Wnt5a對缺氧復(fù)氧導(dǎo)致的心肌細(xì)胞氧化損傷的影響

趙麗華，尹宏磊，呂風(fēng)華，張素榮，郭長磊，張培勇

心肌梗死是一種常見的心血管系統(tǒng)疾病，恢復(fù)冠狀動(dòng)脈（冠脈）血液流通是治療心肌梗死的直接途徑[1]?；謴?fù)冠脈血液流通后有時(shí)不僅不能夠恢復(fù)心臟功能，反而會(huì)加重心肌組織損傷，引起心力衰竭，稱為心肌缺血再灌注損傷[2,3]。當(dāng)血液恢復(fù)流通后，隨著血液流入的氧會(huì)引發(fā)氧化應(yīng)激，促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡[4]。Wnt參與細(xì)胞分化、增殖、凋亡等生物學(xué)過程，屬于胞外細(xì)胞因子家族，其包含經(jīng)典Wnt信號(hào)通路和非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路[5]。經(jīng)典Wnt信號(hào)通路參與心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生，而對于非經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路Wnt5a的研究較少[6]。近年來的研究表明，Wnt5a在心肌缺血再灌注心肌組織中表達(dá)上調(diào)[7]。本研究以缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞為研究對象，通過小干擾RNA技術(shù)干擾心肌細(xì)胞中Wnt5a的表達(dá)，探討Wnt5a對缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞氧化損傷的影響，以期為探討Wnt5a在心肌缺血再灌注發(fā)病機(jī)制中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞心肌細(xì)胞HCM購自于美國ATCC。

1.2 材料超氧化物歧化酶（SOD）含量檢測試劑盒購自于上海賢綿生物科技有限公司；活性氧（ROS）含量檢測試劑盒購自于南京建成生物工程研究所；丙二醛（MDA）含量檢測試劑盒購自于武漢默沙克生物科技有限公司；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量檢測試劑盒購自于美國Thermo；Wnt5a多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗均購自于美國abgent；Wnt5a小干擾RNA（Wnt5a siRNA）和小干擾RNA陰性對照（siRNA control）購自于美國origene；Wnt5a、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；Lipofectamine? 2000 轉(zhuǎn)染試劑購自于美國Invitrogen；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒均購自于碧云天生物技術(shù)研究所。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞HCM用含有10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，細(xì)胞傳代培養(yǎng)用0.25%的胰蛋白酶消化傳代，培養(yǎng)條件為：37℃，5% CO2培養(yǎng)箱。心肌細(xì)胞融合度達(dá)到60%時(shí)，用Lipofectamine? 2000 轉(zhuǎn)染試劑將Wnt5a siRNA和siRNA control轉(zhuǎn)染至HCM細(xì)胞中。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中所用細(xì)胞均為轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt5a siRNA和siRNA control后培養(yǎng)48 h的HCM細(xì)胞。

1.4 缺氧復(fù)氧模型構(gòu)建及實(shí)驗(yàn)分組缺氧復(fù)氧模型構(gòu)建：HCM細(xì)胞密度達(dá)到90%時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)液吸除后，加入不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，放在缺氧培養(yǎng)箱中，在缺氧培養(yǎng)箱中充入95% N2，放在37℃恒溫箱中缺氧培養(yǎng)5 h。將培養(yǎng)液換成含有10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，放在37℃，20%O2，5% CO2培養(yǎng)箱中復(fù)氧6 h。HCM細(xì)胞分為：正常組、模型組、siRNA control組、Wnt5a siRNA組。其中正常組細(xì)胞正常培養(yǎng)，模型組、siRNA control組、Wnt5a siRNA組細(xì)胞缺氧復(fù)氧處理，siRNA control組、Wnt5a siRNA組細(xì)胞分別用轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt5a siRNA和siRNA control后48 h的HCM細(xì)胞。

