吳茱萸堿對人胃癌BGC-823細胞增殖的影響及分子機制研究

張涵妮，祝文浩，王慧茹，郭云良，葛科立*，王亞男*

(1.青島大學 醫(yī)學部 中西醫(yī)結合中心，山東 青島 266000；2. 中國科學技術大學附屬第一醫(yī)院輸血科，安徽 合肥 230000)

胃癌(Gastric Cancer)是臨床常見消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其全球發(fā)病率居惡性腫瘤第5位，而死亡率居惡性腫瘤第3位[1]。在中國，2015年胃癌的發(fā)病率為15.8%，死亡率為17.6%，在所有癌癥中排名第2位[2]。目前，胃癌的現代治療以手術結合放、化療及靶向治療為主，存在治療不徹底、毒副作用顯著、復發(fā)甚至轉移等問題[3]，尋找更為安全有效的療法是亟待解決的難題。

中醫(yī)藥在胃癌防治方面具有減毒增敏、穩(wěn)定瘤體、提高中遠生存期等優(yōu)勢[4]。吳茱萸是中醫(yī)治療脾胃病的常用中藥，具有散寒止痛、降逆止嘔、助陽止瀉的功效，其主要成分為吳茱萸堿(Evodiamine,EVO)，具有抗腫瘤、抗炎、免疫調節(jié)等藥理活性[5]。研究表明，吳茱萸堿對胃癌SGC7901細胞、肝癌Huh7細胞等具有增殖抑制和促進細胞凋亡作用[6-7]，但其具體的抗腫瘤分子機制仍不明確。本實驗以人胃癌BGC-823細胞作為研究對象，探討吳茱萸堿對BGC-823細胞增殖的影響及相關分子機制，現報道如下。

1 材料與儀器

1.1 人胃癌細胞及吳茱萸堿

人胃癌BGC-823細胞株購自國家細胞資源中心，由本實驗室冷凍保存。吳茱萸堿(EVO)購自北京生物制品研究所，批號：0802-9702，溶解于含0.1% DMSO的PBS溶液配制成質量濃度為50 μM，-20 ℃避光貯存，使用時用培養(yǎng)基稀釋。

1.2 實驗試劑與器材

DME/F-12培養(yǎng)基(HyClone)；胎牛血清(FBS)(BI)；PBS(HyClone)；0.25%胰蛋白酶(Gbico)；二甲基亞砜(DMSO)(Solarbio)；CCK-8試劑盒(日本同仁化學)；PI試劑盒(beyotime)；AnnexinV/APC+7AAD細胞凋亡試劑盒(Biolegend)；一抗：Cdc25c Rabbit、Caspase-3 Rabbit、Caspase-8 Mouse、Caspase-9 Rabbit 、PARP-1 Rabbit、GAPDH(CST)和p53(Proteintech)；二抗：山羊抗兔、山羊抗小鼠(中杉金橋)；Multiskan FC型酶標儀，Heracell 150i CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；高速低溫離心機(美國Beckman公司)；Primovert倒置相差顯微鏡(德國Zeiss公司)；FACS CantoTM流式細胞儀(美國BD公司)；電泳/轉膜儀、凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-rad 公司)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

BGC-823細胞用含有10%胎牛血清的DME/F-12培養(yǎng)基，于37 ℃，5% CO2條件下的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2.2 CCK-8法檢測BGC-823細胞增殖

取對數生長期的BGC-823細胞，經0.25%胰酶-EDTA消化，制成單細胞懸液，以每孔2×103個接種于96孔板?？瞻捉M為含10%胎牛血清的DME/F-12培養(yǎng)基，但沒有細胞。對照組加DME/F-12培養(yǎng)基，不加藥。實驗組的吳茱萸堿(EVO)終濃度分別為1 μM、2.5 μM、5 μM、7.5 μM、10 μM，每組5個復孔，分為24 h、48 h、72 h 3個時間觀測點。依照CCK-8試劑盒步驟檢測各觀測點每組細胞的抑制率，細胞增殖抑制率=(細胞對照組A450-實驗組A450/細胞對照組A450-空白組A450)×100%。

2.3 細胞形態(tài)學觀察

取對數生長期細胞，胰蛋白酶消化后，調整細胞濃度為3×105個/mL，以每孔2 mL細胞懸液接種于6孔板，分對照組和EVO干預組，每組3復孔。待細胞貼壁后，棄舊培養(yǎng)液，實驗組加入10 μM EVO培養(yǎng)液2 mL，置于培養(yǎng)箱中，于24 h后鏡下觀察細胞形態(tài)學變化。

