豬肉12-脂肪氧合酶催化結構域的表達、純化及其酶學性質分析

王晶晶，王 婷，張新笑，卞 歡，耿志明，李鵬鵬,*，王道營，徐為民,3

（1.江蘇省農業(yè)科學院農產品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.南京農業(yè)大學肉品加工與質量控制教育部重點實驗室，江蘇 南京 210095；3.江蘇省肉類生產與加工質量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095）

脂肪氧合酶（lipoxygenase，LOX）屬于氧化還原酶[1]，是一種含非血紅素鐵的雙加氧酶。LOX專一性作用于多不飽和脂肪酸的順,順-1,4-戊二烯基位置，通過分子內加氧，生成具有共軛雙鍵的氫過氧化物[2]。LOX在生物體內的主要作用底物是亞麻酸、亞油酸和花生四烯酸，依據(jù)其加氧位置的特異性，將LOX分為5-LOX、8-LOX、9-LOX、10-LOX、11-LOX、12-LOX、13-LOX、15-LOX，其中15-LOX廣泛存在于動植物、細菌和真菌中[3-5]。15-LOX對脂肪酸的作用底物除了亞油酸、亞麻酸和花生四烯酸，還可以是磷脂、膽固醇脂，甘油三脂等含有不飽和脂肪酸以及更復雜的脂質蛋白質分子。豬的白血球型12-LOX與人的網(wǎng)織紅細胞15-LOX相近，既能催化C-12氧化，也可催化C-15氧化，15-LOX的最適底物為亞油酸并且催化C-13氧化[6-7]。

Andre等[8]于1932年首次發(fā)現(xiàn)酶促氧化反應是大豆制品的豆腥味的主要來源，其中的關鍵酶即LOX。Fu Xiangjin等[9-10]研究證實白鰱魚在貯藏和加工過程中出現(xiàn)的腥味增強主要是由白鰱魚體內的LOX催化降解不飽和脂肪酸產生的各種醛類物質引起的。此后，人們對LOX在食品加工貯藏過程中對風味的影響進行了廣泛研究。研究表明，LOX氧化多不飽和脂肪酸生成的氫過氧化物極不穩(wěn)定，進一步反應生成多種揮發(fā)性化合物，這些物質一方面形成食品的主要風味物質，例如新鮮水果蔬菜的風味物質醛類即由LOX氧化多不飽和脂肪酸途徑生成[11-12]，干腌肉制品的主要風味物質己醛也是脂質氧化降解生成[13-14]；另一方面，食品中脂質的過度氧化產生刺激性氣味物質，不僅導致食品風味劣變，還造成食物多不飽和脂肪酸含量下降，導致食物營養(yǎng)品質的下降并增加食品儲藏的困難[15-20]。脂類物質的氧化分為自動氧化和酶促氧化[21]，LOX是酶促氧化最主要的內源酶。Gata等[22]通過硫酸銨沉淀、DEAE陰離子交換和疏水層析等純化步驟從豬股二頭肌中分離得到一種LOX，對其性質的研究表明LOX可能參與伊比利亞火腿的風味形成。Jin Guofeng等[23]研究表明LOX在干腌培根加工過程中的脂肪氧化起重要作用，溫度、酸度和鹽含量是影響LOX活力的主要因素。研究LOX在肉品脂質氧化過程中的作用及其影響因素，對調控肉品風味品質具有重要的理論和實踐意義。

