14 種柑橘皮中多甲氧基黃酮成分分析

許 引，呂小健，李 明*，龍 濤，徐蘭英，李士明,*

（1.武漢紡織大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，湖北 武漢 430200；2.黃岡師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，催化材料制備及應(yīng)用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 黃岡 438000）

柑橘屬植物的果皮具有很高的藥用價(jià)值。例如，陳皮為蕓香科柑橘屬植物橘（Citrus reticulata Blanco）的干燥成熟果皮，可藥食兩用。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，陳皮性溫味苦辛，可歸為脾肺兩經(jīng)，具有疏肝理氣功效。陳皮及其他柑橘皮的特征成分為黃酮類化合物：多羥基黃酮化合物[1-2]、多甲氧基黃酮以及羥基多甲氧基黃酮[3-7]，例如川陳皮素可以抑制NF-κB，降低Cox-2和iNOS等炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生[8-9]；可抑制清道夫受體表達(dá)，抑制血脂對(duì)靶細(xì)胞的攻擊[10-11]；橘皮黃酮可以有效抑制血小板聚集，防止心血管栓塞發(fā)生等[12]；川陳皮素和陳皮素能夠調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞因子的分泌和脂肪細(xì)胞的增大[13]；橘皮黃酮可直接對(duì)抗肥胖，降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物甘油三酯和膽固醇的水平[14]。

近期研究表明，橘皮中橘皮素、川陳皮素和3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黃酮等多甲氧基黃酮，以及5-去甲基川陳皮素等羥基多甲氧基黃酮是柑橘屬植物果實(shí)皮的特有成分[3]。研究發(fā)現(xiàn)，陳皮的藥效及重要生物活性大多與其含有的黃酮，特別是與多甲氧基黃酮相關(guān)[15-16]。同樣，柑橘果皮中多甲氧基黃酮的種類和含量受柑橘種類和多種生長(zhǎng)環(huán)境因素的影響。柑橘果皮來(lái)源選材不同，其中多甲氧基黃酮種類和含量也會(huì)不同，進(jìn)而影響橘皮的藥效[17]。因此，分析不同品種、不同產(chǎn)地柑橘果皮中多甲氧基黃酮含量，對(duì)于橘皮的選材及多甲氧基黃酮的質(zhì)量控制具有重要意義。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)柑橘果皮尤其是陳皮的研究逐漸增多，但研究多集中于其中一個(gè)或幾個(gè)常見(jiàn)品種[18]，鮮少有對(duì)不同品種的柑橘果皮、陳皮中的多甲氧基黃酮成分進(jìn)行綜合考察分析。文獻(xiàn)多報(bào)道橘皮總黃酮含量的測(cè)定，方法主要有分光光度法[19-20]、二氯氧鋯比色法[21]、薄層色譜法[22-23]，以及運(yùn)用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定橘皮中常見(jiàn)的多甲氧基黃酮，如川陳皮素、橘皮素和3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黃酮含量的測(cè)定方法也有報(bào)道[24-27]，但是3,5,6,7,3’,4’-六甲氧基黃酮、5,6,7,4’-四甲氧基黃酮和5-去甲基橘皮素相關(guān)定量分析的報(bào)道很少。本實(shí)驗(yàn)建立同時(shí)測(cè)定橘皮中9 種多甲氧基黃酮（結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1）含量的方法，以期為多甲氧基黃酮柑橘皮原材料選材、質(zhì)量合理控制提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品

9 種多甲氧基黃酮標(biāo)準(zhǔn)品，包括5,6,7,4’-四甲氧基黃酮、甜橙黃酮、橘皮素、3,5,6,7,3’,4’-六甲氧基黃酮、川陳皮素、3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黃酮、5-去甲基橘皮素、5-去甲氧基川陳皮素、5-羥基-3,6,7,8,3’,4’-六甲氧基黃酮，為實(shí)驗(yàn)室自制，純度均大于98.5%。