2.4 流式細胞術檢測EVO對BGC-823細胞周期、細胞凋亡的影響

將10 μM EVO干預組和對照組的細胞經胰酶消化，離心、棄上清，加入70%預冷乙醇于4 ℃下培養(yǎng)過夜。細胞周期：PBS洗滌，離心，加入RNase(10 μg/mL)，孵育15 min，加入10 μg/mL碘化丙啶(PI)，避光30 min。流式細胞儀檢測細胞周期，并繪制相應細胞周期曲線-直方圖。細胞凋亡：PBS洗滌，以(2.5～10)×106個/mL細胞濃度重懸于Annexin V Binding Buffer，每組取100 μL細胞懸液加入5 μL Annexin V及5 μL 7AAD，室溫避光孵育15min，每管加入400 μL Annexin V Binding Buffer，上機檢測細胞凋亡，BD軟件分析凋亡結果，繪制統(tǒng)計圖表。

2.5 Western-blot檢測細胞凋亡與細胞周期相關蛋白表達

提取各組樣品蛋白10 mg，用10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，濕轉膜。將PVDF膜浸入5%BSA封閉液，室溫封閉1 h，然后放入一抗(使用上述各蛋白抗體，1∶1 000)4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，用TBST配制羊抗兔二抗稀釋液(1∶2 000)室溫搖床孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次。最后加100 mL顯影液混勻，UVP凝膠成像分析系統(tǒng)(Biospectrum 810 Imaging System, USA)曝光顯影。

2.6 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 EVO對胃癌BGC-823細胞的增殖抑制作用

CCK-8法檢測結果顯示，與對照組相比，不同濃度(1、2.5、5、7.5、10 μM)的EVO作用于BGC-823細胞24、48、72 h后，能明顯抑制胃癌細胞的增殖，隨著EVO濃度的增加，細胞增殖活性呈顯著下降趨勢(P<0.01)，呈時間和劑量依賴效應，且以10 μM EVO對細胞增殖的抑制作用最為明顯(P<0.001)，見圖1。經Graph-Pad Prism 7.0軟件擬合計算24 h的IC50為9.73 μM，因此后續(xù)實驗采用10 μM為工作濃度。以上實驗結果表明，EVO呈時間-劑量依賴性抑制BGC-823細胞的增殖活力。

圖1 不同濃度及不同作用時間EVO對胃癌BGC-823細胞增殖的作用

3.2 EVO處理后細胞形態(tài)學變化

鏡下觀察發(fā)現：與對照組細胞生長狀態(tài)相比，EVO組可見懸浮細胞增多，細胞貼壁性差，并且細胞胞體縮小、變圓、皺縮，彼此分開未形成集落，細胞內出現少量顆粒樣物質，培養(yǎng)液中有較多的細胞碎片，細胞活力顯著降低。見圖2。

圖2 10 μM EVO作用24 h后BGC-823細胞形態(tài)的變化(比例尺：100 μm)

3.3 EVO對胃癌BGC-823細胞周期的影響

采用PI單染流式細胞術檢測EVO作用于胃癌細胞24 h后對細胞周期的影響。結果表明，與對照組相比，EVO組G0/G1期細胞比率由42.70%下降至8.36%，而G2/M期細胞比率則由22.50%增長至54.90%(P<0.001)，見圖3、表1。由此可見，EVO能誘導細胞周期阻滯于G2/M期。

圖3 10 μM EVO作用24 h后對BGC-823細胞周期的影響

組別G0/G1期S期G2/M期 對照組42.62±0.28???17.65±3.1123.37±1.03 EVO處理組8.57±0.4019.30±4.3454.13±1.34???t10.6812.12111.552P0.00030.1010.0002

注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

3.4 EVO對胃癌BGC-823細胞凋亡的影響

采用Annexin V/APC+7AAD雙染流式細胞術檢測胃癌BGC-823細胞經10 μM EVO 處理24 h后對細胞凋亡的影響。結果表明，與對照組細胞凋亡率相比， EVO組細胞凋亡率顯著增長，細胞總凋亡率為(16.50±0.62)%，且以早期凋亡為主(P<0.001)，見圖4、表2。表明EVO可誘導BGC-823細胞凋亡。

圖4 10 μM EVO作用24 h后對胃癌BGC-823細胞凋亡的影響

組別早期凋亡率中晚期凋亡率總細胞凋亡率細胞死亡率對照組EVO處理組2.23±0.507.53±0.71??7.77±0.318.97±0.60?10.00±0.5316.50±0.62???4.37±0.454.63±0.11t-5.209-2.941-10.4230.378P0.0060.0420.00010.725

注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

3.5 Western-blot檢測EVO對BGC-823細胞凋亡相關蛋白和細胞周期相關蛋白表達的影響

根據EVO作用于BGC-823細胞周期阻滯實驗和細胞凋亡實驗的結果分析，筆者發(fā)現EVO抑制胃癌細胞增殖的機制可能是EVO將癌細胞周期阻滯于G2/M期，并誘導細胞凋亡，特別是早期凋亡而抑制胃癌細胞增殖?；诖?，筆者采用Western-blot檢測相關蛋白在10 μM EVO作用于BGC-823細胞不同時間段(0、3、6、9、12、24 h)后的表達情況，結果表明Cdc25C蛋白水平呈下降趨勢，而p53、cleaved caspase-3、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9和cleaved PARP-1蛋白水平呈上升趨勢，見圖5。由此可見，EVO可能通過上調p53、cleaved caspase-3、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9和cleaved PARP-1蛋白水平誘導細胞凋亡，并呈時間依賴性。

