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    四川部分地區(qū)犬圓環(huán)病毒的病原檢測(cè)及基因組特征

    2019-05-21 07:07:34李明翔
    關(guān)鍵詞:基因組糞便陽性率

    嚴(yán) 楠,馮 帆,李明翔,湯 承,岳 華

    (西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,四川 成都 610041)

    犬圓環(huán)病毒(Canine Circovirus, CanineCV)是無囊膜的環(huán)狀單鏈DNA 病毒,于2012年首次在美國(guó)發(fā)現(xiàn)[1]。隨后的研究表明,該病毒可以引起犬急性腹瀉、嘔吐等癥狀[2-3]。作為一種新型圓環(huán)病毒,CanineCV 對(duì)犬科動(dòng)物的危害受到越來越多的關(guān)注[4-5]。CanineCV 不僅存在于犬的腸道內(nèi),還在其肝臟、脾臟和淋巴組織中被檢測(cè)到,表明該病毒可能與宿主免疫抑制有關(guān)[2],其致病機(jī)制可能與豬圓環(huán)病毒2型(Porcine Circovirus,PCV-2)相似[6-7]。最近的研究顯示,CanineCV常與犬細(xì)小病毒2型(Canine parvovirus,CPV-2)、犬冠狀病毒(Canine Coronavirus,CCoV)和犬瘟熱病毒(Canine distempervirus,CDV)共感染,在腸道疾病中起協(xié)同作用從而導(dǎo)致臨床癥狀加重[6];或者在其它病原體損傷宿主腸道上皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞后,CanineCV 的致病性發(fā)生變化,從而加重病情[7]。由于CanineCV 還沒有合適的細(xì)胞培養(yǎng)體系,其確切的致病性仍不清楚。目前,Gen-Bank 中所有完整的CanineCV 基因組大小均為2 063 nt,具有3 個(gè)開放閱讀框(ORF),其中ORF1 編碼病毒復(fù)制酶蛋白(Rep),ORF2編碼衣殼蛋白(Cap),ORF3編碼的蛋白功能尚不清楚[1,3-4]。

    該病毒目前已在美國(guó)、意大利、泰國(guó)和德國(guó)等地區(qū)流行[1,3,5,8],但國(guó)內(nèi)關(guān)于該病毒的研究報(bào)告較少。2016年孫文超等從廣西地區(qū)20份犬血清樣本中檢測(cè)出 1份CanineCV 陽性并獲得其基因組,隨后建立了 CanineCV 熒光定量 PCR 檢測(cè)方法[9-10];汪偉等進(jìn)行了CanineCV Rep 蛋白的原核表達(dá)及CanineCV ORF3 基因的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建[4,11];但CanineCV 在國(guó)內(nèi)的流行狀況仍不清楚,還未見到對(duì)犬腹瀉樣本進(jìn)行CanineCV 調(diào)查的報(bào)道。本研究采用熒光定量PCR 方法檢測(cè)四川部分地區(qū)犬腹瀉樣本的CanineCV,豐富該病原在國(guó)內(nèi)的流行病學(xué)資料;采用PCR 方法擴(kuò)增出6 個(gè)完整的CanineCV Rep 基因序列以及1 株CanineCV 四川流行株的完整基因組,有助于了解CanineCV 國(guó)內(nèi)流行株的遺傳多樣性。

    1 材料與方法

    1.1 犬腹瀉樣品 208份寵物犬腹瀉糞便樣品于2015年~2017年采集自四川省6 家寵物醫(yī)院,其中141份來自成都市 4 家寵物醫(yī)院(2015年39份、2016年62份和 2017年40份),32份來自西昌 市 1家寵物醫(yī)院(2015年10份、2016年12份和 2017年10份),35份來自遂寧市 1 家寵物醫(yī)院(2015年12份 、2016年13份和 2017年10份)。取適量糞 便樣品與PBS 緩沖液,按照1∶10 的比例稀釋渦旋振蕩5 min,4 ℃ 12 000 r/min 離心 15 min。離心后取上清液置于EP 管中,儲(chǔ)存在-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2 主要試劑 膠回收提取試劑盒、核酸提取試劑盒購自O(shè)MEGA BIO-TEK公司。DNA Marker Ⅱ 、TRIzolTM、Prime ScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒、pMD19-T 載體試劑盒均購自 TaKaRa 公司。E.coliDH5α 購自天根生化科技(北京)有限公司。

    1.3 犬腹瀉糞便樣本的檢測(cè) 采用核酸提取試劑盒提取 208份犬糞便樣本的 DNA,根據(jù) Hsu[8]建立的CanineCV 的熒光定量 PCR 方法對(duì) 208份糞便樣本DNA 進(jìn)行檢測(cè)。按照TRIzol 試劑盒說明書提取CanineCV 陽性糞便樣本 RNA,反轉(zhuǎn)錄成 cDNA,于-20 ℃保存?zhèn)溆?。隨后對(duì)CanineCV 陽性樣本參照文獻(xiàn)[12]分別檢測(cè) CPV-2、CCoV 和 CDV,以調(diào)查該樣品混合感染情況。

