一株P(guān)RRSV N蛋白單克隆抗體制備及其抗原表位鑒定

李敏華，王 倩，田志軍*，金 濤*

(1.黑龍江大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150080；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江 哈爾濱 150069)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由 PRRS 病毒(PRRSV)引起的影響世界養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重要傳染病之一。該病毒是單股正鏈RNA 病毒，屬于套式病毒目、動(dòng)脈炎病毒科、動(dòng)脈炎病毒屬[1]。PRRSV 基因組全長(zhǎng)約為 15 kb，包含 10 個(gè)開放閱讀框(ORFs)。ORF1a 和 ORF1b 編碼至少 14 個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，包括NSP1α、NSP1β、NSP2-NSP6、NSP7α、NSP7β 和NSP8-NSP12。而 ORF2a、ORF2b、ORF3～ORF7 則編碼8種結(jié)構(gòu)蛋白：GP2、E、GP3、GP4、GP5、M、N 和 GP5a[2-3]。PRRSV N 蛋白是構(gòu)成 病 毒粒 子的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，也是組成病毒核衣殼的唯一蛋白，其主要作用是包裹病毒基因組RNA，但其僅含有 123aa (美洲型)或者 128aa (歐洲型)[4]。研究表明PRRSV N 蛋白雖無(wú)中和抗原的作用，卻具有極強(qiáng)的免疫原性[5]，豬群在感染PRRSV 后僅需1 周即能夠檢測(cè)到針對(duì) N 蛋白的抗體[6]。同時(shí)，N 蛋白具有高度的保守性，使得檢測(cè)PRRSV N 蛋白抗體成為檢測(cè)PRRSV 感染的重要指標(biāo)。目前PRRSV 在我國(guó)處于活躍期，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成的損失重大。抗體檢測(cè)方法在疫病防控中起重要作用，而我國(guó)目前PRRSV 抗體檢測(cè)主要依靠國(guó)外進(jìn)口的檢測(cè)試劑盒，價(jià)格昂貴，因此建立特異性好、敏感性高的國(guó)產(chǎn)PRRSV 抗體檢測(cè)方法對(duì)我國(guó)PRRSV 防控意義重大。

1 材料與方法

1.1 病毒及主要試劑 PRRSV SD53 株(類NADC30 PRRSV)、HP-PRRSV HuN4及其疫苗株 HuN4-F112、其它PRRSV疫苗株(CH-1R、MLV、DV 和 VP046 BIS)、HP-PRRSV M 蛋白MAb及PRRSV陰、陽(yáng)性血清、質(zhì)粒 p3XFLAG-CMV、p3XFLAG-CMV-N、pGEX-6P-1、pGEX-6P-1-N、受體菌TG1、Rosetta(DE3)由本實(shí)驗(yàn)室保存；PRRSV 各結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)粒p3XFLAG-CMV-GP2、p3XFLAG-CMV-GP3、p3XFLAGCMV-GP4、p3XFLAG-CMV-GP5、p3XFLAG-CMV-M和p3XFLAG-CMV-N 均由本實(shí)驗(yàn)室保存。弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HAT、HT、融合劑 PEG、FITC 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG (FITC-IgG)均購(gòu)自 Sigma公司；GST MAb購(gòu)自TIANGEN 公 司 ；DyLightTM800 標(biāo)記的羊抗鼠 IgG 購(gòu)自 KPL 公司；蛋白 Marker購(gòu)自Fermentas 公司；IgG 抗體亞類鑒定試劑盒購(gòu)自Pierce 公司。

1.2 PRRSV MAb 的制備 將PRRSV SD53 株接種到 Marc-145 細(xì)胞中，待細(xì)胞病變到 80 %～90 %時(shí)置-80 ℃反復(fù)凍融3 次，收上清，離心后參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行免疫原制備、小鼠免疫、細(xì)胞融合、陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞篩選純化以及腹水制備。制備的MAb 按照MAb 亞類鑒定試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行鑒定。