4 討論

胃癌作為我國消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病機制尚未闡明，臨床治療也面臨諸多挑戰(zhàn)?，F今，中醫(yī)藥在腫瘤中的應用越來越廣泛。其中，從蕓香科植物吳茱萸、石虎或疏毛吳茱萸的干燥成熟果實中提取的EVO已在乳腺癌[8]、結腸癌[9]、肺癌[10]和骨肉瘤[11]等多種腫瘤的治療中顯現出良好的抗癌活性。然而，EVO對胃癌細胞相關分子作用機制的研究尚需完善。

本實驗結果顯示，不同劑量的EVO處理人胃癌BGC-823細胞株24 h、48 h、72 h后，CCK-8法檢測顯示其能顯著抑制BGC-823細胞增殖(P<0.01)，并呈時間-劑量依賴性。細胞周期運轉異常是腫瘤細胞惡性增殖的核心環(huán)節(jié)，研究表明，細胞的增殖、分化、衰老和凋亡均呈細胞周期依賴性[12]，因此，調控細胞周期的進程是阻止腫瘤細胞異常增殖的有效途徑之一。Yang Fan等[13]發(fā)現EVO能顯著抑制肝癌HepG2細胞增殖，將細胞阻滯于G2/M期，最終誘導細胞凋亡。也有學者[14]研究表明低劑量EVO可將纖維肉瘤L929細胞周期阻滯于G2/M期，而高劑量則引起G0/G1期阻滯。本實驗使用流式細胞術分析顯示，10 μM EVO作用于BGC-823細胞24 h后，G2/M期細胞比率增長至54.90%(P<0.001)，細胞凋亡率也顯著增長，且以早期凋亡為主(P<0.001)。由此可知，EVO抑制BGC-823細胞增殖亦與其誘導細胞周期G2/M期阻滯和增加細胞凋亡率有關。

真核細胞順利通過G1/S期檢查點后，周期蛋白CyclinB1開始累積并與Cdc2(CDK1)形成復合物推動細胞進入M期[15]，其中周期蛋白Cdc25C參與Cdc2的活化至關重要，其表達下調能抑制Cdc2/CyclinB1復合體的活化，阻滯細胞周期于G2/M期[16]。同時，Cdc25C的表達受細胞周期抑制蛋白p53的調控，p53能與Cdc25C啟動子結合抑制其轉錄，維持細胞周期平穩(wěn)運行[17]。Chien等[18]使用不同濃度的EVO干預人結腸癌COLO205、HT-29細胞，發(fā)現其能通過抑制JNK信號的活化下調細胞周期蛋白Cdc25C表達，阻滯細胞周期于G2/M期。也有研究[19]表明二烯丙基二硫化物(DADS)能通過激活p53/p21信號通路下調細胞周期蛋白CyclinB1、Cdc2、p-Cdc2和Cdc25C的表達，誘導食管鱗狀癌ECA109細胞阻滯于G2/M期。與之相似，本實驗研究也表明EVO作用于BGC-823細胞24 h后，p53蛋白表達上調，Cdc25C蛋白表達下調。

細胞凋亡是細胞受基因調控的自主性、程序性死亡過程，其中caspase家族蛋白和p53蛋白等在其信號調控中扮演重要角色[20-21]。研究表明，線粒體膜電位變化、死亡受體途徑激活等均能引起caspases信號級聯活化，通過相互激活又可自我激活模式使效應放大，導致細胞凋亡[22]。caspase-3作為執(zhí)行凋亡最主要的效應因子，通過剪切死亡底物PARP-1，誘導細胞凋亡[23]。Fu Z等[24]采用大戟提取物通過caspases信號級聯的激活，促使細胞凋亡，抑制了胃癌細胞增殖。用異黃酮類物質作用于胃癌細胞后，啟動TRAIL-FADD-caspases-8凋亡途徑，增加caspases-3和PARP-1的剪切，誘導細胞凋亡[25]。而本實驗結果也發(fā)現EVO作用于BGC-823細胞后，上調了cleaved caspase-3、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9和cleaved PARP-1的表達，誘導了細胞凋亡。

圖5 10 μM EVO作用0、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h后對胃癌BGC-823細胞凋亡相關蛋白和細胞周期相關蛋白表達的影響

綜上所述，EVO可能通過上調p53表達和下調Cdc25C表達誘導胃癌細胞G2/M期阻滯，并誘導胃癌細胞凋亡，其作用機制可能與上調cleaved caspase-3、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9和cleaved PARP-1表達相關，這也是EVO應用于胃癌治療的新的潛在機制，為后續(xù)研究提供了參考。