    1.4 CanineCV 完整Rep 基因的擴(kuò)增及序列分析參考文獻(xiàn)[9]中的引物(Rep-F:5'-GTATTACCCGG CACCTCGTC-3' 和 Rep-R:5'-CGGAGCGAGAGGCC TTTATC-3')擴(kuò)增Rep 全基因,引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。以提取的CanineCV陽性樣本 DNA 為模板,采用 25 μL 反應(yīng)體系,反應(yīng)條件為 94 ℃ 5 min;94 ℃ 55 s、56 ℃ 50 s、72 ℃1 min,共 40 個(gè) 循環(huán) ;72 ℃ 10 min。PCR 產(chǎn) 物經(jīng)1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),回收純化后克隆至pMD19-T 載體,篩選陽性重組質(zhì)粒,重組菌液由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序鑒定。測(cè)序后將所獲得序列與GenBank 中的相似序列應(yīng)用MegAlign(DNAStar 7.0)軟件進(jìn)行同源性分析,并采用MEGA 7 軟件 ClustalW 法進(jìn)行序列比對(duì),利用Neighbor-Joining 法建立系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析,重復(fù)次數(shù)為1000。

    1.5 CanineCV 四川株(CD17/2016)全基因組擴(kuò)增及分析 設(shè)計(jì)3 對(duì)擴(kuò)增上述獲得的CanineCV 四川株(CD17/2016)的全基因組的引物,其中1 對(duì)引物參照 文 獻(xiàn) [9](Rep-F:5'-GTATTACCCGGCACCTCGTC-3'/Rep-R:5'-CGGAGCGAGAGGCCTTTATC-3'),另外兩對(duì)引物參照GenBank 中登錄的CanineCV 序列(KC241984 和 KT734814)設(shè)計(jì)(CanineCV-P2F:5'-TA TCGGCGGCTCAGTATCAT-3'/CanineCV-P2R:5'-CA GACACTTCTACATCCCAAATC-3';CanineCV-P3F:5'-TCGTGACACTGAATGGCGTTTG-3'/Canine CVP3R:5'-GAGGTGTGCTGTGTCTGTGACGAGG-3')。以CD17/2016 的 DNA 為模板,利用3 對(duì)引物分別擴(kuò)增,PCR 產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序后利用SeqMan (DNAStar 7.0)軟件拼接序列。將獲得的CanineCV 全基因組序列利用BLAST 軟件(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)與參考序列比較分析。

    1.6 統(tǒng)計(jì)分析 統(tǒng)計(jì)分析不同年份CanineCV 的陽性率,采用SPSS16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,檢驗(yàn)方法為 χ2檢驗(yàn)。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 CanineCV 的陽性率及與其它病原共感染的情況 采用PCR 方法檢測(cè)四川部分地區(qū)CanineCV 的感染情況,結(jié)果顯示,208份犬腹瀉糞便樣品中共檢出32 個(gè) CanineCV 陽性樣本,平均陽性率為 15.4%;成都市的平均陽性率為16.3 % (23/141);西昌市的平均陽性率為12.5 % (4/32);遂寧市的平均陽性率為14.3 % (5/35)。32份 CanineCV陽性樣品中,25份與 CPV-2 混合感染,18份與 CCoV 混合感染,14份與CDV 混合感染。對(duì)不同年份的CanineCV 陽性率統(tǒng)計(jì)與分析,結(jié)果顯示,3年間CanineCV 的陽性率無顯著差異(p>0.05) (表1)。本研究首次對(duì)國(guó)內(nèi)腹瀉犬糞便樣本進(jìn)行了CanineCV 的調(diào)查,結(jié)果表明CanineCV 已經(jīng)在四川部分地區(qū)腹瀉寵物犬中流行,并且與 CPV-2、CCoV 和 CDV 混感率很高,這與對(duì)美國(guó)和臺(tái)灣地區(qū)的犬腹瀉糞便中CanineCV 感染的調(diào)查結(jié)果相似[2,8]。已經(jīng)證實(shí),CanineCV 與 CPV-2等重要腸道病毒的混合感染會(huì)加重患病犬的臨床表現(xiàn)并使得治療更加困難[6-7]。目前國(guó)內(nèi)對(duì)于犬腹瀉病原的診斷常限于 CPV-2、CCoV 和 CDV 等常見病原,本研究結(jié)果建議把CanineCV 作為犬腹瀉病原診斷的一個(gè)檢測(cè)內(nèi)容。

