰蛋白酶溶液加入到上述蛋白溶液中,混勻并37 ℃酶解16 h,使酶解徹底。超濾離心管15 000 r/min離心超濾20 min,收集下層的肽段濾液。

    1.3.2 UPLC條件

    色譜柱:安捷倫AdvanceBio Peptide Map column(150 mm×2.1 mm,130 ?,2.7 μm);柱溫:40 ℃。流動相A:0.1%甲酸-乙腈,流動相B:0.1%甲酸溶液;流速:0.25 mL/min;進樣量:30 μL;進樣時間:46 min;流動相梯度:0~2 min(95% B),2~17 min(95%~80% B),27~37 min(85%~65% B),37~39 min(65%~20% B),39~42 min(20%~95% B),42~46 min(95% B)。

    1.3.3 MS條件

    采用正離子模式,噴霧電壓5 500 V,電子電離源,掃描范圍350~1 500 Da,正離子反應(yīng)模式,霧化氣GS1 35 psi,輔助加熱器GS2 45 psi,氣簾氣壓35 psi,噴霧電壓5 500 eV,離子源溫度500 ℃,解簇電壓100 V,碰撞能量10 eV,信號強度閾值2×104。

    樣品SWATH采集:建立SWATH采集方法。在DDA模式下,在m/z 400~1 250范圍內(nèi)對混合多肽進行數(shù)據(jù)采集,3 次平行實驗,PeakView 2.0處理獲得子離子m/z和信號強度后,SWATH可變窗口計算器計算SWATH-MS動態(tài)采集窗口大小。其參數(shù)設(shè)置:目標(biāo)窗口數(shù)量60 個,最小m/z 400,最大m/z 1 250,窗口重疊1 Da,CES 15,計算得數(shù)據(jù)采集系列窗口。高靈敏度模式下采集MS2譜圖,用SWATH-MSALL方法對海捕和養(yǎng)殖中國對蝦肽段樣品在m/z 400~1 250范圍進行SWATH數(shù)據(jù)采集,每組設(shè)置6 個生物學(xué)重復(fù),每一樣品重復(fù)采集SWATH數(shù)據(jù)2 次,采用隨機數(shù)進樣。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    利用ProteinPilotTM軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析,選用NCBI的中國對蝦數(shù)據(jù)庫進行數(shù)據(jù)檢索。ProteinPilot軟件參數(shù)設(shè)置如下:搜庫方法:Paragon method;酶切:胰蛋白酶;儀器:TripleTOF 5600;物種:無;ID Focus:Amino acid Subtitutions,Biological modifications;檢索類型:ID;檢測蛋白質(zhì)閾值(Unused Protscore(conf)):大于0.05%(10.0%);提交錯誤發(fā)現(xiàn)率分析報告。

    用PeakView和SWATH Micro App對采集的海捕和養(yǎng)殖中國對蝦SWATH數(shù)據(jù)進行處理,對保留時間進行校正后,從鑒定蛋白庫中提取可被SWATH定量的蛋白及其對應(yīng)的肽段和碎片離子信息。SWATH數(shù)據(jù)處理參數(shù)設(shè)置:每一蛋白至少6 條可定量多肽,每一多肽至少6 個碎片離子。

    用MarkerViewTM軟件對樣品進行歸一化處理,設(shè)置:最小保留時間2 min,最大保留時間40 min;設(shè)置數(shù)據(jù)組的分類標(biāo)志。

    用SMICA軟件對歸一化后的數(shù)據(jù)進行主成分分析(principal component analysis,PCA)和正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA),選取Pareto方法。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 UPLC-Q TOF-MS結(jié)果

    圖 1 中國對蝦有代表性的總離子流色譜圖Fig. 1 Representative total ion chromatogram (TIC) of F. chinensis

    SWAHT-MS可采用穩(wěn)健和完整的方式進行比較定量分析[26]。對海捕和養(yǎng)殖的中國對蝦樣本進行UPLC-Q TOF-MS檢測,未見異常的總離子流色譜圖。從圖1可以看出,譜峰比較尖銳,峰形較為對稱,樣本的保留時間重現(xiàn)性好,分析系統(tǒng)穩(wěn)定性好,為后續(xù)分析打下良好的基礎(chǔ)。

    2.2 海捕和養(yǎng)殖中國對蝦的蛋白鑒定結(jié)果

    使用ProteinPilotTM軟件對得到的MS數(shù)據(jù)用中國對蝦NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫進行譜庫檢索,共鑒定52 個蛋白、2 081 條肽段和14 775 個碎片。將檢索得到的庫作為數(shù)據(jù)庫,并在PeakView軟件將SWATH數(shù)據(jù)導(dǎo)入該數(shù)據(jù)庫,按照1.4節(jié)的參數(shù)設(shè)置進行處理,并進行手工校正,最終保留35 個可相對定量的蛋白。