1.1.2 柑橘皮及陳皮

新鮮柑橘共11 種，包括2 種橙類（安遠(yuǎn)臍橙、贛南臍橙）；3 種柑類（重慶柑橘、蒲江丑橘、廣西皇帝柑）；5 種橘類（蒲江美人橘、廣西沙糖橘、臺(tái)州蜜橘、宜昌蜜橘、黃岡本地橘）；金錢橘，購(gòu)買于京東生鮮水果超市，由黃岡師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院鑒定確認(rèn)。新會(huì)陳皮、江西陳皮、浙江陳皮購(gòu)于湖北黃州大藥房。

圖 1 9 種多甲氧基黃酮的結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structures of nine polymethoxyflavonoids (PMFs)

1.1.3 試劑

無(wú)水乙醇（分析純），甲醇、乙腈（均為色譜純）上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1260 II HPLC儀 美國(guó)安捷倫公司；GWX-9623MB型電熱鼓風(fēng)干燥箱、DZF-6020真空干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SHZ-III循環(huán)水真空泵、RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；CCA-20型低溫冷卻水循環(huán)泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；BSA124S分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；DS-5510DT型超聲波清洗器 上海生析超聲儀器有限公司；UPT-II-10T優(yōu)普系列超純水器成都超純科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 HPLC條件

HPLC色譜柱：Phenomenex Luna C18（2）液相色譜柱（150 mm×4.6 mm，3 μm）；流動(dòng)相為水（A）和乙腈（B）。流動(dòng)相洗脫梯度為：0～15 min，40%～55% B；15～20 min，55%～70% B；20～25 min，70%～80% B；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：326 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備

分別精確稱取一定質(zhì)量的甜橙黃酮、5,6,7,4’-四甲氧基黃酮、橘皮素、3,5,6,7,3’,4’-六甲氧基黃酮、川陳皮素、3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黃酮、5-去甲基橘皮素、5-去甲基川陳皮素和5-羥基-3,6,7,8,3’,4’-六甲氧基黃酮9 種標(biāo)準(zhǔn)品，用乙醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，配制成一定質(zhì)量濃度范圍為1.187～840 μg/mL對(duì)照品溶液。將對(duì)照品溶液用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，用HPLC分析檢測(cè)，并建立相對(duì)應(yīng)的回歸方程。

1.3.3 柑橘類果皮中多甲氧基黃酮的提取

1.3.3.1 超聲提取多甲氧基黃酮

以廣西砂糖橘、新會(huì)陳皮及廣西皇帝柑為例，分別采用回流提取、超聲提取、索氏提取、微波提取、超臨界提取等提取方法，對(duì)不同提取時(shí)間、溫度、超聲功率、料液比、提取溶劑等因素做單因素試驗(yàn)探究總目標(biāo)多甲氧基黃酮提取率，以提取率為主要指標(biāo)，綜合考慮提取方法，選擇以無(wú)水乙醇作溶劑、料液比1∶10（g/mL）、超聲提取柑橘果皮中多甲氧基黃酮化合物，超聲時(shí)間40 min，超聲功率450 W，超聲頻率40 kHz。

1.3.3.2 樣品的制備

將各果實(shí)樣品洗凈，收集的果皮于60 ℃干燥2～3 周，然后將干燥果皮粉碎備用；新會(huì)陳皮、浙江陳皮、江西陳皮直接粉碎成粉末備用。稱取干燥柑橘果皮粉末各4.0 g，用40 mL無(wú)水乙醇按1.3.3.1節(jié)超聲提取40 min，放冷，過(guò)濾，濾液置50 mL容量瓶中，用少量乙醇分?jǐn)?shù)次洗滌容器，洗液濾入同一量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液，4 ℃保存?zhèn)溆?。每種柑橘果皮提取實(shí)驗(yàn)平行3 組。

1.3.4 柑橘類果皮中多甲氧基黃酮的檢測(cè)