盡管人們早已認識到LOX在肉品加工中的潛在應用價值，但從豬肉中直接獲得不僅得率低而且純化難，獲得LOX純酶的成本很高；通過LOX基因的克隆與表達，經(jīng)簡單的純化過程，獲得高純度的LOX，能有效解決上述問題[23]。至今為止，還未曾有體外重組表達豬肉LOX的報道。為更好地研究豬肉加工和貯藏過程中風味物質的產生機理和途徑，研發(fā)新型工藝，既保留風味物質又能保持豬肉加工過程中的品質和營養(yǎng)價值。豬肉12-LOX的編碼基因序列已在GenBank公布（GenBank登錄號M31417.1）。豬肉12-LOX包括兩個結構域：N端的β桶結構域屬于C2家族蛋白，主要負責12-LOX與膜的結合；C端的催化結構域。本研究以豬肉為原料，從中獲取12-脂肪氧合酶催化結構域（12-lipoxygenase catalytic domain，12-LOXcd）的編碼基因，對該酶進行提取純化，并對其酶學性質進行研究，與大豆LOX的酶學性質進行比較，因為大豆中LOX含量與活力較高且研究較多，為豬肉制品的加工和貯藏加工提供技術和數(shù)據(jù)支持[24]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌DH5α 南京擎科生物工程有限公司；大腸桿菌表達載體pMBP 本實驗室保藏；TransStart?FastPfu DNA Polymerase試劑盒、大腸桿菌TranSetta2 北京全式金生物技術有限公司；酵母提取物、胰蛋白胨 美國Oxoid公司；瓊脂粉 南京奧多福尼生物科技有限公司；質粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；異丙基β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）、氨芐青霉素、卡那霉素 上海生工生物股份有限公司；亞油酸、大豆脂氧酶（15 MU）美國Sigma公司；pMD19-T 載體、反轉錄試劑盒、限制性內切酶、T4 DNA連接酶 寶生物工程（大連）有限公司；TEV蛋白酶 本實驗室制備；其他試劑為國產分析純。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g。加水溶解后，加水定容到1 000 mL。配制固體培養(yǎng)基時，每100 mL加入瓊脂粉1.5 g。

1.2 儀器與設備

UV-6100型分光光度計 上海美普達儀器有限公司；TP600梯度升降溫功能聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 上海天呈醫(yī)流科技股份有限公司；M124A分析天平 意大利BEL公司；ZEALWAY（致微）G154DWS滅菌器 廈門儀器有限公司；Mini-PROTEANTetra Cell電泳儀 美國Bio-Rad公司；DYCP-31DN瓊脂糖水平電泳儀電泳槽、DYCP-31DN瓊脂糖水平電泳儀電泳槽 北京六一儀器廠；AKTA蛋白純化系統(tǒng) 美國GE Healthcare公司；BioTekSynergy2多功能酶標儀 美國BioTek公司；Scientz-IID超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技有限公司；Tanon-1600全自動凝膠成像分析儀 上海天能儀器有限公司；VD-650超凈工作臺 蘇州江東精密儀器有限公司；ZQTY-90S臺式全溫振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設計與合成

由NCBI公布的豬肉基因組12-LOX基因預測序列，篩選到該基因的CDS序列，運用Primer 5.0設計基因的特異性引物。上游引物（F）：5’-TTCCATATGGGCACTGCCCGCACA-3’（下劃線是NdeI酶切位點）；下游引物（R）：5’-CGCTCGAGGATGGCCACACTGTTT-3’（下劃線是XhoI酶切位點）。引物由南京擎科生物科技有限公司合成。

1.3.2 總RNA提取及cDNA合成

豬肉總RNA的提取根據(jù)TaKaRa公司的TRIzol說明書進行操作。取豬腿肉100 mg，提取總RNA，總RNA經(jīng)電泳檢測，Eppendorf公司核酸定量分析儀測定OD260nm/OD280nm比值及濃度，以1 μg總RNA為模板，按照cDNA合成試劑盒說明書進行反轉錄。反轉錄程序：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃保存，若要長期保存則應放于-20 ℃。

1.3.3 目的基因的獲得

以cDNA為模板進行PCR擴增，反應體系為50 μL，其中模板1 μL，上、下游引物各1 μL，5×TransStart?FastPfu Buffer 10 μL，TransStart?FastPfu DNA Polymerase 1 μL，5×激活劑5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，ddH2O 27 μL。擴增程序：95 ℃預變性2 min；95 ℃、20 s；60 ℃、20 s；72 ℃、90 s，進行35 個循環(huán)；72 ℃延伸30 s。PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物進行純化回收，連接至pMD19-T載體，轉化至DH5α感受態(tài)細胞，取少量菌液涂在含氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過夜，然后挑取陽性單菌落進行培養(yǎng)，經(jīng)菌落PCR和酶切鑒定，將連接正確的重組基因質粒送至南京生物工程股份有限公司測序。

1.3.4 重組表達載體的構建

凝膠回收的PCR產物以及原核表達載體pMBP分別用NdeI和XhoI在37 ℃條件下雙酶切2 h，再分別進行切膠純化回收后，用T4連接酶連接（22 ℃，2 h），將重組質粒全部轉化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。涂布于含有卡娜青霉素的LB平板，倒置，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落進行菌液PCR鑒定是否構建成功，篩選出陽性重組質粒并送至南京生物工程股份有限公司測序。

