布魯氏菌病溫敏凝膠活疫苗(S2株)對(duì)小鼠不同黏膜免疫途徑的免疫效果研究

劉 燕，徐 磊，王 蕾，張 賀，王 楠，鞠洪濤，張小軍，王苗苗，孫浩杰，丁家波，沈國(guó)順，毛開(kāi)榮*

(1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110866；2.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；3.齊魯動(dòng)物保健品有限公司，山東 濟(jì)南 250105)

布魯氏菌病(Brucellosis)，是由布魯氏菌引起的一種人獸共患病。不僅給畜牧業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重?fù)p失，同時(shí)威脅人類健康和公共衛(wèi)生安全[1]。我國(guó)已將布魯氏菌病列為二類動(dòng)物疫病，并且列入《 國(guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃(2012～2020)》重點(diǎn)防控疫病目錄。家畜布魯氏菌病防控的主要措施是撲殺凈化與免疫，而我國(guó)目前免疫是防控布魯氏菌病的主要手段。國(guó)內(nèi)外用于動(dòng)物防控的布魯氏菌病弱毒活疫苗菌株主要包括：牛種布魯氏菌S19(A19)、羊種布魯氏菌 M5、Rev.1、豬種布魯氏菌 S2[2]。這些疫苗中，除S2 主要通過(guò)口腔黏膜免疫外，其它則主要采用注射免疫，后者會(huì)導(dǎo)致孕畜流產(chǎn)，因此黏膜免疫更適合臨床應(yīng)用。布魯氏菌病活疫苗(S2 株)通過(guò)口腔黏膜免疫，其抗體最多只維持6 個(gè)月左右，相對(duì)注射免疫抗體可能長(zhǎng)達(dá)18 個(gè)月來(lái)說(shuō)，口腔黏膜免疫有利于鑒別疫苗免疫和自然感染。

溫敏凝膠是指以溶液狀態(tài)給藥后，利用高分子材料對(duì)外界溫度的響應(yīng)發(fā)生相轉(zhuǎn)變的特性，由液態(tài)轉(zhuǎn)化為非化學(xué)交聯(lián)半固體凝膠的制劑[3]。將溫敏凝膠與藥物結(jié)合，通過(guò)給藥部位由液態(tài)轉(zhuǎn)變成半固態(tài)，可達(dá)到固定藥物減少流失的作用，并且起到緩慢釋放藥物的效果[4-5]。采用溫敏凝膠搭載流感病毒[6]、球蟲(chóng)[7]、口蹄疫多肽[8]、防齲基因疫苗[9]、蛋白[10]等均有報(bào)道。將布魯氏菌病疫苗制備成溫敏凝膠劑型，有助于減少疫苗流失，增加生物利用度并減少因黏膜免疫時(shí)疫苗向體外擴(kuò)散帶來(lái)的生物安全問(wèn)題。

為評(píng)價(jià)凝膠劑型的布魯氏菌病疫苗經(jīng)口服、點(diǎn)眼、陰道和直腸灌注4 個(gè)黏膜途徑的免疫效果，本研究采用國(guó)際認(rèn)可的評(píng)價(jià)布魯氏菌病疫苗的小鼠動(dòng)物模型，比較了溫敏凝膠劑型疫苗、常規(guī)劑型疫苗經(jīng)4 個(gè)黏膜途徑免疫及常規(guī)劑型疫苗經(jīng)皮下注射免疫的效果，進(jìn)一步證實(shí)上述4 個(gè)黏膜途徑均有良好的免疫效果，并且溫敏凝膠劑型具有明顯減少疫苗黏膜免疫時(shí)對(duì)環(huán)境的擴(kuò)散作用。

1 材料與方法

1.1 菌株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 布魯氏菌病活疫苗(S2 株)和布魯氏菌強(qiáng)毒株M28 均由國(guó)家布魯氏菌病參考實(shí)驗(yàn)室保存；100只18g～21g的BALB/c小鼠(6周齡～8周齡)購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑和儀器 泊洛沙姆407 (P407)、泊洛沙姆 188 (P188)購(gòu)自 BASF 公司；布魯氏菌選擇性培養(yǎng)基添加劑購(gòu)自上海艾研生物科技有限公司；布魯氏菌病試管凝集抗原、布魯氏菌病標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、布魯氏菌病標(biāo)準(zhǔn)陰性血清均由國(guó)家布魯氏菌病參考實(shí)驗(yàn)室保存；Rhwolaser Mastertm 微流變儀購(gòu)自法國(guó)formulaction 公司。