將供試品溶液過(guò)0.22 μm濾膜后直接注入進(jìn)樣瓶進(jìn)行HPLC分析，以標(biāo)品溶液質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行回歸計(jì)算得9 種多甲氧基黃酮回歸方程，檢測(cè)5,6,7,4’-四甲氧基黃酮、甜橙黃酮、橘皮素、3,5,6,7,3’,4’-六甲氧基黃酮、川陳皮素、3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黃酮、5-去甲基橘皮素、5-去甲基川陳皮素和5-羥基-3,6,7,8,3’,4’-六甲氧基黃酮的含量。每種黃酮分別以信噪比為3和10對(duì)應(yīng)的多甲氧基黃酮標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度計(jì)算檢出限和定量限。

2 結(jié)果與分析

2.1 9 種多甲氧基黃酮標(biāo)準(zhǔn)品HPLC檢測(cè)結(jié)果

圖 2 9 種多甲氧基黃酮標(biāo)準(zhǔn)溶液HPLC圖Fig. 2 HPLC separation of a mixture of nine PMFs standards

由圖2可知，5-去甲基橘皮素在C18反相柱的保留時(shí)間比其相對(duì)應(yīng)的多甲氧基黃酮更長(zhǎng)，其原因可解釋為由于5-位的羥基氫與4-位的羰基氧形成一個(gè)六圓環(huán)平面穩(wěn)定的分子內(nèi)氫鍵，而使得它們的極性減弱，在反相柱中表現(xiàn)出更強(qiáng)的親脂性，因此保留時(shí)間較長(zhǎng)。由圖2可見(jiàn)，9 種多甲氧基黃酮均具有較好的峰形和分離度。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制結(jié)果

由表1可知，9 種多甲氧基黃酮在對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)r2不小于0.999 8。用已知質(zhì)量濃度的純品檢測(cè)9 種工作曲線準(zhǔn)確度，實(shí)際測(cè)得質(zhì)量濃度與已知檢測(cè)質(zhì)量濃度都在±5%以內(nèi)，說(shuō)明在檢測(cè)區(qū)間范圍內(nèi)有很好的檢測(cè)準(zhǔn)確度。日內(nèi)檢測(cè)和日間檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均證明在檢測(cè)范圍內(nèi)（≤5%），這9 種多甲氧基黃酮工作區(qū)間線性關(guān)系很好，有很高的精確度。

表 1 9 種多甲氧基黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)Table 1 Calibration equations, linear range and limits of detection and quantification for nine PMFs

2.3 柑橘果皮中9 種多甲氧基黃酮含量檢測(cè)結(jié)果

圖 3 廣西皇帝柑果皮提取物HPLC圖Fig. 3 HPLC profile of Emperor tangerine peel extract

由圖3可知，廣西皇帝柑果皮中川陳皮素和橘皮素含量均較高，但未檢出3,5,6,7,3’,4’-六甲氧基黃酮和5,6,7,4’-四甲氧基黃酮。該方法較紫外分光光度計(jì)法、薄層色譜法更加準(zhǔn)確，簡(jiǎn)便、快速。

從表2可知，不同品種及同一品種不同產(chǎn)地的柑橘果皮中的多甲氧基黃酮含量和種類有明顯差異。在這14 種柑橘果皮樣品中，金錢橘果皮中未檢測(cè)到多甲氧基黃酮，柑橘果皮樣品中多甲氧基黃酮總含量為998.95～10 412.18 μg/g，重慶柑橘、廣西皇帝柑、廣西沙糖橘和江西陳皮中多甲氧基黃酮總含量均較高，達(dá)到7 495.19 μg/g以上，其中廣西沙糖橘多甲基黃酮總含量高達(dá)10 412.18 μg/g。果皮中多甲基黃酮總含量最少的品種是臺(tái)州蜜橘（998.85 μg/g）。因此，建議除橙皮苷外，應(yīng)該增加多甲氧基黃酮類成分作為陳皮的質(zhì)控指標(biāo)。