1.3 MAb 的間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)

1.3.1 陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞篩選與MAb 效價(jià)的測(cè)定將 PRRSV SD53 株以 6 000 TCID50的劑量感染的Marc-145 細(xì)胞作為檢測(cè)抗原，HP-PRRSV M 蛋白MAb 為陽(yáng)性對(duì)照，SP2/0 細(xì)胞培養(yǎng)上清為陰性對(duì)照，以待檢的雜交瘤細(xì)胞上清為一抗，山羊抗小鼠IgG-FITC (1:200)為二抗，采用 IFA 篩選與 PRRSV反應(yīng)的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，并將陽(yáng)性細(xì)胞克隆純化后制備腹水，10 倍倍比稀釋后按照該IFA 方法測(cè)定陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液上清和腹水的IFA 效價(jià)。

1.3.2 MAb 與 PRRSV 結(jié)構(gòu)蛋白反應(yīng)的檢測(cè) 將PRRSV 各結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)粒 p3XFLAG-CMV-GP2、p3XF LAG-CMV-GP3、p3XFLAG-CMV-GP4、p3XFLAG-C MV-GP5、p3XFLAG-CMV-M 和 p3XFLAG-CMV-N 分別轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，將收獲的表達(dá)PRRSV 各結(jié)構(gòu)蛋白的細(xì)胞作為檢測(cè)抗原，參照1.3.1 方法，鑒定篩選的MAb 與其反應(yīng)的結(jié)構(gòu)蛋白。

1.3.3 MAb 特異性的檢測(cè) 以 HP-PRRSV HuN4 及其疫苗株 HuN4-F112、CH-1R、MLV、DV 和 VP046 BIS 株感染的Marc-145 細(xì)胞為檢測(cè)抗原，參照1.3.1 IFA 方法，檢測(cè) MAb 與其它類型 PRRSV 的交叉反應(yīng)性。

1.4 MAb 的western blot 鑒定 將感染和未感染PRRSV SD53 株的 Marc-145 細(xì)胞作為抗原，參照文獻(xiàn)[8]，以制備的 MAb 作為一抗，DyLight 800 標(biāo)記的山羊抗鼠 IgG (1∶5 000)為二抗，western blot 分析MAb 的反應(yīng)性。

1.5 MAb 的阻斷 ELISA 分析 將超速離心的PRRSV HuN4-F112 株用包被液稀釋后置于 96 孔板中，每孔 500 ng，參照文獻(xiàn)[9]檢測(cè)篩選出的 MAb與包被的PRRSV 的結(jié)合能否被PRRSV 陽(yáng)性血清阻斷。

1.6 MAb 抗原表位的鑒定 根據(jù)PRRSV SD53 株N 蛋白的基因序列設(shè)計(jì)合成兩對(duì)引物，以pGEX-6P-1-N 質(zhì)粒為模板對(duì) N 蛋白基因序列分段PCR 擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物 N1、N2 部分重疊，將其分別克隆于pGEX-6p-1 載體中，將構(gòu)建的兩個(gè)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞后，分別以 GST MAb (1∶5 000)和獲得的MAb (雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清)作為一抗，Dy-Light 800 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(1∶5 000)為二抗對(duì)獲得的 MAb 進(jìn)行 western blot 鑒定，以確定 MAb 識(shí)別的抗原區(qū)域。根據(jù)鑒定結(jié)果，再將N2 片段的基因序列從 5' 端逐步截短分成 N21、N22、N23、N24、N25、N26、N27、N28、N29 和 N30，以上述 western blot 方法進(jìn)一步鑒定MAb 識(shí)別的抗原表位。

1.7 抗原表位序列的比對(duì) 從GenBank 中下載28株具有代表性的PRRSV 病毒株，根據(jù)MAb 識(shí)別的抗原表位，采用DNAStar 對(duì)該區(qū)域的堿基序列進(jìn)行保守性分析。

2 結(jié) 果

2.1 PRRS V MAb 制備及IFA 檢測(cè)結(jié)果 將小鼠脾細(xì)胞與SP2/0 細(xì)胞融合后經(jīng)過(guò)4 次亞克隆純化，通過(guò)IFA 方法篩選出1 株穩(wěn)定分泌 MAb 的雜交瘤細(xì)胞株，命名為1H4。經(jīng)IgG 抗體亞類鑒定試劑盒檢測(cè)，該 MAb 為 IgG1 亞類，輕鏈為 κ 鏈。將雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清和制備的腹水分別系列稀釋后進(jìn)行IFA 檢測(cè)，結(jié)果顯示細(xì)胞MAb 上清和腹水效價(jià)分別為 1∶40 和 1∶3 200，與轉(zhuǎn)染 PRRSV各結(jié)構(gòu)蛋白的293T細(xì)胞IFA檢測(cè)結(jié)果顯示，1H4 MAb 僅 與PRRSV N 蛋白反應(yīng)(圖1，1H4 與其余 PRRSV 結(jié)構(gòu)蛋白反應(yīng)結(jié)果未給出)。MAb 特異性檢測(cè)結(jié)果顯示，1H4 與 HP-PRRSV HuN4 及其疫苗株 HuN4-F112、CH-1R、MLV 均反應(yīng)，與歐洲型 DV 和 VP046 BIS不反應(yīng)(圖1)。表明本研究制備了一株 PRRSV N 蛋白 MAb，該 MAb 僅與美洲型 PRRSV 株反應(yīng)，而不與歐洲型PRRSV 株反應(yīng)。