1.3 黏膜免疫用溫敏凝膠疫苗的研制 使用溫度計(jì)和非接觸式電子體溫計(jì)測(cè)定小鼠眼部、口腔、陰道、直腸的溫度(實(shí)驗(yàn)小鼠在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中環(huán)境溫度恒定，因此不考慮環(huán)境溫度對(duì)免疫部位溫度的影響)，測(cè)定后對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，選擇合適的凝膠相變溫度范圍。根據(jù)該凝膠相變溫度范圍設(shè)定4 個(gè)配方，按量分別稱取P407 和 P188，緩慢加入生理鹽水，輕輕搖晃，4 ℃放置 18 h～24 h，充分溶脹后即為溫敏凝膠，121 ℃ 30 min 高壓滅菌后4 ℃保存溫敏凝膠。將 S2 疫苗和凝膠按體積比 1∶9 混合，即得布魯氏菌病溫度敏感凝膠疫苗。取4 個(gè)配方的溫敏凝膠疫苗各10 mL 加到Rheolaser MASTERTM微流變儀樣品池中，20 ℃平衡10 min，設(shè)定溫度升高范圍 20 ℃～50 ℃，升溫速率為 0.5 ℃/min，啟動(dòng)程序?qū)悠愤M(jìn)行掃描，獲得樣品的相變溫度及理化性質(zhì)。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 將實(shí)驗(yàn)小鼠分別按照點(diǎn)眼(A組)、口服(B組)、陰道灌注(C組)、直腸灌注(D組)、皮下注射(E組) 5 種不同免疫途徑設(shè)定實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)設(shè)對(duì)照組(F組)，每組 20 只。另 A、B、C、D 黏膜途徑免疫組均分別設(shè)凝膠疫苗免疫實(shí)驗(yàn)組和常規(guī)疫苗免疫對(duì)照組，每組 10 只。免疫 45 d 后，以 5×105cfu/ 只(布魯氏菌M28)肌肉注射攻毒全部小鼠。

1.5 小鼠免疫部位的排菌量測(cè)定 各組小鼠免疫后30 min、3 h、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d，采用棉簽擦拭點(diǎn)眼、陰道灌注、口服、直腸灌注免疫部位的小鼠體表，再涂布于布魯氏菌選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)皿，37 ℃培養(yǎng)72 h 后，觀察并統(tǒng)計(jì)布魯氏菌菌落數(shù)。

1.6 小鼠體液免疫水平測(cè)定 小鼠免疫后21 d、45 d (攻毒)、66 d、90 d 時(shí)，經(jīng)小鼠眼眶靜脈叢分別采集各組小鼠血液(100 μL/ 只)，分離血清，采用微量試管凝集試驗(yàn)(MSAT)測(cè)定小鼠血清抗體效價(jià)(血清初始稀釋度為 1∶2)。

1.7 不同免疫途徑對(duì)小鼠免疫效力的測(cè)定 小鼠免疫后90 d (攻毒后45 d)，迫殺各組小鼠，無(wú)菌采集其脾臟，放入滅菌帶有鋼珠的離心管中，加入1 mL蛋白胨水，置高通量組織研磨儀中振蕩10 min，取漿液梯度稀釋成 100 倍和 10 000 倍。將原倍、100倍、10 000 倍稀釋液各取 300 μL 分別涂布 3 個(gè)布魯氏菌選擇性培養(yǎng)皿，37 ℃培養(yǎng)72 h，根據(jù)生長(zhǎng)菌落數(shù)計(jì)算小鼠的脾載菌量，參照OIE 保護(hù)率計(jì)算方法[11]計(jì)算疫苗的單位保護(hù)UP (UP= 對(duì)照出菌指數(shù)- 免疫出菌指數(shù))，比較不同途徑的免疫效力。