1.5 RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中Wnt5a水平正常組、模型組、siRNA control組、Wnt5a siRNA組細(xì)胞復(fù)氧后，用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞中的總RNA，紫外分光光度計(jì)法檢測RNA樣品濃度和純度（在A260/A280的比值為1.8～2.0為最佳）。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，步驟參照反轉(zhuǎn)錄合成試劑盒。RT-PCR檢測Wnt5a的表達(dá)水平，內(nèi)參基因?yàn)镚APDH，以Ct法計(jì)算Wnt5a表達(dá)水平。反應(yīng)條件為：95℃，10 min；95℃ 15s；60℃ 1 min；95℃15 s；55℃ 1 min，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。Wnt5a上游引物為5，-CGGAGATTGTGGATCAGTTC-3’，下游引物5，-GGTTCCAGCTGCAATTCTTG-3’。GAPDH上游引物為5，-AGGGCTGCCTTCTCTTGT GA-3’，下游引物5，-AACTTGCCGTGGGTAGA GTCA-3’。

1.6 Westernblot檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中Wnt5a水平正常組、模型組、siRNA control組、Wnt5a siRNA組細(xì)胞復(fù)氧后，收集各組細(xì)胞，加入裂解液，放置于冰上裂解反應(yīng)20 min，收集細(xì)胞裂解液，14 000 rpm，4℃離心15 min，將蛋白上清液吸取至EP管中，用BCA法對提取蛋白進(jìn)行定量檢測，步驟參照BCA蛋白定量檢測試劑盒。將蛋白樣品與等體積的2×Loading buffer混合后，在100℃煮沸5 min，使蛋白變性。凝膠電泳：5%濃縮膠，10%分離膠，每孔上樣30 μg，90 V恒壓電泳。轉(zhuǎn)膜：120 V，4℃轉(zhuǎn)膜70 min。封閉：5%牛血清白蛋白，室溫，封閉90 min。結(jié)合一抗：1：1000稀釋，4℃孵反應(yīng)過夜。結(jié)合二抗：1：2000倍稀釋，室溫孵育90 min。顯色后，以GAPDH為內(nèi)參，用Photoshop CS3分析目的蛋白表達(dá)水平。

1.7 MTT檢測細(xì)胞增殖活力HCM細(xì)胞以1×106個(gè)細(xì)胞/ml接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，按照正常組、模型組、siRNA control組、Wnt5a siRNA組分組處理各組細(xì)胞，以不加入細(xì)胞的孔為空白組用于調(diào)零，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。復(fù)氧結(jié)束后，在每孔中加入20 μl的5 mg/ml的MTT，在37℃反應(yīng)4 h后，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜溶液150 μl，反應(yīng)10 min，用酶標(biāo)儀檢測492 nm每孔的光密度值（optical density，OD值），計(jì)算分析細(xì)胞存活率。以正常組為對照，分別以模型組、siRNA control組、Wnt5a siRNA組為實(shí)驗(yàn)組。細(xì)胞存活率=100%×（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）÷（對照組OD值-空白組OD值）

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡正常組、模型組、siRNA control組、Wnt5a siRNA組細(xì)胞復(fù)氧結(jié)束后，收集各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升含有106個(gè)細(xì)胞，加入冰預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸洗滌細(xì)胞2次后，1000 rpm離心10 min，在細(xì)胞中加入100 μl的結(jié)合緩沖液，混勻后，依次加入5 μl的膜聯(lián)蛋白 V-FITC（Annexin V-FITC）和碘化丙啶（PI）5 μl，放在避光條件下室溫結(jié)合15 min，加入400 μl的結(jié)合緩沖液，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.9 MDA、SOD、LDH水平檢測正常組、模型組、siRNA control組、Wnt5a siRNA組細(xì)胞復(fù)氧結(jié)束后，收集各組細(xì)胞和培養(yǎng)液上清。用二硝基苯肼顯色法檢測培養(yǎng)液上清中LDH水平。用黃嘌呤氧化法檢測細(xì)胞中SOD水平。硫代巴比妥酸比色法檢測細(xì)胞中MDA水平。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)，以P＜0.05作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中Wnt5a表達(dá)檢測結(jié)果正常組、模型組、siRNA control組、Wnt5a siRNA組Wnt5a mRNA水平依次為：0.26±0.04、1.34±0.12、1.32±0.13、0.51±0.08，蛋白水平依次為：0.11±0.02、1.05±0.06、1.06±0.07、0.18±0.04。模型組Wnt5a mRNA和蛋白水平均明顯高于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。siRNA control組Wnt5a mRNA和蛋白水平與模型組相比差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Wnt5a siRNA組Wnt5a mRNA和蛋白水平均明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖1，表1）。缺氧復(fù)氧后心肌細(xì)胞中Wnt5a表達(dá)升高，而Wnt5a siRNA能降低缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞中Wnt5a的表達(dá)。