2.2 MAb 的western blot 鑒定結(jié)果 將接種PRRSV SD53 株的 Marc-145 細(xì)胞裂解，以 western blot 鑒定MAb 的反應(yīng)性。結(jié)果顯示在 10 ku～15 ku 處有 1 條特異性的目的條帶，與預(yù)期相符合(圖2)。表明MAb 1H4 能夠特異性識(shí)別PRRSV 全病毒。

2.3 MAb 的阻斷ELISA 分析結(jié)果 以超速離心的PRRSV HuN4-F112 株為包被抗原，利用阻斷ELISA分析制備的MAb 的阻斷性。結(jié)果顯示，PRRSV 陰、陽(yáng)性血清的OD450nm值并未隨著其稀釋度的增加而有明顯變化，且陰、陽(yáng)性血清OD450nm值之比均高于6(圖3)，表明在所測(cè)試的稀釋度(1∶16)范圍內(nèi)，PRRSV HuN4-F112 株陽(yáng)性血清能夠很好地阻斷MAb與病毒的結(jié)合，即 1H4 與病毒的結(jié)合能被PRRSV陽(yáng)性血清阻斷。

圖1 以感染PRRSV 不同病毒株或轉(zhuǎn)染表達(dá)PRRSV N 蛋白重組質(zhì)粒的293T 細(xì)胞對(duì)1H4 MAb 的 IFA 鑒定Fig.1 Identification of the MAb on 293T cells infected with different PRRSV strains or transfected with the recombinant plasmid expressing PRRSV N protein by IFA

圖2 1H4 MAb 與 PRRSV 反應(yīng)的western blot 檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Identification of 1H4 MAb by western blot

2.4 MAb 針對(duì)的抗原表位的鑒定 將PRRSV SD53株 N 蛋白序列分成 N1 和 N2 兩段，原核表達(dá)后，western blot 結(jié)果顯示1H4 MAb 僅與片段 N2 發(fā)生特異性結(jié)合；再將N2 片段的序列從5' 端逐步截短分成 N21、N22、N23、N24、N25、N26 和 N27。再繼續(xù)截短成 N28、N29 和 N30，結(jié)果顯示，1H4 MAb能夠與前7 個(gè)片段發(fā)生反應(yīng)，而均不與后面3 個(gè)片段反應(yīng)(圖4)，表明1H4 MAb 識(shí)別的氨基酸序列是PRRSV SD53 株N 蛋白長(zhǎng)度為17 個(gè)氨基酸的片段，即 aa107～aa123：107PTQHTVRLIRATASPSA123。

圖3 PRRSV HuN4-F112 株陽(yáng)性血清阻斷1H4 MAb 與病毒結(jié)合的結(jié)果Fig.3 The detection of the binding activity of the MAb to the virus blocked by PRRSV-positive serum

圖4 1H4 MAb 對(duì)PRRSV-N B 細(xì)胞抗原決定族的多肽掃描技術(shù)鑒定Fig.4 Identification of PRRSV-N B-cell epitope with the MAb by pepscan technique

2.5 MAb 表位序列的比對(duì)分析 利用DNAStar 軟件對(duì)近年分離的28 株國(guó)內(nèi)外PRRSV 株相應(yīng)區(qū)域的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示其N 蛋白末端aa107～aa123 在 HP-PRRSV中高度保守；在經(jīng)典PRRSV 中有 2 個(gè)突變位點(diǎn)，相對(duì)保守；在類NADC30 PRRSV 中的突變情況與經(jīng)典株比較接近，但變異程度比經(jīng)典株大(圖5)。然而，1H4 與經(jīng)典株CH-1R、MLV 和類 NADC30 PRRSV 進(jìn)行 IFA 檢測(cè)均有熒光反應(yīng)，表明在N 蛋白Q109H 和A117V 兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)的突變不影響1H4 對(duì)該表位的識(shí)別，表明1H4 識(shí)別的抗原表位在美洲型PRRSV 株中高度保守。