2 結(jié) 果

2.1 溫敏凝膠疫苗的制備 對(duì)30 只小鼠的口腔、眼部、陰道、直腸部位測(cè)定溫度后統(tǒng)計(jì)結(jié)果，見(jiàn)表1。根據(jù)小鼠免疫部位的溫度，溫敏凝膠相變溫度選定范圍為34 ℃～36 ℃。

表1 小鼠免疫部位溫度測(cè)定結(jié)果Table 1 The temperature of the immune site

根據(jù)該溫度范圍確定凝膠疫苗的配方，并測(cè)定4 個(gè)凝膠配方的相轉(zhuǎn)變溫度，計(jì)算偏差并進(jìn)行分析，各配方的T 偏差的絕對(duì)值均小于5 % (表2)。

表2 凝膠疫苗4個(gè)配方的相轉(zhuǎn)變溫度Table 2 Optimization results of selected formulations

測(cè)定了4個(gè)疫苗配方形成凝膠過(guò)程的固液平衡點(diǎn) (Solid～liquid balance, SLB)、宏 觀粘度分子(Macroscopic viscosity index, MVI)、和流動(dòng)因子(Fluidity index, FI)這3個(gè)主要相變 因子(圖1)。結(jié)果顯示，3 號(hào)配方形成凝膠時(shí)間最短，為最優(yōu)配方，根據(jù)此結(jié)果制備溫敏凝膠疫苗。

2.2 小鼠免疫部位排菌量測(cè)定 各種黏膜途徑免疫小鼠后分別檢測(cè)各組排菌量及排菌時(shí)間，結(jié)果顯示，從疫苗劑型分析，凝膠劑型疫苗在第2 d 基本停止排菌，而作為對(duì)照的常規(guī)疫苗排菌持續(xù)了4 d；從同時(shí)間的排菌量相比，凝膠劑型疫苗只有常規(guī)劑型疫苗的0～30 %。從免疫部位分析，陰道灌注(B組)小鼠排菌量最低(低于100 cfu)，且排菌時(shí)間最短(1 d 以內(nèi))，眼部滴注(A組)與直腸灌注(D組)次之，而口服(C組)小鼠排菌量明顯大，排菌時(shí)間明顯長(zhǎng)(圖2)。結(jié)果表明凝膠劑型疫苗相比較常規(guī)疫苗在免疫后能夠在一定程度上限制免疫部位的排菌，且陰道粘膜免疫途徑排菌量最低。

2.3 小鼠抗體消長(zhǎng)規(guī)律測(cè)定 各組小鼠免疫后采用MSAT 檢測(cè)其抗體水平，結(jié)果顯示，注射免疫后的抗體滴度顯著高于黏膜免疫，并且持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，提示注射對(duì)體液免疫的刺激顯著高于黏膜免疫。在4 種黏膜免疫途徑中，點(diǎn)眼和口服免疫后的小鼠抗體水平最低(最高1∶50)，直腸和陰道灌注免疫后的小鼠抗體最高水平顯著高于點(diǎn)眼和口服，但在免疫后45 d 左右就降至1∶50?？贵w消長(zhǎng)規(guī)律結(jié)果顯示，各途徑免疫小鼠后抗體水平均在免疫后20 d 左右達(dá)到峰值，4 種黏膜免疫小鼠的抗體水平均在45 d 左右低于或接近1∶50，而此時(shí)注射免疫后的抗體仍顯著高于1∶50。在攻毒后，所有黏膜途徑免疫小鼠抗體水平均顯著提高，并且在攻毒后20 d 左右到達(dá)峰值，之后快速下降，而注射免疫小鼠則受攻毒影響較小，抗體呈現(xiàn)20 d 左右的維持狀態(tài)，之后緩慢下降(圖3)。表明黏膜免疫后抗體持續(xù)時(shí)間短，有利于鑒別診斷。

圖1 4個(gè)疫苗配方形成凝膠過(guò)程的固液平衡點(diǎn)(A)，宏觀粘度分子(B)流動(dòng)因子(C)曲線圖Fig.1 The SLB(A), MVI(B) and FI(C) curve of four recipes