1.3.5 融合蛋白的原核表達及可溶性分析

經(jīng)過鑒定正確的重組質粒轉化到大腸桿菌TranSetta2感受態(tài)細胞，過夜培養(yǎng)后挑取單菌落接種至5 mL含100 μg/mL卡那青霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)，當菌液濃度OD600nm值為0.6～0.8時，加入IPTG至終濃度為0.25 mmol/L，22 ℃、200 r/min誘導過夜。離心收集沉淀，1∶5的比例加入緩沖液（20 mmol/L磷酸鹽，pH 7.6，120 mmol/L NaCl）重懸菌體，于超聲波細胞破碎儀上破碎10 min（80 W，φ 2，開1 s，停3 s），取出40 μL作為總菌后12 000 r/min、4 ℃離心5 min，分別取出上清液、沉淀40 μL，加入10 μL十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）上樣緩沖液，95 ℃加熱10 min，12 000 r/min離心5 min。用12% SDS-PAGE檢測融合蛋白是否為可溶性蛋白，設置不加IPTG誘導的菌液作為對照。

1.3.6 重組融合蛋白的誘導表達及純化

將上述鑒定能可溶性表達12-LOXcd的菌落接種于1 L含卡那青霉素的LB液體培養(yǎng)基中進行誘導表達，同時接種1 L含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基（Tev-nohis）。分別離心（4 000 r/min，20 min）收集菌體，用Binding Buffer（20 mmol/L磷酸鹽，pH 7.6，150 mmol/L NaCl，5 mmol/L咪唑，10%甘油）重懸菌體，冰浴條件下超聲破碎30 min（功率150 W，超聲1 s，間停3 s），再離心（12 000 r/min，20 min，4 ℃）收集上清液，棄菌體沉淀，將兩個菌液的上清液混勻后放4 ℃酶切24 h，切除麥芽糖結合蛋白（maltose binding protein，MBP）。24 h后，上清液12 000 r/min、4 ℃離心20 min，留上清液。鎳柱平衡后將上清液加入鎳親和層析柱中，分別用不同濃度的咪唑洗脫液洗脫并收集，初步純化目的蛋白，取收集的樣液加入SDS-PAGE上樣緩沖液，加熱（95 ℃，10 min），用12% SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達情況。將較純的樣品用10 kDa的超濾管離心濃縮（4 ℃，3 500×g，10 min/次）。最后用Superdex G200進一步純化，然后再次用SDS-PAGE檢測純化的產物并離心濃縮。用蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，分裝后置于-80 ℃保存。

1.3.7 豬肉12-LOXcd、大豆LOX活力測定及酶學性質比較

1.3.7.1 底物溶液配制

0.5 mmoL亞油酸溶于5 mL含180 μL Tween 20的脫氧重蒸水中，充分混勻；滴加1 mol/L NaOH溶液充分混勻使體系成為清澈透明的液體，再用1 mol/L HCl溶液調pH值至9.0，最后用脫氧重蒸水定容至50 mL。將配制好的亞油酸儲備液分裝保存在EP管中，并于-20 ℃下貯存[25]。

1.3.7.2 酶活力測定

豬肉12-LOXcd活力測定在Kermasha等[26]的方法基礎上進行改進。取200 μL亞油酸底物儲備液與2.9 mL、50 mmol/L的檸檬酸緩沖液（pH 5.5）充分混合，待其在234 nm波長處的吸光度穩(wěn)定后，加入100 μL酶液（稀釋10 倍），迅速混合，于234 nm波長處測定其1.0 min內吸光度的增加量。以200 μL亞油酸底物儲備液與2.9 mL檸檬酸緩沖液混合為空白。

LOX活力定義[27]：在一定的溫度和pH值條件下，反應體系在234 nm波長處每分鐘吸光度增加0.001表示為1 個酶活力單位（U）。

1.3.7.3 最適pH值及其pH值穩(wěn)定性

按1.3.7.2節(jié)所述，在37 ℃下利用pH 4.0～10.0系列緩沖溶液分別替代反應體系中的50 mmol/L、pH 5.5檸檬酸緩沖溶液測定酶活力，以酶活力最高值為100%，計算不同pH值下的相對活力，分析不同pH值對酶活力的影響情況。pH值為4.0、5.0、6.0緩沖液用50 mmol/L的檸檬酸和檸檬酸三鈉配制；pH 7.0、8.0緩沖液用50 mmol/L的磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉配制；pH 9.0、10.0緩沖液用50 mmol/L甘氨酸和NaOH配制。

