HPLC法同時(shí)測(cè)定不同生長(zhǎng)年限不同部位杜仲中5 種苯丙素類成分

張子?xùn)|，付冬梅，張威鵬，張 琳,*，祖元?jiǎng)?/p>

（1.東北林業(yè)大學(xué) 森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)

教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040）

杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）為杜仲科杜仲屬植物，現(xiàn)已收入我國(guó)藥食同源管理系統(tǒng)，已被世界許多國(guó)家引用栽培，供保健、藥用和觀賞[1]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》《本草綱目》《本草經(jīng)集注》等典籍中就記載了杜仲的保健功能。傳統(tǒng)上以杜仲皮為保健原料，由于當(dāng)杜仲的生長(zhǎng)年限到達(dá)20 a左右，其杜仲皮才更具有保健功效[2]，而杜仲剝皮會(huì)導(dǎo)致樹(shù)木死亡[3]，嚴(yán)重破壞我國(guó)二級(jí)保護(hù)植物杜仲資源。為解決當(dāng)前杜仲樹(shù)皮資源問(wèn)題，急需探索杜仲其他藥用部位中的相似活性成分。近期報(bào)道發(fā)現(xiàn)，杜仲葉中富含的苯丙素類成分具有廣泛的降壓、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、強(qiáng)筋健骨、增加胃腸蠕動(dòng)和促進(jìn)胃液分泌的藥理作用[4-6]。目前針對(duì)杜仲中木脂素類、黃酮類活性成分的檢測(cè)分析方法較多[7-11]，而針對(duì)杜仲中苯丙素類成分的研究相對(duì)較少[12]。苯丙素作為杜仲中主要活性成分，不同藥用部位含量不同，具有一定的開(kāi)發(fā)價(jià)值[13-14]。有研究報(bào)道稱杜仲葉中的綠原酸含量遠(yuǎn)高于杜仲干皮[15-16]，但鮮見(jiàn)對(duì)不同生長(zhǎng)年限的杜仲葉、干皮中一系列苯丙素類成分的含量進(jìn)行比較研究。因此，本實(shí)驗(yàn)建立同時(shí)測(cè)定杜仲中的綠原酸、咖啡酸、原兒茶酸、松柏苷、紫丁香苷5 種苯丙素類活性成分的高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法，分別測(cè)定樹(shù)齡為16、18、20、22、24 a的杜仲葉與杜仲干皮2 種部位中綠原酸、咖啡酸、原兒茶酸、松柏苷、紫丁香苷5 種苯丙素類成分含量，為藥食同源植物的質(zhì)量控制指標(biāo)提供依據(jù)，并為其開(kāi)發(fā)研究提供一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生長(zhǎng)年限分別為16、18、20、22、24 a的杜仲葉、杜仲干皮樣品來(lái)自陜西省漢中市略陽(yáng)縣國(guó)家杜仲良種基地。

標(biāo)準(zhǔn)品：紫丁香苷、綠原酸、咖啡酸（純度＞98%）中國(guó)藥品生物制品檢定所；原兒茶酸（純度＞98%）大連美侖生物技術(shù)有限公司；松柏苷（純度≥98%）上海源葉生物科技有限公司；乙腈為色譜純；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水；其他所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A HPLC儀（包括SPD-20A紫外檢測(cè)器）日本島津公司；KQ2200D型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；DFT-50手提式高速萬(wàn)能粉碎機(jī)溫嶺市林大機(jī)械有限公司；Unique-LC R20多功能超純水系統(tǒng) 廈門(mén)銳思捷水純化技術(shù)有限公司；D3024R高速冷凍離心機(jī) 大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；BS124S型分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 超聲輔助法提取苯丙素類成分的單因素試驗(yàn)

因綠原酸、咖啡酸、原兒茶酸、松柏苷、紫丁香苷5 種苯丙素類活性成分極性較大，通?？蛇x擇甲醇、乙醇或水進(jìn)行提取，為將苯丙素類成分提取全面，選擇極性相對(duì)較大的甲醇作為提取溶劑。分別對(duì)甲醇體積分?jǐn)?shù)、超聲提取時(shí)間、料液比進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察各因素對(duì)杜仲中苯丙素類成分含量提取率的影響[17-19]。

1.3.1.1 甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)杜仲樣品中苯丙素類成分提取率的影響

分別精密稱取4 份杜仲樣品20 g，分別加入體積分?jǐn)?shù)25%、50%、75%、100%甲醇溶液，料液比為1∶10（g/mL），超聲提取30 min，以杜仲中苯丙素類成分提取率之和為考察指標(biāo)，考察甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)杜仲中苯丙素類成分提取率的影響。