圖5 MAb 1H4 識(shí)別的表位在PRRSV 不同病毒株間的序列比對(duì)Fig.5 Comparison of the epitope recognized by the MAb among the different strains of PRRSV

3 討 論

本研究利用PRRSV SD53 株感染Marc-145 病變后的細(xì)胞上清作為抗原制備MAb，與體外表達(dá)的蛋白相比，上清中的全病毒保持了病毒蛋白的天然構(gòu)象，免疫原性強(qiáng)，免疫后產(chǎn)生的抗體更接近野毒感染所產(chǎn)生的抗體，以全病毒作為免疫原，免疫后更易產(chǎn)生能夠被相應(yīng)病毒陽(yáng)性血清所阻斷的MAb[9]。此外，本研究將全病毒感染的Marc-145 細(xì)胞與未接毒的Marc-145 細(xì)胞混合，經(jīng)IFA 方法篩選雜交瘤細(xì)胞株，可以有效提高M(jìn)Ab 篩選的特異性。

N 蛋白在病毒粒子中含量較高，約占病毒蛋白總量的20 %～40 %。與其它蛋白相比，N 蛋白保守性較高，其氮基酸同源性在美洲型PRRSV 之間為96 %～100 %，而其與歐洲型PRRSV 之間同源性僅為 56 %～59 %[10]。1H4 MAb 識(shí)別的抗原表位為aa107～aa123，導(dǎo)致該 MAb 無(wú)法與歐洲型 PRRSV病毒株該區(qū)域氨基酸特異性結(jié)合，因此1H4 MAb 僅特異性地與美洲型PRRSV 株反應(yīng)。

研究者對(duì)PRRSV N 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析，顯示 N 蛋白的 β- 折疊區(qū)域位于 aa3～aa16、aa33～aa56、aa60～aa70 和 aa111～aa117，該區(qū)域很容易形成一種外顯結(jié)構(gòu)，表明N 蛋白上述區(qū)域更易形成抗原表位[11-12]。本研究經(jīng)軟件預(yù)測(cè)得到的1H4 MAb識(shí)別的N 蛋白抗原表位為aa111～aa117，而經(jīng)鑒定得到該MAb 識(shí)別的最短抗原表位為aa107～aa123，從理論上也證明了N 蛋白中存在該MAb 的識(shí)別表位。研究顯示，通過(guò)美洲型PRRSV 株的一組MAb與不同N 蛋白片段的免疫反應(yīng)試驗(yàn)，鑒定了N 蛋白的5個(gè)抗原表位，分別位于aa30～aa52、aa37～aa52、aa52～aa69、aa69～aa112 和 aa112～aa123[13]。1H4 MAb 識(shí)別的抗原表位覆蓋aa112～aa123，并與aa69～aa112 在107PTQHTV112有 6 個(gè)氨基酸的重疊。研究顯示，刪除美洲型PRRSV N 蛋白C 端11 個(gè)氨基酸后，幾乎阻止了所有構(gòu)象依賴的MAb 對(duì)其的識(shí)別，因此 C 端(aa112～aa123)可能對(duì)維持 N 蛋白的整體結(jié)構(gòu)起著重要作用，且識(shí)別 N 蛋白 aa69～aa112 與aa112～aa123 抗原表位的 MAb 均未被報(bào)道具有被PRRSV 陽(yáng)性血清阻斷的能力[11]。Wang 等制備出的HP-PRRSV MAb 在進(jìn)行阻斷ELISA 試驗(yàn)時(shí)，陽(yáng)性血清的OD450nm值隨著血清稀釋度的增加而升高[14]，而本研究中陽(yáng)性血清的OD450nm值隨著稀釋倍數(shù)的提高而未發(fā)生明顯變化，表明1H4 MAb 可以被低抗體水平的PRRSV 陽(yáng)性血清所阻斷，該MAb 的制備為建立高靈敏度的美洲型PRRSV 阻斷ELISA 檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)。