進一步考察酶pH值穩(wěn)定性。將酶液分別置于上述不同的pH值緩沖液中，于37 ℃下孵育1 h，取出測定酶活力，以酶活力初始值為100%，計算不同pH值下的殘留活力。

1.3.7.4 最適溫度及熱穩(wěn)定性

按1.3.7.2節(jié)所述，分別在10、20、30、40、50、60、70 ℃測定豬肉12-LOXcd和大豆LOX活力，以酶活力最高值為100%，計算不同溫度下的相對活力。

進一步考察豬肉12-LOXcd、大豆LOX在不同溫度下的穩(wěn)定性。將酶液分別置于10、20、30、40、50、60 ℃下保存30 min，取出測定酶活力，以酶活力最高值為100%，計算不同溫度下酶的殘留活力。

1.3.7.5 NaCl添加量對酶活力的影響

用最適pH值下的緩沖液分別配制0%、1%、3%、5%、7%、9%的NaCl溶液。然后在室溫條件下按1.3.7.2節(jié)方法所述進行酶活力測定。

1.3.8 豬肉12-LOXcd的底物特異性

分別以不同濃度的亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸為底物，采用雙倒數(shù)作圖法求得不同底物的Km，比較豬肉12-LOXcd對不同底物的親和力。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

采用凝膠成像儀對電泳圖進行分析。每組實驗做3個平行，酶活力圖采用Origin 8.0進行數(shù)據(jù)分析，測定結果以±s表示。

2 結果與分析

2.1 豬肉12-LOXcd基因原核表達載體的構建

圖 1 pMBP-12-LOXcd融 合蛋白示意圖（A）、12-LOXcd基因擴增結果（B）及重組質粒的酶切鑒定（C）Fig. 1 Schematic demonstration of pMBP-12-LOXcd fusion protein (A),PCR-amplified 12-LOXcd (B) and identification of recombinant plasmid pMBP-12-LOXcd by enzymatic digestion (C)

初期研究發(fā)現(xiàn)12-LOXcd蛋白在大腸桿菌中表達以包涵體形式存在，包涵體形式表達蛋白質的氨基酸不能形成正確的空間結構，影響蛋白的活性，如果對包涵體蛋白進行變性復性等操作，使蛋白活性丟失，影響后續(xù)研究和應用。經(jīng)過多次實驗發(fā)現(xiàn)，使用MBP作為分子伴侶蛋白與12-LOXcd融合表達可以有效解決蛋白以包涵體形式在大腸桿菌中表達的問題[28]，因此本研究將MBP的編碼基因malE通過基因重組技術構建入普通表達載體中，并同時引入了TEV酶切位點（圖1A），便于后續(xù)切除融合蛋白N端的MBP。

以獲得的cDNA為模板，擴增得到的PCR產物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后可見1 656 bp處的片段（圖1B），條帶大小符合預期。預測12-LOXcd編碼553 個氨基酸，分子質量為62 kDa。

將構建成功的重組質粒用NdeI和XhoI雙酶切鑒定（圖1C），得到約5 400 bp的大片段和約1 700 bp的小片段，分別與pMBP和12-LOXcd基因大小相符。進一步測序結果均準確無誤，表明目的基因已成功克隆至表達載體pMBP中，重組表達質粒構建成功，命名為pMBP-12-LOXcd。

2.2 豬肉12-LOXcd重組蛋白誘導表達及可溶性檢測結果

如圖2所示，第1泳道即未加IPTG誘導劑的重組菌在預期大小的條帶處沒有明顯的表達條帶出現(xiàn)；第4泳道明顯看出該系統(tǒng)能大量可溶性表達融合pMBP-12-LOXcd蛋白，大小約100 kDa（12-LOXcd 62 kDa和MBP 40 kDa），與預期大小一致。