1.3.1.2 超聲提取時(shí)間對(duì)杜仲樣品中苯丙素類成分提取率的影響

分別精密稱取4 份杜仲樣品20 g，加入體積分?jǐn)?shù)100%甲醇溶液，料液比為1∶10（g/mL），超聲提取15、30、45、60 min，以杜仲中苯丙素類成分提取率之和為考察指標(biāo)，考察超聲提取時(shí)間對(duì)杜仲中苯丙素類成分提取率的影響。

1.3.1.3 料液比對(duì)杜仲樣品中苯丙素類成分提取率的影響

分別精密稱取4 份杜仲樣品20 g，加入體積分?jǐn)?shù)100%甲醇溶液，料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20（g/mL），超聲提取30 min，以杜仲中苯丙素類成分提取率之和為考察指標(biāo)，考察料液比對(duì)杜仲中苯丙素類成分提取率的影響。

1.3.2 苯丙素類成分HPLC測(cè)定

1.3.2.1 色譜條件

色譜柱：HiQ Sil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.2%甲酸溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脫程序：0～12 min，4%～12% B；12～35 min，12%～14% B；流速1.0 mL/min；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)277 nm；進(jìn)樣量5 μL。

1.3.2.2 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

分別精密稱取綠原酸、咖啡酸、原兒茶酸、松柏苷、紫丁香苷標(biāo)準(zhǔn)品適量，用無(wú)水甲醇溶解，配制成1 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.3.2.3 供試品溶液的制備

分別精密稱取粉碎后的杜仲葉、杜仲干皮粉末1.0 g，加入10 mL無(wú)水甲醇超聲提取30 min，過(guò)濾，保留濾液。濾渣再次加入10 mL無(wú)水甲醇超聲提取30 min，過(guò)濾，合并濾液，混勻。分別從各合并濾液中吸取1 mL，12 000 r/min離心10 min，取上清液即得。

1.3.2.4 方法學(xué)考察

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

用R studio軟件Tidyverse包，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理及統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)定成分選擇結(jié)果

苯丙素類是廣泛存在于藥用植物中的天然產(chǎn)物，具有非常豐富的生理活性，尤其具有降壓、抗炎、抗腫瘤、抗氧化等藥理活性[22]。杜仲中苯丙素類成分功能已經(jīng)成為天然降壓、抗炎保健食品的重要來(lái)源[23]，現(xiàn)已成為眾多植物學(xué)家，藥物化學(xué)家的重點(diǎn)研究對(duì)象。綠原酸、咖啡酸、松柏苷、原兒茶酸、紫丁香苷為杜仲中苯丙素類代表性成分，并且這5 種成分也是其他某些藥用植物的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。其中綠原酸、咖啡酸、原兒茶酸的降壓、抗菌抗炎活性機(jī)制已有大量研究報(bào)道[24-28]。因此本實(shí)驗(yàn)選擇以上5種苯丙素類成分為測(cè)量指標(biāo)，研究不同生長(zhǎng)年限杜仲葉、杜仲干皮中苯丙素類成分含量，為杜仲的開(kāi)發(fā)研究提供一定的參考價(jià)值。根據(jù)大部分研究報(bào)道可知，建立測(cè)定杜仲中綠原酸含量的HPLC方法相對(duì)較多，針對(duì)性建立測(cè)量杜仲中一系列苯丙素類成分的HPLC方法卻很罕見(jiàn)，本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)方法對(duì)于富含這5 種苯丙素類成分的天然藥物質(zhì)量評(píng)價(jià)、含量分析具有一定的參考價(jià)值。

線性關(guān)系：取1.3.2.2節(jié)原兒茶酸、松柏苷、紫丁香苷、綠原酸、咖啡酸的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，精密梯度稀釋成質(zhì)量濃度分別為1、0.1、0.01、0.001、0.000 1 mg/mL的含有5 種苯丙素類成分的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在1.3.2.1節(jié)色譜條件下進(jìn)樣，進(jìn)樣量為5 μL，以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度X（mg/mL）為橫坐標(biāo)，色譜峰峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

精密度：將1.3.2.2節(jié)混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液梯度稀釋成低、中、高3 種不同質(zhì)量濃度（0.01、0.1、1 mg/mL）的供試品溶液，并連續(xù)進(jìn)樣5 次，每次5 μL，按1.3.2.1節(jié)HPLC條件測(cè)定峰面積，分別計(jì)算各成分峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

穩(wěn)定性：取同一供試品溶液，分別于0、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣5 μL，按1.3.2.1節(jié)HPLC條件測(cè)定峰面積，分別計(jì)算各成分峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