2.2 細(xì)胞增殖活力檢測結(jié)果正常組、模型組、siRNA control組、Wnt5a siRNA組細(xì)胞存活率依次為：（100.00±8.36）%、（62.58±7.25）%、（63.47±6.32）%、（86.32±7.94）%。模型組細(xì)胞存活率明顯低于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。siRNA control組細(xì)胞存活率與模型組相比差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Wnt5a siRNA組細(xì)胞存活率明顯高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表2）。缺氧復(fù)氧能夠抑制心肌細(xì)胞增殖活力，而干擾Wnt5a表達(dá)能夠拮抗缺氧復(fù)氧對心肌細(xì)胞增殖抑制作用。

2.3 細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果正常組、模型組、siRNA control組、Wnt5a siRNA組細(xì)胞凋亡率依次為：（4.02±0.85）%、（26.47±1.56）%、（25.39±1.68）%、（14.58±1.02）%。模型組細(xì)胞凋亡率明顯高于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。siRNA control組細(xì)胞凋亡率與模型組相比差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Wnt5a siRNA組細(xì)胞凋亡率明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖2，表3）。缺氧復(fù)氧能夠誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，干擾Wnt5a表達(dá)后能夠抑制缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。

圖1 Western blot檢測細(xì)胞中Wnt5a表達(dá)水平

表2 細(xì)胞存活率

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

表3 細(xì)胞凋亡率

2.4 MDA、SOD、LDH水平檢測結(jié)果正常組、模型組、siRNA control組、Wnt5a siRNA組MDA水平依次為：（0.96±0.13）nmol/mg、（2.85±0.36）nmol/mg、（2.87±0.25）nmol/mg、（1.92±0.14）nmol/mg，SOD水平依次為：（168.95±11.64）U/mg、（104.46±13.26）U/mg、（103.82±12.87）U/mg、（127.74±10.91）U/mg，LDH水平依次為：（21.85±1.94）U/L、（93.26±7.65）U/L、（94.69±8.97）U/L、（56.33±2.57）U/L。模型組細(xì)胞中MDA和培養(yǎng)液上清中LDH水平均明顯高于正常組，而細(xì)胞中SOD水平明顯低于正常組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。siRNA control組細(xì)胞中MDA、SOD水平及培養(yǎng)液上清中LDH水平與模型組相比差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Wnt5a siRNA組細(xì)胞中MDA和培養(yǎng)液上清中LDH水平均明顯低于模型組，而細(xì)胞中SOD水平明顯高于模型組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表4）。缺氧復(fù)氧能導(dǎo)致心肌細(xì)胞氧化損傷，干擾Wnt5a表達(dá)能夠減弱缺氧復(fù)氧對心肌細(xì)胞的氧化損傷。