2.3 重組蛋白的純化

2.3.1 豬肉12-LOXcd重組蛋白的初步純化

融合pMBP-12-LOXcd蛋白在純化前進行TEV蛋白酶切，SDS-PAGE顯示成功將MBP標簽切除，得到C端帶有His標簽的12-LOXcd蛋白（～62 kDa），采用Ni-NTAAgarose親和層析純化。收集不同咪唑濃度緩沖液洗脫得到的組分，進行SDS-PAGE檢測。圖3結果顯示，通過20 mmol/L和50 mmol/L咪唑洗脫可去除較多雜蛋白，100 mmol/L和250 mmol/L的咪唑洗脫可得到較純的12-LOXcd重組蛋白，說明可以用此方法純化目的蛋白。將100 mmol/L和250 mmol/L咪唑洗脫收集得到的蛋白用截留分子質量為10 kDa的超濾管進行濃縮，為下一步凝膠過濾層析做準備。

2.3.2 12-LOXcd重組蛋白的凝膠過濾層析

圖 4 12-LOXcd凝膠過濾層析色譜圖及SDS-PAGE圖譜Fig. 4 Gel filtration chromatography and SDS-PAGE analysis of recombinant 12-LOXcd protein

如圖4所示，濃縮后的蛋白經(jīng)過Superdex G200層析柱純化后得到3 個洗脫峰，分別收集不同的洗脫峰并用12% SDS-PAGE檢測。結果顯示，經(jīng)凝膠過濾層析后的蛋白條帶單一，雜帶消失。圖中2號洗脫峰為目的蛋白12-LOXcd，將該洗脫峰收集的蛋白用10 kDa的超濾管濃縮后，用蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，分裝后放-80 ℃保存待用。

2.4 豬肉12-LOXcd、大豆LOX酶學性質的比較

2.4.1 pH值對酶活力影響及其穩(wěn)定性

在室溫條件下，測定LOX在不同pH值條件下的活力，結果如圖5所示。在pH 4.0～6.0豬肉12-LOXcd活力逐漸增加，在pH 6.0時，酶活力達到最大，之后隨著pH值的升高而降低，當pH值達到10.0時，大豆LOX活力基本為0；大豆LOX與豬肉12-LOXcd有相同的變化趨勢，其最適pH值為8.0。豬肉12-LOXcd在酸性條件下酶活力較高，這與陳欣[29]、Gate[22]、何立超[25]等研究結果一致。酶的活性中心結構在不同pH值條件下會發(fā)生變化，因此隨著pH值的改變，酶與底物的結合方式和生成中間產物會發(fā)生變化，從而影響酶反應速率[30]。本實驗中，當pH值小于6.0時，隨著緩沖液pH值的升高，12-LOXcd的活性狀態(tài)可能在逐漸地向有利于催化反應發(fā)生的方向發(fā)生改變，因此隨著pH值的逐漸升高，12-LOXcd活力呈逐漸增大趨勢。

圖 5 pH值對大豆LOX和豬肉12-LOXcd活力的影響Fig. 5 Effect of pH value on the activity of soybean LOX and pig muscle 12-LOXcd

進一步考察酶pH值穩(wěn)定性，測定兩種酶在不同pH值（4.0～10.0）緩沖液體系下孵育1 h后的剩余酶活力。由圖6可知，豬肉12-LOXcd在中性和酸性條件下穩(wěn)定性較差，隨著pH值的升高，豬肉12-LOXcd的穩(wěn)定性明顯提高，而大豆LOX在堿性環(huán)境下穩(wěn)定性較差。在pH 10條件下處理1 h，豬肉12-LOXcd的殘留活力高達初始酶活力的80%，而此時大豆LOX的殘留活力僅為初始酶活力的40%。

圖 6 大豆LOX和豬肉12-LOXcd的pH值穩(wěn)定性Fig. 6 pH stability of soybean LOX and pig muscle 12-LOXcd

2.4.2 溫度對酶活力及穩(wěn)定性的影響

由圖7可以看出，豬肉12-LOXcd和大豆LOX活力均呈先上升后下降的趨勢，其最適反應溫度分別為30 ℃和20 ℃。何立超等[31]研究發(fā)現(xiàn)櫻桃谷鴨胸肉LOX純酶的最適溫度為30 ℃，與本研究具有一致性；而王邦國等[32]研究發(fā)現(xiàn)白鰱魚肌肉LOX最適作用溫度為40 ℃，這與本研究結果存在一定差異，可能與不同種類的動物有關。溫度升高能夠增加反應的活化分子數(shù)，從而加快反應速率，促進酶促反應。但溫度過高導致蛋白質變形，又會使酶活力下降。在本實驗中當溫度上升到約45 ℃時，豬肉12-LOXcd活力下降至最適溫度條件下的50%以下，說明豬肉12-LOXcd蛋白質在此溫度條件下可能已經(jīng)發(fā)生變性，而在溫度達到60 ℃時，酶活力基本為零。