圖2 不同免疫方式的小鼠免疫部位排菌情況Fig.2 The status of bacterial shedding in different immune modes

圖3 布魯氏菌病活疫苗(S2 株)黏膜和注射免疫后小鼠抗體滴度變化Fig.3 Changes of antibody titers in mice immunized with brucellosis vaccine (S2 strain) via mucosal and injection vaccination

2.4 不同黏膜免疫及注射免疫對(duì)小鼠的保護(hù)指數(shù)比較 小鼠免疫后攻毒，采集脾臟檢測(cè)各組小鼠出菌指數(shù)，結(jié)果顯示，在對(duì)照組小鼠脾臟均分離到攻毒菌并且出菌指數(shù)為6.47 的前提下，各免疫組的單位保護(hù)從高至低分別為：注射免疫 4.08、陰道免疫3.89、點(diǎn)眼免疫 3.41、口服免疫 3.32 和直腸免疫3.25 (表3)，陰道免疫組和點(diǎn)眼免疫組的單位保護(hù)與注射免疫組的單位保護(hù)接近。表明黏膜免疫對(duì)小鼠具有較好的免疫保護(hù)。

表3 不同黏膜免疫及注射免疫對(duì)小鼠的保護(hù)率比較Table 3 Comparison of protection rates of the mice immunized via mucosal administration and injection vaccination

3 討 論

布魯氏菌病疫苗通過(guò)黏膜免疫可以降低免疫抗體的反應(yīng)強(qiáng)度，并減少反應(yīng)時(shí)間，有利于疫病監(jiān)測(cè)等防控技術(shù)的實(shí)施[12-13]，但免疫時(shí)因動(dòng)物咳嗽、打噴嚏、流唾液等導(dǎo)致疫苗菌向體外擴(kuò)散帶來(lái)的安全性問(wèn)題。本研究采用溫敏凝膠搭載布魯氏菌病疫苗，將疫苗菌固定于免疫的黏膜部位，限制了其向環(huán)境中釋放，提高了黏膜免疫的安全性。不同時(shí)間檢測(cè)免疫部位的周邊體表排菌情況表明，相比常規(guī)用生理鹽水稀釋的疫苗，凝膠疫苗在黏膜免疫部位的體外排菌明顯減少。從凝膠疫苗的特性推測(cè)，其對(duì)氣溶膠形式的排菌也會(huì)有明顯抑制作用，但這需要可檢測(cè)到全部排菌量的裝置才能進(jìn)行進(jìn)一步研究。本研究顯示，陰道免疫是4 種黏膜免疫途徑中排菌量最少的，并且在免疫操作時(shí)將疫苗注入體腔內(nèi)，避免了免疫時(shí)的疫苗暴露，是4 種黏膜免疫中能減少疫苗流失和提高相應(yīng)安全性的最佳途徑，與已有報(bào)道一致[14-15]，結(jié)合凝膠的相對(duì)定位作用，推斷其效果應(yīng)該會(huì)更好。由于陰道黏膜免疫只適用于母畜，因此本研究對(duì)直腸免疫途徑進(jìn)行了初步探究，排菌檢測(cè)顯示其安全性高于口服，其血清學(xué)反應(yīng)與陰道免疫相近，免疫效果與口服相近，但直腸免疫涉及動(dòng)物排便等不可控因素，因此對(duì)其實(shí)用性需深入評(píng)價(jià)。

本研究還比較了不同黏膜免疫及注射免疫方式的抗體消長(zhǎng)規(guī)律及免疫保護(hù)效果，結(jié)果顯示黏膜免疫產(chǎn)生的抗體水平低、持續(xù)時(shí)間短。4 種黏膜免疫均顯示了良好的保護(hù)作用，其中，陰道灌注和點(diǎn)眼的免疫保護(hù)效果接近傳統(tǒng)的注射免疫，進(jìn)一步證實(shí)了黏膜免疫可以作為布魯氏菌病疫苗免疫的有效途徑，同時(shí)也提供一種有利于鑒別免疫與自然感染，以及布魯氏菌病疫情監(jiān)測(cè)的免疫方式。