重復(fù)性：分別稱取杜仲葉、干皮粉末各5 份，按1.3.2.3節(jié)方法制備供試品溶液（n=3），按1.3.2.1節(jié)HPLC條件測(cè)定峰面積，計(jì)算各成分峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

加標(biāo)回收率：稱取已知含量的杜仲葉粉末適量，共6 份，按1.3.2.3節(jié)方法平行制備供試品溶液，精密稱取10 mL供試品溶液，分別適量加入1.3.2.2節(jié)混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按1.3.2.1節(jié)HPLC條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算原兒茶酸、松柏苷、紫丁香苷、綠原酸、咖啡酸的加標(biāo)回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差[20-21]。

1.3.2.5 樣品測(cè)定

將經(jīng)過(guò)1.3.2.3節(jié)方法處理的各供試品溶液應(yīng)用1.3.2.1節(jié)色譜條件進(jìn)行HPLC測(cè)定，進(jìn)樣量為5 μL，應(yīng)用外標(biāo)法測(cè)定含量。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 甲醇體積分?jǐn)?shù)的影響

圖 1 甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)苯丙素類成分提取率的影響Fig. 1 Effect of MeOH concentration on the yield of phenylpropanoids

由圖1可知，甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)杜仲中苯丙素類成分提取率影響較大，隨甲醇體積分?jǐn)?shù)的增加，苯丙素類成分提取率隨之增加，且在甲醇體積分?jǐn)?shù)為100%時(shí)，苯丙素類成分提取率最大。所以選擇100%甲醇溶液作為提取溶液。

2.2.2 超聲提取時(shí)間的影響

由圖2可知，超聲提取時(shí)間對(duì)杜仲中苯丙素類成分提取率影響較大，隨超聲提取時(shí)間的延長(zhǎng)，苯丙素類成分提取率隨之增加，且在超聲提取時(shí)間為30 min時(shí)，苯丙素類成分提取率最大，可得最佳超聲提取時(shí)間為30 min。

圖 2 超聲提取時(shí)間對(duì)苯丙素類成分提取率的影響Fig. 2 Effect of extraction time on the yield of phenylpropanoids

2.2.3 料液比的影響

圖 3 料液比對(duì)苯丙素類成分提取率的影響Fig. 3 Effect of solid to solvent ratio on the yield of phenylpropanoids

由圖3可知，隨著溶劑量的增加，苯丙素類成分提取率呈增加趨勢(shì)。當(dāng)料液比為1∶10（g/mL）時(shí)，提取率達(dá)到最大值，當(dāng)溶劑量繼續(xù)增加時(shí)提取率呈下降趨勢(shì)，可得最佳料液比為1∶10（g/mL）。

2.3 苯丙素類成分HPLC測(cè)定

2.3.1 色譜條件選擇結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)借鑒測(cè)定杜仲中綠原酸含量HPLC方法[29-30]，建立1.3.2.1節(jié)色譜條件。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)選擇甲醇為流動(dòng)相時(shí)，5 種成分的色譜峰出現(xiàn)堆積現(xiàn)象，于是選擇極性更大的乙腈作為流動(dòng)相。在流動(dòng)相A的選擇上，實(shí)驗(yàn)初期存在峰后拖現(xiàn)象，于是將流動(dòng)相A在0.1%甲酸的基礎(chǔ)上改為0.2%甲酸后，峰拖尾現(xiàn)象明顯改善。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在最終HPLC條件下各色譜峰分離效果最佳。

2.3.2 HPLC分析

如圖4所示，杜仲葉、干皮樣品中5 種苯丙素成分分離度良好，基線平穩(wěn)，出峰完全且峰形規(guī)范。

圖 4 混合標(biāo)準(zhǔn)品（A）、杜仲葉樣品（B）、杜仲干皮樣品（C）的HPLC圖Fig. 4 HPLC chromatograms of standard mixture (A), E. ulmoides Oliv. leaves (B), and barks (C)

2.3.3 方法學(xué)考察結(jié)果

2.3.3.1 線性關(guān)系

由表1可知，各苯丙素類成分在各自線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表 1 5 種成分的線性關(guān)系Table 1 Linear relationships of five phenylpropanoids

2.3.3.2 精密度

結(jié)果顯示，低質(zhì)量濃度組中綠原酸、松柏苷、原兒茶酸、紫丁香苷、咖啡酸峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.89%、1.43%、2.87%、2.09%、4.15%；中質(zhì)量濃度組中綠原酸、松柏苷、原兒茶酸、紫丁香苷、咖啡酸峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.76%、2.88%、1.09%、3.25%、2.87%；高質(zhì)量濃度組中綠原酸、松柏苷、原兒茶酸、紫丁香苷、咖啡酸峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4.31%、0.98%、2.87%、1.23%、3.28%，表明分析方法的精密度良好。