圖 7 溫度對豬肉12-LOXcd和大豆LOX活力的影響Fig. 7 Effect of temperature on the activity of soybean LOX and pig muscle 12-LOXcd

進一步觀察兩種LOX的熱穩(wěn)定性，分別在10～70 ℃條件下孵育酶液30 min，取出并立即在冰水浴中冷卻后，測定殘余脂氧合酶活力，由圖8可知，隨著溫度的升高，豬肉12-LOXcd與大豆LOX殘留活力均不斷下降，但豬肉12-LOXcd殘留活力的變化比較平緩，在40 ℃時仍保留70%以上活力；而大豆LOX的殘留酶活力急劇下降。陳欣等[29]的研究結果顯示，大豆LOX與麻鴨LOX的殘留活力均隨溫度的升高而降低，當溫度低于50 ℃時，兩者的變化不明顯，但當溫度高于50 ℃時，大豆LOX殘留酶活急劇下降，而麻鴨LOX殘留酶活力的變化則較為平緩。因此LOX在肉制品的加工應用中能夠保持一定的活力。

圖 8 豬肉12-LOXcd和大豆LOX的熱穩(wěn)定性Fig. 8 Thermal stability of soybean LOX and pig muscle 12-LOXcd

2.4.3 NaCl添加量對酶活力的影響

圖 9 NaCl添加量對豬肉12-LOXcd、大豆LOX活力的影響Fig. 9 Effect of NaCl concentration on the activity of soybean LOX and pig muscle 12-LOXcd

由圖9可以看出，豬肉12-LOXcd活力在NaCl質量分數(shù)為1%時達到最高。繼續(xù)增加鹽分含量，酶活力略微下降，但仍能夠保持較高的活力。這與Jin Guofeng等[23]的研究結果具有一定的一致性，即在一定范圍內增加培根中鹽分含量能夠促進肌肉中脂肪的氧化，但當鹽分含量達到一定值后，若繼續(xù)增大鹽分含量又會抑制脂質氧化?？傮w而言，豬肉12-LOXcd在較高NaCl質量分數(shù)下較穩(wěn)定，而大豆LOX活力則隨著NaCl質量分數(shù)的增加而持續(xù)降低。

2.5 豬肉12-LOXcd的底物特異性

以亞油酸、亞麻酸和花生四烯酸作為反應的底物，根據(jù)雙倒數(shù)作圖法求得各個底物的Km,檢測豬肉12-LOXcd對不同底物的親和性。求得亞油酸的Km為0.40 mmol/L，亞麻酸Km為0.55 mmol/L，花生四烯酸Km為4.15 mmol/L。Km越小，底物親和力越大，因此豬肉12-LOXcd對亞油酸的親和性最高，這與Gata等[22]研究結果具有一致性。

3 結 論

LOX對肉品加工貯藏過程中的風味品質起重要調節(jié)作用，目前國內外研究相對較少，僅有Jin Guofeng等[23]、郇延軍[13]研究了干腌肉制品加工過程中LOX活力變化，表征了粗酶的變化及其活性；此外，Gata等[22]通過復雜的純化步驟從豬股二頭肌中分離得到一種LOX，初步研究顯示其可能參與伊比利亞火腿的風味形成。本研究運用基因重組技術將豬肉12-LOXcd基因克隆到表達載體pMBP，并導入到大腸桿菌中進行誘導表達，成功構建pMBP-12-LOXcd的大腸桿菌表達體系；通過Ni-NTA親和層析和凝膠過濾層析，最終獲得了高純度的12-LOXcd，并對其酶學性質進行了研究。結果表明，在以亞油酸為底物時，豬肉12-LOXcd受溫度、pH值和NaCl質量分數(shù)的調節(jié)，其最適反應溫度為30 ℃，最適pH值為6.0，在NaCl質量分數(shù)1%時活性最高，并且在較高NaCl質量分數(shù)下仍保持較高活性。因此，通過調節(jié)肉品加工過程的加工條件可以調控LOX活性及脂質酶促氧化的進程。