    2.3 海捕和養(yǎng)殖中國對蝦的PCA和OPLS-DA

    從圖2A可以看出,海捕和養(yǎng)殖的中國對蝦分居X軸的正半軸和負半軸,在t[1]上明顯分離,且組間差異較大,組內(nèi)差異較小。雖然樣品點略顯分散,但總體上可以很好地對2 個樣品進行區(qū)分。從圖2B可以看出,相比于PCA,OPLS-DA中樣品點在X軸上的分布更加緊密,所以兩兩比較有監(jiān)督的OPLS-DA可以更好地對海捕和養(yǎng)殖的中國對蝦樣品進行區(qū)分。

    2.4 海捕和養(yǎng)殖的中國對蝦蛋白生物標(biāo)志物的篩選結(jié)果

    為進一步明確海捕和養(yǎng)殖中國對蝦間具有統(tǒng)計學(xué)差異的蛋白,找到區(qū)分2 種不同來源中國對蝦的蛋白生物標(biāo)志物,利用以上建立的兩兩有監(jiān)督的OPLS-DA模型進行識別。圖3A為OPLS-DA模型對應(yīng)的變量投影重要性(variable importance in projection,VIP)圖,VIP值大于1可被認(rèn)為是潛在生物標(biāo)志物[27]。圖3B為OPLS-DA模型對應(yīng)的S圖(S-plot),采用離原點越遠表示對分類貢獻越大的原則[28],選相關(guān)性p(corr)的絕對值大于0.8,尋找對樣本分類具有重要貢獻的蛋白生物標(biāo)志物信息。圖3C為OPLS-DA模型的因子載荷圖,篩選標(biāo)準(zhǔn)為其Jack-knifed置信區(qū)間不應(yīng)跨越0值[29-30]。通過篩選,共得到8 個候選的蛋白生物標(biāo)志物,分別為肌動蛋白1、精氨酸激酶、β-肌動蛋白、血藍蛋白、卵黃蛋白原、血藍蛋白,部分、果糖1,6-二磷酸醛縮酶A和激活轉(zhuǎn)錄因子-2。

    圖 3 海捕和養(yǎng)殖中國對蝦的蛋白生物標(biāo)志物的篩選Fig. 3 Screening for protein biomarkers of wild and farmed F. chinensis

    此外,對海捕和養(yǎng)殖中國對蝦的各個蛋白進行統(tǒng)計學(xué)分析(表1),P值小于0.05的具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異,在具有統(tǒng)計學(xué)差異的前提下,選取差異倍數(shù)大于1.2或者小于0.83的蛋白,作為最終的蛋白生物標(biāo)志物。在排除精氨酸激酶、β-肌動蛋白、果糖1,6-二磷酸醛縮酶A后,肌動蛋白1、血藍蛋白、卵黃蛋白原、血藍蛋白,部分、激活轉(zhuǎn)錄因子-2被篩選為最終的蛋白生物標(biāo)志物,用于區(qū)分海捕和養(yǎng)殖的中國對蝦。

    表 1 海捕和養(yǎng)殖的中國對蝦統(tǒng)計分析Table 1 Statistical analysis of wild and farmed F. chinensis

    2.5 海捕和養(yǎng)殖中國對蝦層次聚類分析

    圖 4 海捕和養(yǎng)殖中國對蝦的層次聚類熱力圖Fig. 4 Hierarchical cluster analysis and heatmap of wild and farmed F. chinensis

    圖4為海捕和養(yǎng)殖的中國對蝦通過蛋白生物標(biāo)志物篩選所得的層次聚類熱力圖(6 個平行實驗,每個樣品重復(fù)2 次),圖中每個小方格代表該蛋白在該樣品中的豐度,小方格的顏色越紅表明蛋白豐度越大,顏色越綠表明蛋白豐度越小。從圖4可以看出,海捕和養(yǎng)殖的中國對蝦被分為2 個分支,說明通過篩選得到蛋白的生物標(biāo)志物可以很好地區(qū)分這2 個樣品。

    3 結(jié) 論

    本研究使用UPLC-Q TOF-MS SWATH技術(shù)為基礎(chǔ)的蛋白組學(xué),比較定量分析海捕和養(yǎng)殖中國對蝦的蛋白含量。并結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法尋找生物標(biāo)志物。OPLS-DA結(jié)果顯示,該方法可以化復(fù)雜為簡單,有效提取復(fù)雜變量間的主要信息,降低分析難度,并揭示海捕和養(yǎng)殖中國對蝦樣本之間蛋白豐度的差異。層次聚類分析表明,化學(xué)計量學(xué)篩選所得的生物標(biāo)志物可以很好地區(qū)分海捕和養(yǎng)殖的中國對蝦。與傳統(tǒng)方法相比,本方法靈敏度更高、精確度更好。

    本研究找到了區(qū)分海捕和養(yǎng)殖中國對蝦的蛋白生物標(biāo)志物,為區(qū)分海捕和養(yǎng)殖的中國對蝦提供一種新的研究思路。該思路也可應(yīng)用到其他食品的真實性分析、產(chǎn)地溯源、物種鑒定等領(lǐng)域,為分析高度同源的蛋白質(zhì)食品提供一定的參考價值。

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