2.3.3.3 穩(wěn)定性

結(jié)果顯示綠原酸、松柏苷、原兒茶酸、紫丁香苷、咖啡酸峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.78%、1.55%、0.99%、2.35%、0.98%，說(shuō)明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3.4 重復(fù)性

結(jié)果顯示，原兒茶酸、松柏苷、紫丁香苷、綠原酸、咖啡酸峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.53%、0.97%、1.12%、1.44%、0.67%。表明該方法重復(fù)性較好。

2.3.3.5 加標(biāo)回收率

根據(jù)1.3.2.4節(jié)方法學(xué)考察中加標(biāo)回收率考察方法，計(jì)算原兒茶酸、松柏苷、紫丁香苷、綠原酸、咖啡酸的加標(biāo)回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果如表2所示，此方法具有較好的檢測(cè)性能。

表 2 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of recovery tests

2.4 杜仲中苯丙素類成分含量測(cè)定結(jié)果

取樹(shù)齡為16、18、20、22、24 a的杜仲葉、杜仲干皮樣品，按1.3.2.3節(jié)方法分別制備供試品溶液，后采用1.3.2.1節(jié)HPLC條件進(jìn)行測(cè)定（n=3），取平均值后，根據(jù)2.3.3.1節(jié)各成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算5 種苯丙素類成分的含量，如表3所示。

表 3 不同生長(zhǎng)年限杜仲葉、干皮5 種苯丙素類成分測(cè)定結(jié)果Table 3 Contents of 5 phenylpropanoids in E. ulmoides Oliv. leaves and barks in various growing yearsμg/g

為使各樣品中5 種苯丙素類成分含量數(shù)據(jù)更便于比較，使用R語(yǔ)言Tidyverse包將表3中數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理。由于不同藥用部位杜仲樣品中的苯丙素類成分含量差距巨大，于是將所有含量結(jié)果進(jìn)行取對(duì)數(shù)（lg）運(yùn)算，如圖5所示。

圖 5 杜仲樣品中5 種苯丙素類活性成分含量的環(huán)狀柱形圖Fig. 5 Circular barplot of contents of 5 phenyl compounds in E. ulmoides Oliv. samples

研究表明，杜仲葉、干皮中均含有這5 種苯丙素類化合物，但其含有量差別較大。由圖5可知，綠原酸在杜仲葉與杜仲干皮中含量差異尤為明顯（P＜0.01），杜仲葉中的綠原酸含量平均約為杜仲干皮中的57 倍；杜仲葉中松柏苷、紫丁香苷含量約為杜仲干皮的1.24、9.19 倍；咖啡酸、原兒茶酸在杜仲葉、干皮中含量均較低，且含量差距不大，咖啡酸在杜仲葉中含量約為干皮的2.4 倍，而杜仲干皮中的原兒茶酸含量大部分要高于杜仲葉。杜仲葉中的多數(shù)苯丙素類成分含量存在遠(yuǎn)高于杜仲干皮的現(xiàn)象。因?yàn)楦魃L(zhǎng)年限的杜仲葉、杜仲干皮中均含有這5 類具有降壓、抗炎作用的苯丙素類活性成分，且杜仲葉中的5 種苯丙素類活性成分總量高于杜仲干皮，所以在抗炎殺菌、降壓藥物使用上，可以考慮使用杜仲葉代替杜仲干皮。

3 結(jié) 論

以HPLC法同時(shí)測(cè)定杜仲中綠源酸、咖啡酸、原兒茶酸、松柏苷、紫丁香苷5 種苯丙素類成分含量，建立HPLC含量測(cè)定方法，此分析方法精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可作為杜仲中5 種苯丙素類成分的檢測(cè)方法，為杜仲的綜合利用和深度開(kāi)發(fā)提供質(zhì)量控制參考依據(jù)。由于各生長(zhǎng)年限的杜仲葉與杜仲干皮中均含有這5 類活性成分，且杜仲葉與杜仲干皮中的成分含量存在明顯不同，這在將杜仲應(yīng)用于抗炎殺菌、降壓、強(qiáng)筋健骨保健品的開(kāi)發(fā)上應(yīng)當(dāng)注意。因?yàn)槎胖偃~中苯丙素類成分含量較高，且杜仲葉為可再生資源，所以可進(jìn)一步考慮有關(guān)杜仲葉的研究與開(kāi)發(fā)。