    2.2 CanineCV Rep 基因序列分析 利用引物Rep-F/Rep-R 從 6份陽性樣品中擴(kuò)增出了 984 bp 的目的片段,克隆后測(cè)序獲得了 6 株 CanineCV(CDX2/2017、CDX8/2017、CQS2/2016、CQS8/2016、CQM7/2016 和 CD17/2016) 完整的 Rep 基因序列(MG266900~MG266904 和 MG266899),序列長(zhǎng)度均為 912 bp,編碼303aa?;诤塑账嵝蛄型葱苑治鲲@示6 株Rep 序列同源性為99.6 %~99.9 %,與GenBank 中參考株的Rep 基因序列同源性為82.5 %~97.6 %。遺傳進(jìn)化分析顯示,本研究獲得的6 條Rep 基因序列與部分意大利、德國(guó)和美國(guó)病毒株聚在一個(gè)大分支,但聚為一個(gè)獨(dú)特的亞支(圖1),本研究6 條 Rep 基因序列與GenBank 中的其它 CanineCV Rep 序列相比有4 個(gè)相同核苷酸的同義替換(51T、195T、234T、345C)。Rep 蛋白為 CanineCV 基因組中最大的 ORF1 所編碼,主要參與病毒的復(fù)制[11]。為進(jìn)一步研究中國(guó)CanineCV Rep 基因的分子特征,本研究獲得了6 條完整的CanineCV Rep 基因序列。結(jié)果顯示中國(guó)CanineCV 株的Rep 基因具有遺傳多樣性,而四川部分地區(qū)的 CanineCV 株的 Rep 基因具有4 個(gè)相同核苷酸的同義替換,表現(xiàn)出共進(jìn)化的趨勢(shì)。盡管CanineCV Rep 中同義替換的意義還不清楚,但在鴨圓環(huán)病毒和類圓環(huán)病毒中,Rep 序列中的同義替換時(shí)有發(fā)生,可能是進(jìn)化過程中的中性選擇壓力所導(dǎo)致的[13-14]。

    表1 犬腹瀉糞便樣品CanineCV 陽性率及混合感染結(jié)果Table 1 Analysis of the CanineCV positive samples

    2.3 CanineCV 基因組序列分析 利用引物Rep-F/Rep-R、CanineCV-P2F/CanineCV-P2R 和 Canine CV-P3F/CanineCV-P3R 從1份陽性樣品中擴(kuò)增出了984 bp、391 bp 和 970 bp 的目的片段,測(cè)序后拼接獲得了的CanineCV CD17/2016 株的完整基因組序列(MG266899)?;?因組 長(zhǎng) 度 為 2 063 bp,共 3 個(gè)ORF,其 ORF1 編碼病毒復(fù)制酶蛋白 Rep (303aa);ORF2 編碼病毒衣殼蛋白 Cap (270aa);ORF3 全長(zhǎng)519 bp,編碼 172aa。CD17/2016 的基因組有兩個(gè)位于起始密碼子和終止密碼子之間的基因間隔區(qū)(長(zhǎng)度為 203 bp 和 135 bp)。相比于其它 CanineCV 株,包括本研究中獲得的另外5 條Rep 基因序列,CD17/2016 株的Rep 基因中共有10 個(gè)核苷酸的非同義替換,導(dǎo)致Rep 蛋白具有7 個(gè)獨(dú)特的氨基酸變化(255H、256F、257Y、258T、279R、297S、299T),所有的變化均集中在Rep 蛋白aa255~aa299 之間,位于 Rep 的 3' 端。目前關(guān)于 CanineCV Rep 基因各區(qū)域的功能尚不清楚,但來自PCV-2 的研究表明,Rep 3' 端區(qū)域的氨基酸變化可以導(dǎo)致PCV-2 的致病性改變[15]。因此,有必要進(jìn)一步研究 CanineCV CD17/2016 株Rep 3' 端區(qū)域氨基酸變化的生物學(xué)意義。

    本研究首次對(duì)國(guó)內(nèi)犬腹瀉樣本進(jìn)行CanineCV感染的調(diào)查,結(jié)果顯示CanineCV 已經(jīng)在四川部分地區(qū)的寵物犬中流行,因此建議把CanineCV 作為犬腹瀉病原診斷的一個(gè)檢測(cè)內(nèi)容。本研究獲得了1株 CanineCV 四川株的全基因組,與國(guó)內(nèi)登錄在GenBank 的另外兩個(gè)基因組(KT946839.1 和MF797786.1)遺傳距離關(guān)系較遠(yuǎn),有助于了解 CanineCV 國(guó)內(nèi)流行株的遺傳多樣性。

    圖1 基于Rep 全基因核苷酸序列遺傳進(jìn)化分析Fig.1 Phylogenetic tree (N-J) based on the complete Rep gene of CanineCV

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