表4 MDA、SOD、LDH水平

3 討論

Wnt是一個(gè)高度保守的由富含半胱氨酸的糖蛋白組成的胞外信號(hào)系統(tǒng)，參與胚胎發(fā)育，與細(xì)胞的生長、凋亡等有關(guān)[8]。研究表明，Wnt與人體神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤發(fā)生、心肌肥厚、糖尿病心肌病、心肌梗死等有關(guān)，Wnt5a是非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，參與心肌缺血發(fā)生過程，在心肌缺血再灌注中表達(dá)上調(diào)[9-12]。有研究表明，Wnt5a能夠增加斑馬魚胚胎細(xì)胞中鈣離子的濃度，增加Wnt5a細(xì)胞表面受體表達(dá)后的斑馬魚細(xì)胞釋放的鈣離子增加[13]。而心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生與鈣超載有關(guān)，而鈣超載后會(huì)破壞細(xì)胞氧化平衡狀態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[14]。周珊珊[15]的研究表明，Wnt5a表達(dá)下調(diào)后，缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞中鈣離子濃度降低。這些研究均說明，Wnt5a參與缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞損傷過程。本研究結(jié)果顯示，缺氧復(fù)氧后的心肌細(xì)胞中Wnt5a mRNA和蛋白水平表達(dá)升高，這與之前的研究報(bào)道相符合，均說明Wnt5a可能參與心肌缺血再灌注損傷發(fā)生。

心肌細(xì)胞凋亡是心肌缺血再灌注損傷的重要組成部分。有研究表明，大鼠心肌缺血45 min后再灌注2 h，心肌細(xì)胞凋亡率升高約20倍[16]。本研究結(jié)果顯示，缺氧復(fù)氧后的心肌細(xì)胞增殖活力明顯下降，細(xì)胞凋亡率明顯升高，而Wnt5a表達(dá)下調(diào)后的心肌細(xì)胞經(jīng)過缺氧復(fù)氧處理后細(xì)胞凋亡率較單純?nèi)毖鯊?fù)氧處理的心肌細(xì)胞凋亡率有所減少。

正常情況下，細(xì)胞內(nèi)氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)能夠維持機(jī)體正常的氧化平衡狀態(tài)。當(dāng)組織細(xì)胞中氧自由基不能及時(shí)清除，導(dǎo)致氧自由基在組織內(nèi)聚集，引起脂質(zhì)過氧化，損壞細(xì)胞膜通透性，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡發(fā)生[17,18]。LDH是存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的一種糖酵解酶，當(dāng)細(xì)胞通透性發(fā)生改變時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的LDH泄露，而MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物之一，檢測細(xì)胞培養(yǎng)液上清中LDH水平和細(xì)胞中MDA水平可以間接反映細(xì)胞膜的完整性和細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷程度[19]。SOD是細(xì)胞內(nèi)氧自由基的清除劑，能夠?qū)⒀踝杂苫呋蛇^氧化氫[20]。本研究結(jié)果顯示，缺氧復(fù)氧后的心肌細(xì)胞中MDA水平升高，細(xì)胞中SOD水平下降，培養(yǎng)液上清中LDH水平升高，而Wnt5a表達(dá)下調(diào)能夠抑制缺氧復(fù)氧對心肌細(xì)胞的這一作用。這提示，Wnt5a表達(dá)下調(diào)能夠降低缺氧復(fù)氧對心肌細(xì)胞的氧化損傷。

綜上所述，缺氧復(fù)氧能夠誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化損傷，促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，而干擾Wnt5a表達(dá)能夠減輕缺氧復(fù)氧引起的心肌細(xì)胞氧化損傷，減少心肌細(xì)胞凋亡。本研究進(jìn)一步探討Wnt5a在心肌缺血再灌注損傷發(fā)病機(jī)制中的作用奠定了基礎(chǔ)。本研究存在一定的局限性，只在體外初步探討了Wnt5a在心肌缺血再灌注損傷中的作用，后續(xù)試驗(yàn)中會(huì)在體內(nèi)進(jìn)一步探討Wnt5a在心肌缺血再灌注損傷中的作用，并會(huì)對Wnt5a的具體作用就機(jī)制進(jìn)行深入研究。