由表2可知，川陳皮素與橘皮素幾乎是所有柑橘果皮中最常見(jiàn)且含量最高的多甲氧基黃酮，尤其體現(xiàn)在重慶柑橘、廣西皇帝柑、廣西沙糖橘、江西陳皮、蒲江美人橘和新會(huì)陳皮。近年來(lái)，隨著其生物活性研究的愈加深入，對(duì)川陳皮素和橘皮素單品的需求量越來(lái)越大，因此選取最佳柑橘果皮品種及產(chǎn)地來(lái)源顯得尤為重要。在本研究中，重慶柑橘、蒲江美人橘、廣西沙糖橘、廣西皇帝柑、新會(huì)陳皮、江西陳皮中川陳皮素含量相對(duì)較高（2 239.65～5 324.90 μg/g），其中廣西沙糖橘果皮中川陳皮素含量最高達(dá)到5 324.90 μg/g；重慶柑橘、廣西沙糖橘、廣西皇帝柑、新會(huì)陳皮、江西陳皮中橘皮素含量較高（1 685.98～4 005.66 μg/g），其中廣西沙糖橘果皮中橘皮素含量達(dá)到4 005.66 μg/g。所以，廣西砂糖橘果皮可作為川陳皮素和橘皮素的最佳天然原材料，建議考慮將砂糖橘作為陳皮藥材選材來(lái)源。而安遠(yuǎn)臍橙和贛南臍橙果皮中多甲氧基黃酮含量很低，據(jù)報(bào)道，臍橙中橙皮苷含量也較低[25,28]，所以臍橙不適合作為陳皮的制作原料。

去甲基多甲氧基黃酮是柑橘果皮中另外一種重要的黃酮化合物，以前研究表明，去甲基多甲氧基黃酮比多甲氧基黃酮有更強(qiáng)的抗腫瘤和抗炎活性[29-30]。在此研究中，重慶柑橘、浦江美人橘、江西陳皮和廣西皇帝柑中5-去甲基川陳皮素總含量較高（384.99～637.61 μg/g），但仍然比其他非去甲基多甲氧基黃酮含量低很多。另外，5-去甲基橘皮素在所檢測(cè)的所有品種柑橘果皮中含量均極低，大部分品種的柑橘果皮中都未檢出5-去甲基橘皮素。因此，在天然柑橘果皮中去甲基多甲氧基黃酮含量偏低，新鮮柑橘皮經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間，例如3 a以上避光存放，由于微生物的作用，很可能產(chǎn)生更多比例或者不同種類的去甲基多甲氧基黃酮，加上揮發(fā)油的大量消失及糖苷健在酸性和微生物環(huán)境下斷裂，使苷元、去甲基多甲氧基黃酮的含量成倍增長(zhǎng)，因此大大增強(qiáng)陳皮的活性。而且，模仿陳皮陳化的研究工作已經(jīng)開(kāi)始并取得初步成效[31-32]，目的是快速、高效地研究橘皮多甲氧基黃酮有益健康的機(jī)理，并為開(kāi)發(fā)功能食品提供數(shù)據(jù)支撐。

表 2 不同品種柑橘果皮中9 種多甲氧基黃酮總含量Table 2 Contents of six PMFs and three OHPMFs in different varieties of citrus peels μg/g

3 結(jié) 論

本研究以乙醇為溶劑，從14 種不同品種橘柑果皮中超聲提取黃酮混合物，建立高效、高穩(wěn)定性、并能夠同時(shí)檢測(cè)9 種主要多甲氧基黃酮HPLC分析方法，該方法較紫外-分光光度法等常見(jiàn)分析方法更準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速，不需昂貴的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀器，即可準(zhǔn)確快速檢測(cè)9 種或以上的多甲氧基黃酮。另外，此研究結(jié)果表明，柑橘果皮例如陳皮，作為藥食兩用選材等功能食品和藥材，多甲氧基黃酮含量及其種類應(yīng)該列為陳皮的質(zhì)控指標(biāo)，與生物活性建立定性定量的構(gòu)效關(guān)系。